技術領域

本發明涉及生物醫學工程領域，具體為一種耐酸耐磨防齲的牙本質脫敏材料及其制備方法。

背景技術：

作為成年人最常見的口腔疾病之一，牙本質敏感主要來源于釉質喪失和/或牙齦退縮所導致的牙本質小管暴露，從而引起短暫的、尖銳的疼痛。根據經典的流體動力學理論(Brannstrom M. J Am Dent Assoc, 1963;66:366–370.)，牙本質小管的有效封閉被認為是減少小管內液體流動進而緩解敏感癥狀的可靠手段。經過數十年的發展，通過草酸鹽、氟化物、粘接劑、激光處理等封閉牙本質小管治療牙本質敏感已取得滿意的效果。然而在復雜的口腔環境中，被封閉的小管常常難以抵抗諸如日常飲食中的酸侵蝕和機械磨刷(Wang Z, et al. J Dent, 2010;38(5):400–410; Sehmi H, et al. J Dent, 2015;43(12):1442–41447.)等多變條件，會再次敞開導致敏感癥狀的復發。

由于牙本質中主要成分是磷酸鈣，因此利用成分類似的礦物化合物如羥基磷灰石來進行小管封閉將更加合理。納米羥基磷灰石有加速鈣磷沉積促進再礦化的能力，已被用在封閉小管治療牙本質敏感(Besinis A, et al. Dent Mater, 2014;30(3):249–262; Wang R, et al. J Biomater Appl, 2014;29(2):268–277.)，但酸性環境會導致其溶解(Lee HS, et al. J Colloid Interface Sci, 2012;385(1):235–243.)。由于結構穩定、比表面積大、熱化學性能穩定，近年來介孔硅作為理想的載體在生物醫學領域廣泛應用(Li X, et al. Int J Nanomedicine, 2016;11:2471–2480.)，在封閉牙本質小管治療敏感中同樣發揮了重要作用(Chiang YC, et al. ACS Nano, 2014;8(12):12502–12513.)。鑒于此，設計一種納米羥基磷灰石負載的介孔硅將具有巨大優勢，一方面可以保護羥基磷灰石不被酸溶解從而獲得更好的再礦化效果，另一方面通過介孔硅獨特的抗酸抗磨性能將會作為對抗酸侵蝕和機械磨刷的有力武器。

因為小管的存在和有機成分較高，暴露的牙本質通常更易患齲且進展很快(Takahashi N, et al. Caries Res, 2016;50(4):422–431.)。盡管目前的脫敏材料可以切斷致齲菌進入小管的通道，但致齲菌代謝所形成的局部酸性微環境會潛在影響脫敏材料的功能穩定性和長效性(Flemming HC, et al. Nat Rev Microbiol, 2010;8(9):623–633.)。因此兼顧抑制致齲菌生物膜形成的脫敏材料將更具潛力。

現階段的牙本質脫敏防齲材料主要是將抗菌成分如三氯生、氯已定、氟化亞錫等摻雜在脫敏劑中用于抑制致齲菌生物膜的形成，但是，隨之產生的耐藥性、牙染色、狀態不穩定和細胞毒性等問題在一定程度上限制了其應用(Raut SA, et al. Environ Toxicol Chem, 2010;29(6):1287–1291; Miller S, et al. Int Dent J, 1994;44(1 Suppl 1):83–98; Shen Y, et al. Sci Rep, 2016;6:27537.)。近年來研究發現，綠茶提取物表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate, EGCG)具有較高的生物學活性和生物相容性，既能作為MMP抑制劑對抗膠原降解，又能有效抑制變形鏈球菌的生物膜形成(Du X, et al. J Dent, 2012;40(6):485–492.)，這些特點讓其可以作為一個安全、穩定、高效的防齲藥物用于抑制生物膜形成。

