技術領域：
本發明屬于基因表達調控領域，具體涉及一種用于調高PTEN基因表達的多肽復合物的制備方法。
背景技術：
：PTEN是第一個同時兼具脂質和蛋白雙特異性磷酸酶活性的抑癌基因，于1997年從人類第10q23.3染色體位點分離并得到，可參與細胞周期調控并抑制腫瘤細胞增殖及促進腫瘤細胞凋亡。在研究新的抗癌藥物時，可以其是否可以調高PTEN的表達來進行。目前，在研究可以調高PTEN表達的試劑或者組合物領域中，多直接將各組分直接進行混合，不僅效率較低，而且不利于實際應用。另一方面，據發明所知，目前尚未發現設計特定多肽來實現調控PTEN表達的報道。技術實現要素：根據本領域的需求和現有技術的缺點和技術空白，本發明的目的在于提供一種用于調高PTEN基因表達的多肽復合物的制備方法，所述方法為：（1）制備聚合物顆粒，所述聚合物為PLA或PCL；所述聚合物顆粒中包埋有質量分數為0.5-0.8%的雷公藤甲素；（2）將步驟（1）所得顆粒與多肽混合，所述多肽的序列如SEQIDNO.1所示；所述顆粒的粒徑為1-3μm，所述顆粒與多肽的質量比為1000-5000:1。發明人發現，當將本發明所述的多肽與本發明所述聚合物顆粒混合時，可以顯著的調高PTEN的表達。本發明所述聚合物顆粒中的雷公藤甲素可以緩慢的釋放，且包埋量僅需0.5-0.8%。值得說明的是，本發明所用的聚合物具有很好生物相容性，所制備得到的復合物可以直接注射至腫瘤部位。發明人還發現，當不包埋雷公藤甲素時，對PETN幾乎不產生調控作用。其中的機制還需進一步的研究。優選的，步驟（1）中，雷公藤甲素的質量分數為0.55%。優選的，所述顆粒與多肽的質量比為2000-4000:1。更優選的，所述顆粒與多肽的質量比為3500:1。所述聚合物為聚乳酸（PLA）。優選的，所述PLA的分子量為5000-8000。更優選的，所述PLA的分子量為6000。當PLA的分子量如上述范圍時，在制備顆粒時較為容易且粒徑較為可控；當分子量為6000時最好。本發明的有益效果：1、本發明可以顯著的調高PTEN的表達，可以有效的實現抑瘤效果；2、本發明對藥物的使用量很小，可大幅度的降低藥物的相關副作用。具體實施方式下面通過實施例對本發明進行具體描述，有必要在此指出的是以下實施例只是用于對本發明進行進一步的說明，不能理解為對本發明保護范圍的限制，該領域的技術熟練人員根據上述
發明內容所做出的一些非本質的改進和調整，仍屬于本發明的保護范圍。實施例1（1）制備聚合物顆粒，所述聚合物為PLA（分子量為6000）；所述聚合物顆粒中包埋有質量分數為0.55%的雷公藤甲素；（2）將步驟（1）所得顆粒與多肽混合，所述多肽的序列如SEQIDNO.1所示；所述顆粒的粒徑為1-3μm，所述顆粒與多肽的質量比為3500:1。實施例2（1）制備聚合物顆粒，所述聚合物為PLA（分子量為5000）；所述聚合物顆粒中包埋有質量分數為0.8%的雷公藤甲素；（2）將步驟（1）所得顆粒與多肽混合，所述多肽的序列如SEQIDNO.1所示；所述顆粒的粒徑為1-3μm，所述顆粒與多肽的質量比為5000:1。實施例3（1）制備聚合物顆粒，所述聚合物為PLA（分子量為8000）；所述聚合物顆粒中包埋有質量分數為0.5%的雷公藤甲素；（2）將步驟（1）所得顆粒與多肽混合，所述多肽的序列如SEQIDNO.1所示；所述顆粒的粒徑為1-3μm，所述顆粒與多肽的質量比為1000:1。實施例4（1）制備聚合物顆粒，所述聚合物為PCL（分子量為5000）；所述聚合物顆粒中包埋有質量分數為0.6%的雷公藤甲素；（2）將步驟（1）所得顆粒與多肽混合，所述多肽的序列如SEQIDNO.1所示；所述顆粒的粒徑為1-3μm，所述顆粒與多肽的質量比為3000:1。實驗例取對數生長期Lewis肺癌細胞，胰酶消化后離心收集細胞（1800r/min離心5min），用無血清DMEM培養基重懸洗滌并調整細胞濃度為1×107個/mL，用1mL注射器吸取細胞懸液0.2mL（含細胞數2×106個）注射于C57BL/6小鼠左側腋部皮下，建立小鼠皮下移植瘤動物模型。接種10d后，檢測小鼠成瘤狀況，將符合要求的成瘤小鼠分為實驗組和對照組，各組均在接種10d后晨起空腹給藥。①對照組：0.2mL/10g0.9%氯化鈉溶液灌胃10d，并分別在第1、3、5天腹腔注射0.9%氯化鈉溶液0.4mL；②實驗組（實施例1-4）：0.02g·復合物/10g灌胃10d，并分別在第1、3、5天腹腔注射0.4mL；稱取瘤質量，計算抑瘤率給藥第11天處死小鼠，完整剝取腋部皮下腫瘤組織，精密電子天平稱重，分別計算各組抑瘤率，抑瘤率（%）=（對照組平均瘤質量-實驗組平均瘤質量/對照組平均瘤質量）×100%。Westernblot法檢測腫瘤組織PTEN蛋白表達剪取腫瘤組織約0.1g，加入RIPA細胞裂解液1mL（內含1mmol/LPMSF）進行裂解，離心收集組織總蛋白樣品。經SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白組分，將蛋白轉印于PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2h，加入一抗（PTEN：500倍稀釋）4℃孵育過夜，再加入HRP標記的二抗（1∶10000比例稀釋），室溫封閉2h，洗滌干凈，ECL顯色后膠片曝光并用ImageJ軟件分析結果。稱取腫瘤組織0.1g液氮研磨，加入1mLTrizol提取總RNA。根據RevertAidTMfirstStrandcDNASynthesisKit試劑盒逆轉錄成cDNA，以此cDNA作為熒光定量模板，按照特定的反應體系和反應條件進行擴增，引物序列是Forwardprimer5’-TTTGGTCACCCTTTGAGTCC-3’，Reverseprimer5’-GCTTTTACCTAGGGGGCAAG-3’，以β-actin作為內參，RelativeQuantificationStudy為分析方法，最終計算取2-△△Ct。實驗結果如表1和表2所示。表1抑瘤率實施例1實施例2實施例3實施例4對比實施例1對比實施例2抑瘤率（%）66.159.462.268.49.75.5表2PTEN蛋白、PTENmRNA的表達實施例1實施例2實施例3實施例4對照組PTEN蛋白2.152.112.031.830.23PTENmRNA3.633.573.353.561.05序列表SEQIDNO.1YKKQQCRRCRYRR當前第1頁1 2 3