本發明涉及水產養殖
技術領域：
，進一步涉及針對魚類的免疫調節技術，具體涉及一種用于石斑魚的當歸多糖免疫增強劑及其應用。
背景技術：
：石斑魚(epinephelussp.)肉質細嫩、味道鮮美、營養豐富，為名貴的海水魚。隨著養殖密度的不斷擴大，石斑魚健康水平和抗病能力顯著下降，病害頻發。而抗生素和化學消毒劑不僅增加致病病原菌的耐藥性，而且造成藥物污染水體，破壞生態環境。更嚴重的是，抗生素和化學消毒劑在魚體內富集，危害人類健康。當歸作為中國傳統中草藥，入藥首載于《神農本草經》，治療疾病已有2000年歷史，其藥用部位主要是當歸的根。當歸具有活血、補血、調經止痛等作用。隨著現代分離技術和儀器的進步，當歸的多種成分被分離出來，其中當歸多糖(angelicasinensispolysaccharide，asp)是當歸的主要有效成分之一。近年國內外學者對當歸多糖進行的大量研究表明：當歸多糖是一種大分子物質，可作為一種免疫增強劑，可以調節陸生高等動物的免疫系統和造血系統，具有抗腫瘤、抗輻射、抗氧化和鎮痛等藥理學作用。然而當歸多糖對水產動物免疫力的影響研究很少，如何利用當歸多糖調節水產動物免疫力，還缺乏技術支持。技術實現要素：本發明旨在針對現有技術的技術缺陷，提供一種用于石斑魚的當歸多糖免疫增強劑，以解決現有技術的石斑魚養殖過程中，缺乏一種針對石斑魚的免疫促進手段的技術問題。本發明要解決的另一技術問題是常規的石斑魚抗病治療藥物若長期使用可能產生耐藥性。本發明要解決的再一技術問題是常規的石斑魚抗病治療藥物可能在石斑魚體內富集，進而影響人類的食用健康。本發明要解決的又一技術問題是當采用當歸多糖對石斑魚進行免疫干預時，缺乏一種有效的使用手段。為實現以上技術目的，本發明采用以下技術方案：一種用于石斑魚的當歸多糖免疫增強劑，包括當歸粗多糖和脫蛋白當歸多糖。作為優選，所述當歸粗多糖的注射劑量為37.5～300mg/kg魚體重。作為優選，所述脫蛋白當歸多糖的注射劑量為120～180mg/kg魚體重。同時，本發明提供了上述當歸多糖免疫增強劑用于制備石斑魚免疫促進藥物的應用。作為優選，所述藥物是注射劑。作為優選，所述注射劑中當歸粗多糖的用量為37.5～300mg/kg魚體重，所述注射劑中脫蛋白當歸多糖的用量為120～180mg/kg魚體重。作為優選，所述藥物是提高石斑魚白細胞吞噬活力的藥物。作為優選，所述藥物是提高石斑魚血漿溶菌酶活力的藥物。作為優選，所述藥物是提高石斑魚血漿中白蛋白/球蛋白比值的藥物。同時，本發明提供了上述當歸多糖免疫增強劑用于預防石斑魚感染遲緩愛德華氏菌的應用。本發明提供了一種用于石斑魚的當歸多糖免疫增強劑及其應用，該技術方案以動物實驗為基礎研究了當歸多糖對石斑魚的免疫干預作用，在此基礎上明確了以當歸粗多糖和脫蛋白當歸多糖為核心成分的免疫增強劑配方，并進一步研究了二者的有效劑量及其藥理作用。實驗發現，以casp(當歸粗多糖)劑量為37.5～300mg/kg魚體重、asp(脫蛋白當歸多糖)劑量為120～180mg/kg魚體重對石斑魚執行腹腔注射后，在3～14d內其血紅蛋白含量，nbt陽性細胞數，血漿溶菌酶活力、白蛋白/球蛋白(a/g)、血漿sod超氧化物歧化酶(sod)活力和過氧化氫酶(cat)活力顯著升高；血漿丙二醛(mda)含量顯著降低；白細胞增殖、吞噬和呼吸爆發活力顯著提高，并顯著降低感染遲緩愛德華氏菌石斑魚的累積死亡率?；谝陨嫌幸娴陌l現，本發明確定了以當歸粗多糖、脫蛋白當歸多糖復合物作為石斑魚免疫促進藥物的應用，可在調節石斑魚的非特異性免疫力的基礎上有效提升其抗病性能。本發明基于嚴謹的實驗手段獲得了有益的技術效果，同時成本較低、易于實現，因此具有良好的推廣前景。附圖說明圖1是casp對點帶石斑魚血液nbt陽性細胞的影響圖。圖2是asp對點帶石斑魚血液nbt陽性細胞數的影響圖。圖3是casp對點帶石斑魚血液血紅蛋白含量的影響圖。圖4是asp對點帶石斑魚血液血紅蛋白含量的影響圖。圖5是casp對點帶石斑魚血漿lzm活力的影響圖。圖6是asp對點帶石斑魚血漿lzm活力的影響圖。圖7是casp對點帶石斑魚血漿a/g的影響圖。圖8是asp對點帶石斑魚血漿a/g的影響圖。圖9是casp對點帶石斑魚血漿t-sod活力的影響圖。圖10是asp對點帶石斑魚血漿t-sod活力的影響圖。圖11是casp對點帶石斑魚血漿cat活力的影響圖。圖12是asp對點帶石斑魚血漿cat活力的影響圖。圖13是casp對點帶石斑魚血漿mda含量的影響圖。圖14是asp對點帶石斑魚血漿mda含量的影響圖。圖15是casp對頭腎白細胞增殖的影響圖。圖16是csap對頭腎白細胞的吞噬活力的影響圖。圖17是casp對頭腎白細胞的呼吸爆發活力的影響圖。圖18是注射casp14天后，每尾注射100μl遲鈍愛德華菌(1.4×108cfu/ml)，點帶石斑魚的累積死亡率比較圖。