因此，根據納米羥基磷灰石、介孔硅、EGCG的特性和優勢，本發明設計和合成一種負載EGCG的納米羥基磷灰石/介孔硅多功能復合材料，即一種耐酸耐磨防齲的牙本質脫敏材料，一方面可以通過封閉牙本質小管治療牙本質敏感，另一方面可以通過抑制致齲菌生物膜形成預防齲病。但截至目前，有關此方面的研究未有報道。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種耐酸耐磨防齲的牙本質脫敏材料及其制備方法，該材料具有制備工藝簡便、結構穩定、粒徑均勻、分散性好、藥物負載率和釋放率高等特點。

本發明提供的技術方案是：一種耐酸耐磨防齲的牙本質脫敏材料，為負載EGCG的納米羥基磷灰石/介孔硅復合材料。

上述負載EGCG的納米羥基磷灰石/介孔硅復合材料，納米羥基磷灰石粒徑40-80 nm，介孔硅粒徑400-600 nm，納米羥基磷灰石均勻負載在介孔硅表面，EGCG的負載率和釋放率高。

上述負載EGCG的納米羥基磷灰石/介孔硅復合材料的制備方法，包括以下步驟：

(1) 室溫下，將四水硝酸鈣和磷酸氫二銨分別溶解于雙蒸水中，超聲分散，置于磁力攪拌器上攪拌，分別得到溶液Ⅰ和溶液Ⅱ；

(2) 將干燥介孔硅粉末加于雙蒸水中，超聲分散，得分散液Ⅲ，隨后置于磁力攪拌器上，將溶液Ⅰ滴加入分散液Ⅲ，調節并保持pH值在10–10.5之間，攪拌12小時，得混合液Ⅳ；

(3)將溶液Ⅱ滴加入混合液Ⅳ，調節并保持pH值在10–10.5之間，攪拌30小時，得混合液Ⅴ；

(4) 經過24小時陳化后，將混合液Ⅴ離心，雙蒸水和無水乙醇清洗，過濾，干燥，煅燒，得到納米羥基磷灰石/介孔硅復合材料；

(5) 避光下，將 EGCG粉末溶解于無水乙醇中，超聲分散，置于磁力攪拌器上攪拌，然后加入干燥的納米羥基磷灰石/介孔硅復合材料，室溫下攪拌，然后置于振蕩搖床上振蕩72小時；

(6) 離心，無水乙醇清洗，過濾，真空干燥，得到負載EGCG的納米羥基磷灰石/介孔硅復合材料。

結合實施例的具體參數的技術方案是：

(1) 室溫下，將0.944–3.776 g四水硝酸鈣和0.3168–1.2672 g磷酸氫二銨分別溶解于60 mL雙蒸水中，在功率400 W下超聲5分鐘，在攪拌速度200–400 rpm下置于磁力攪拌器上攪拌15分鐘，分別得到溶液Ⅰ和溶液Ⅱ；

(2) 將0.24–0.96 g干燥介孔硅粉末加于20–40 mL雙蒸水中，在功率400 W下超聲分散5分鐘，得分散液Ⅲ，隨后置于磁力攪拌器上，在攪拌速度200–400 rpm下將溶液Ⅰ緩慢滴加入分散液Ⅲ，調節并保持pH值在10–10.5之間，攪拌12小時，得混合液Ⅳ；

(3) 在攪拌速度200–400 rpm下將溶液Ⅱ緩慢滴加入混合液Ⅳ，調節并保持pH值在10–10.5之間，攪拌30小時，得混合液Ⅴ；

(4) 經過24小時陳化后，將混合液Ⅴ在6000–8000 rpm下離心15分鐘，雙蒸水和無水乙醇各清洗3次，過濾，80℃過夜干燥，550℃煅燒6小時，得到納米羥基磷灰石/介孔硅復合材料；

(5) 避光下，將20 mg EGCG粉末溶解于10 mL 無水乙醇中，在功率400 W下超聲5分鐘，在攪拌速度300 rpm下置于磁力攪拌器上攪拌15分鐘，然后加入100 mg干燥的納米羥基磷灰石/介孔硅復合材料，室溫下攪拌下2小時，在振蕩速度180 rpm下置于振蕩搖床上振蕩72小時；

(6) 在8000 rpm下離心15分鐘，無水乙醇清洗3次，過濾，真空干燥，得到負載EGCG的納米羥基磷灰石/介孔硅復合材料。

本發明的突出特點和有益效果是：

① 本發明耐酸耐磨防齲的牙本質脫敏材料制備工藝較簡便，工藝參數較易控制。

② 本發明耐酸耐磨防齲的牙本質脫敏材料結構穩定、分散性較好、粒徑均勻。

③ 本發明耐酸耐磨防齲的牙本質脫敏材料的EGCG負載率和釋放率較高。

④ 本發明耐酸耐磨防齲的牙本質脫敏材料可被應用于封閉牙本質小管且耐酸耐磨治療牙本質敏感和抑制致齲菌生物膜形成預防齲病。

附圖說明

圖1為本發明實施例2得到的耐酸耐磨防齲的牙本質脫敏材料(即負載EGCG的納米羥基

磷灰石/介孔硅復合材料)的透射電鏡形貌圖：其中手指表示納米羥基磷灰石，球體表示介孔硅，標尺為100 nm。由圖可知，納米羥基磷灰石粒徑40-80 nm，介孔硅粒徑400-600 nm，二者分散性好，納米羥基磷灰石均勻負載在介孔硅表面。

圖2為本發明實施例2得到的耐酸耐磨防齲的牙本質脫敏材料(即負載EGCG的納米羥基磷灰石/介孔硅復合材料)的熱重分析曲線圖。由圖可知，EGCG的負載率為11.29%。

圖3為本發明實施例2得到的耐酸耐磨防齲的牙本質脫敏材料(即負載EGCG的納米羥基磷灰石/介孔硅復合材料)的EGCG釋放曲線圖。由圖可知，96小時內EGCG的釋放率為54.49%±3.79%。

圖4為本發明實施例2得到的耐酸耐磨防齲的牙本質脫敏材料(即負載EGCG的納米羥基磷灰石/介孔硅復合材料)的牙本質小管封閉效果掃描電鏡圖。其中，圖4A表示未處理的牙本質片表面所有小管均呈開放狀態，圖4B表示使用負載EGCG的納米羥基磷灰石/介孔硅復合材料處理的牙本質片表面所有小管均被嚴密封閉；圖4C表示經過強酸浸泡后未處理的牙本質片表面所有小管仍呈開放狀態同時管口被擴大，圖4D表示經過強酸浸泡后使用負載EGCG的納米羥基磷灰石/介孔硅復合材料處理的牙本質片表面大部分小管仍被封閉；圖4E表示經過機械磨刷后未處理的牙本質片表面所有小管仍呈開放狀態，圖4F表示經過機械磨刷后使用負載EGCG的納米羥基磷灰石/介孔硅復合材料處理的牙本質片表面所有小管仍被嚴密封閉。

圖5為本發明實施例2得到的耐酸耐磨防齲的牙本質脫敏材料(即負載EGCG的納米羥基磷灰石/介孔硅復合材料)的抑制致齲菌變形鏈球菌生物膜形成的掃描電鏡圖。其中，圖5A表示未處理的牙本質片表面形成了濃厚的大量的變形鏈球菌生物膜，圖5B表示使用負載EGCG的納米羥基磷灰石/介孔硅復合材料處理的牙本質片表面形成的變形鏈球菌生物膜顯著減少。

具體實施方式

下列實施例僅用于進一步說明本發明，本領域一般技術人員可以根據本說明書公開的內容，采用其它多種方式具體實施本發明。

實施例1

(1) 室溫下，稱取0.944 g四水硝酸鈣和0.3168g磷酸氫二銨分別加入到盛有60 mL雙蒸水的燒杯中溶解，在功率400 W下超聲5分鐘，在攪拌速度200 rpm下置于磁力攪拌器上攪拌15分鐘，分別得到Ⅰ液和Ⅱ液；

(2) 稱取0.24 g干燥介孔硅粉末加入到盛有20 mL雙蒸水的燒杯中，在功率400 W下超聲分散5分鐘，得到Ⅲ液，隨后置于磁力攪拌器上，在攪拌速度200 rpm下將Ⅰ液緩慢滴加入Ⅲ液，調節并保持pH值在10-10.5之間，攪拌12小時，得到Ⅳ液；

(3) 在攪拌速度200 rpm下將Ⅱ液緩慢滴加入Ⅳ液，調節并保持pH值在10-10.5之間，攪拌30小時，得到Ⅴ液；

(4) 經過24小時陳化后，將Ⅴ液在6000 rpm下離心15分鐘，雙蒸水和無水乙醇各清洗3次，過濾，80 ℃過夜干燥，550 ℃煅燒6小時，得到納米羥基磷灰石/介孔硅復合材料，呈無色粉末狀。

(5) 避光下，稱取20 mg EGCG粉末加入到盛有10 mL無水乙醇的燒杯中溶解，在功率400 W下超聲5分鐘，在攪拌速度300 rpm下置于磁力攪拌器上攪拌15分鐘，得到Ⅵ液；

(6) 稱取100 mg干燥的納米羥基磷灰石/介孔硅復合材料加入到Ⅵ液中，室溫下攪拌下2小時，在振蕩速度180 rpm下置于振蕩搖床上振蕩72小時；

(7) 在8000 rpm下離心15分鐘，無水乙醇清洗3次，過濾，真空干燥，得到負載EGCG的納米羥基磷灰石/介孔硅復合材料，即一種耐酸耐磨防齲的牙本質脫敏材料，呈無色粉末狀。

(8) 使用透射電子顯微鏡(JEM-2100, JEOL)觀察復合材料的形貌，使用熱重分析儀(STA449F3, NETZSCH)檢測復合材料中EGCG的負載率，使用紫外-可見分光光度計(UV-2401 PC, Shimadzu Co.)計算復合材料中EGCG的釋放率。

實施例2

(1) 室溫下，稱取1.888 g四水硝酸鈣和0.6336 g磷酸氫二銨分別加入到盛有60 mL雙蒸水的燒杯中溶解，在功率400 W下超聲5分鐘，在攪拌速度200-400 rpm下置于磁力攪拌器上攪拌15分鐘，分別得到Ⅰ液和Ⅱ液；

(2) 稱取0.48 g干燥介孔硅粉末加入到盛有20 mL雙蒸水的燒杯中，在功率400 W下超聲分散5分鐘，得到Ⅲ液，隨后置于磁力攪拌器上，在攪拌速度300 rpm下將Ⅰ液緩慢滴加入Ⅲ液，調節并保持pH值在10-10.5之間，攪拌12小時，得到Ⅳ液；

(3) 在攪拌速度300 rpm下將Ⅱ液緩慢滴加入Ⅳ液，調節并保持pH值在10-10.5之間，攪拌30小時，得到Ⅴ液；

(4) 經過24小時陳化后，將Ⅴ液在8000 rpm下離心15分鐘，雙蒸水和無水乙醇各清洗3次，過濾，80 ℃過夜干燥，550 °C煅燒6小時，得到納米羥基磷灰石/介孔硅復合材料，呈無色粉末狀。

(5) 避光下，稱取20 mg EGCG粉末加入到盛有10 mL無水乙醇的燒杯中溶解，在功率400 W下超聲5分鐘，在攪拌速度300 rpm下置于磁力攪拌器上攪拌15分鐘，得到Ⅵ液；

(6) 稱取100 mg干燥的納米羥基磷灰石/介孔硅復合材料加入到Ⅵ液中，室溫下攪拌下2小時，在振蕩速度180 rpm下置于振蕩搖床上振蕩72小時；

(7) 在8000 rpm下離心15分鐘，無水乙醇清洗3次，過濾，真空干燥，得到負載EGCG的納米羥基磷灰石/介孔硅復合材料，即一種耐酸耐磨防齲的牙本質脫敏材料，呈無色粉末狀。

(8) 使用透射電子顯微鏡(JEM-2100, JEOL)觀察復合材料的形貌，使用熱重分析儀(STA449F3, NETZSCH)檢測復合材料中EGCG的負載率，使用紫外-可見分光光度計(UV-2401 PC, Shimadzu Co.)計算復合材料中EGCG的釋放率。

實施例3

(1) 室溫下，稱取3.776 g四水硝酸鈣和1.2672 g磷酸氫二銨分別加入到盛有60 mL雙蒸水的燒杯中溶解，在功率400 W下超聲5分鐘，在攪拌速度400 rpm下置于磁力攪拌器上攪拌15分鐘，分別得到Ⅰ液和Ⅱ液；

(2) 稱取0.96 g干燥介孔硅粉末加入到盛有40 mL雙蒸水的燒杯中，在功率400 W下超聲分散5分鐘，得到Ⅲ液，隨后置于磁力攪拌器上，在攪拌速度400 rpm下將Ⅰ液緩慢滴加入Ⅲ液，調節并保持pH值在10-10.5之間，攪拌12小時，得到Ⅳ液；

(3) 在攪拌速度400 rpm下將Ⅱ液緩慢滴加入Ⅳ液，調節并保持pH值在10-10.5之間，攪拌30小時，得到Ⅴ液；

(4) 經過24小時陳化后，將Ⅴ液在8000 rpm下離心15分鐘，雙蒸水和無水乙醇各清洗3次，過濾，80℃過夜干燥，550℃煅燒6小時，得到納米羥基磷灰石/介孔硅復合材料，呈無色粉末狀。

(5) 避光下，稱取20 mg EGCG粉末加入到盛有10 mL無水乙醇的燒杯中溶解，在功率400 W下超聲5分鐘，在攪拌速度300 rpm下置于磁力攪拌器上攪拌15分鐘，得到Ⅵ液；

(6) 稱取100 mg干燥的納米羥基磷灰石/介孔硅復合材料加入到Ⅵ液中，室溫下攪拌下2小時，在振蕩速度180 rpm下置于振蕩搖床上振蕩72小時；

(7) 在8000 rpm下離心15分鐘，無水乙醇清洗3次，過濾，真空干燥，得到負載EGCG的納米羥基磷灰石/介孔硅復合材料，即一種耐酸耐磨防齲的牙本質脫敏材料，呈無色粉末狀。

(8) 使用透射電子顯微鏡(JEM-2100, JEOL)觀察復合材料的形貌，使用熱重分析儀(STA449F3, NETZSCH)檢測復合材料中EGCG的負載率，使用紫外-可見分光光度計(UV-2401 PC, Shimadzu Co.)計算復合材料中EGCG的釋放率。

性能測試

(1) 封閉牙本質小管和耐酸耐磨性能的測試

選取完整無齲的離體第三磨牙顆，在水冷卻下垂直于牙體長軸去除牙冠部釉質，制備厚

度為1 mm的牙本質片。梯度打磨后置于1% (w/v)的檸檬酸溶液中20秒使牙本質小管開放以模擬牙本質敏感模型，用雙蒸水徹底沖洗。使用拋光杯分別蘸取實施例1 2 3中所制備的耐酸耐磨防齲的牙本質脫敏材料(即負載EGCG的納米羥基磷灰石/介孔硅復合材料)的漿液(按粉液比10 mg材料：100 μL雙蒸水制備)處理牙本質表面即拋光30秒，共兩次。隨后，將牙本質片分別接受兩種處理：一種是浸泡在6% (w/v)的檸檬酸溶液(pH 1.5)中1分鐘用于耐酸性能的測試，另一種是使用軟毛牙刷機械磨刷牙本質片表面3分鐘(150次/分鐘)用于耐磨性能的測試。每個處理后的牙本質片樣本在雙蒸水充分沖洗、干燥、噴金后，使用掃描電子顯微鏡(Sigma, Zeiss)觀察牙本質小管封閉情況。

由圖4的結果可知，未處理的牙本質片表面所有小管均呈開放狀態(圖4A)，使用耐酸耐磨防齲的牙本質脫敏材料(即負載EGCG的納米羥基磷灰石/介孔硅復合材料)處理的牙本質片表面所有小管均被嚴密封閉(圖4B)；經過強酸浸泡后，未處理的牙本質片表面所有小管仍呈開放狀態同時管口被擴大(圖4C)，使用耐酸耐磨防齲的牙本質脫敏材料(即負載EGCG的納米羥基磷灰石/介孔硅復合材料)處理的牙本質片表面大部分小管仍被封閉(圖4D)；經過機械磨刷后，未處理的牙本質片表面所有小管仍呈開放狀態(圖4E)，使用耐酸耐磨防齲的牙本質脫敏材料(即負載EGCG的納米羥基磷灰石/介孔硅復合材料)處理的牙本質片表面所有小管仍被嚴密封閉(圖4F)。以上結果直接證明了耐酸耐磨防齲的牙本質脫敏材料(即負載EGCG的納米羥基磷灰石/介孔硅復合材料)可以有效封閉牙本質小管并且能夠耐酸耐磨，可以應用于治療牙本質敏感。此結果為實施例2所獲效果，實施例1和實施例3同樣能獲此效果。

(2) 抑制致齲菌生物膜形成防齲性能的測試

按(1)中的方法制備牙本質片并建立敏感模型，正反面各用紫光光照殺菌1小時后使用拋光杯分別蘸取實施例1 2 3中所制備的耐酸耐磨防齲的牙本質脫敏材料(即負載EGCG的納米羥基磷灰石/介孔硅復合材料)的漿液(按粉液比10 mg材料：100 μL雙蒸水制備)處理牙本質表

面即拋光30秒，共兩次。將牙本質片樣本置于24孔板中，每孔加入1 mL變形鏈球菌接種培養基(變形鏈球菌在腦心浸出液肉湯中37 °C厭氧過夜培養，調整濃度為10⁷ CFU/mL，接種培養基用含1% (w/v)蔗糖的腦心浸出液肉湯稀釋獲得)，在37 °C厭氧條件下培養24小時用于變形鏈球菌生物膜形成。隨后用PBS沖洗三次洗脫未粘附的細菌，每個牙本質片樣本用2.5%戊二醛在4 °C固定4小時，乙醇梯度脫水(30%, 50%, 70%, 80 %, 90%和100%)，干燥，噴金后，使用掃描電子顯微鏡(Sigma, Zeiss)觀察牙本質表面變形鏈球菌生物膜形態和粘附情況。

由圖5的結果可知，未處理的牙本質片表面形成了濃厚的大量的變形鏈球菌生物膜(圖5A)，使用耐酸耐磨防齲的牙本質脫敏材料(即負載EGCG的納米羥基磷灰石/介孔硅復合材料)處理的牙本質片表面形成的變形鏈球菌生物膜顯著減少(圖5B)。以上結果直接證明了耐酸耐

磨防齲的牙本質脫敏材料(即負載EGCG的納米羥基磷灰石/介孔硅復合材料)可以有效抑制致齲菌生物膜的形成，可以應用于牙本質齲的預防。此結果為實施例2所獲效果，實施例1和實施例3同樣能獲此效果。