圖19是注射asp14天后，每尾注射100μl遲鈍愛德華菌(1.4×108cfu/ml)，點帶石斑魚的累積死亡率比較圖。具體實施方式以下將對本發明的具體實施方式進行詳細描述。為了避免過多不必要的細節，在以下實施例中對屬于公知的結構或功能將不進行詳細描述。除有定義外，以下實施例中所用的技術和科學術語具有與本發明所屬領域技術人員普遍理解的相同含義。在以下實施例中，所用到的當歸粗多糖(crudeangelicasinensispolysaccharide,casp)，可以是利用乙醇沉淀法提取得到的；所用到的去蛋白當歸多糖(angelicasinensispolysaccharide，asp)，可以是利用seveg法去除當歸多糖中的蛋白質而得到的。1、當歸粗多糖(casp)的制備提取方法i：將風干后的當歸加蒸餾水，料液比為1:30，煮沸30min，過濾，向水煮液中加無水乙醇，使乙醇在混合液中的濃度為80％，攪拌均勻，4℃靜置6h，4000r/min離心10min。提取方法ii：將新鮮當歸自然風干并處理成小片，用體積分數為75％的乙醇溶液浸泡一周，料液比為1：10，浸泡并不時攪動。醇提后殘渣先用水煮沸30min，料液比為1:30，上清液中加入無水乙醇使乙醇終濃度至80％，攪拌均勻后4℃冷藏靜置6h后離心(4000r/min，10min)。提取方法iii：將自然風干后的新鮮當歸處理成小塊狀，用78％的乙醇浸泡一周，料液比為1：10，要經常攪拌，浸泡好后用76％的乙醇進行滲漉，直到滲出液無色為止，將滲漉后的當歸用蒸餾水煮沸30min，料液比為1:30，水煮后得到的提取液加入無水乙醇使乙醇終濃度至80％，攪拌，4℃冷藏靜置后離心(4000r/min，10min)。以上三種提取方法制備的沉淀，均反復用95％的乙醇脫色，直到上清液無色，沉淀冷凍干燥后均為casp。2.脫蛋白當歸多糖(asp)的制備以上方法制備的當歸粗多糖(casp)加三蒸水溶解(濃度為2mg/ml)，采用sevag法脫蛋白：當歸多糖粗提物溶液中按體積比為3:1加入sevag試劑，放在磁力攪拌器上攪拌45min后離心(4000r/min，10min)。離心后溶液分為三層，上層為多糖溶液，中層為蛋白質凝膠層，底層為有機溶劑。取上層多糖溶液重復上述步驟，直到蛋白質凝膠層消失。多糖溶液在280nm波長附近無特征吸收峰，說明多糖中的蛋白質已經去除。將脫蛋白后的多糖溶液移到處理好的透析袋中，放入三蒸水中透析3-4d。透析過程中，要注意勤換水。透析好的多糖溶液經旋轉蒸發儀濃縮后冷凍干燥得到當歸多糖(angelicasinensispolysaccharide，asp)。3、腹腔注射當歸多糖對石斑魚體液非特異性免疫指標的影響選取選取規格一致、活潑健康的石斑魚，體質量50～80g。分組(每組4個箱子，每個箱子45尾魚)，分別注射casp或asp，注射劑量分別為37.5mg/kg、75mg/kg、150mg/kg和300mg/kg魚體重，對照組注射無菌生理鹽水。注射前以及注射后第3、7、14、21、28d取樣(取樣前停食1d)，可以檢測到注射casp或asp顯著增加石斑魚血液血紅蛋白含量，nbt陽性細胞數量，血漿溶菌酶活力、a/g、sod活力和cat活力、mda含量，結果如說明書附圖1-14所示。注射casp還可以增強石斑魚白細胞的增殖、吞噬和呼吸爆發活力，結果如說明書附圖15-17所示。4、腹腔注射當歸多糖對石斑魚體抗愛德華氏菌能力的影響石斑魚注射casp或asp14d后，用遲緩愛德華氏菌(edwardsiellatarda)進行攻毒，菌體濃度度1.4×108cfu/ml，每尾魚注射100μl遲緩愛德華氏菌液。每天喂食2次，每天觀察魚的死亡情況并記錄死亡數，連續觀察7d，以計算累積死亡率，計算公式為：第n天的累積死亡率(％)＝n天總共死亡的魚數目÷攻毒魚總數目×100。未注射多糖的石斑魚，累計死亡率在攻毒第2天即達到80％，第4天接近100％，而注射casp的石斑魚，攻毒4d內累計死亡率低于20％，5天內低于40％。注射asp的石斑魚，攻毒后2d內死亡率低于60％，3d低于80％。具體結果如說明書附圖18、19所示。以上對本發明的實施例進行了詳細說明，但所述內容僅為本發明的較佳實施例，并不用以限制本發明。凡在本發明的申請范圍內所做的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。應用實例1：在石斑魚疾病易發季節，選2池體重為20-30g/尾的石斑魚幼魚。用無菌生理鹽水將當歸粗多糖配成26mg/ml。1號池每尾魚腹腔注射當歸粗多糖0.2ml，2號池每尾魚腹腔注射無菌生理鹽水0.2ml。每天記錄每池石斑魚發病和死亡情況，連續飼養30天。結果表明，腹腔注射當歸粗多糖能顯著降低石斑魚的發病率和死亡率(表1)。表1當歸粗多糖腹腔注射試驗結果池號注射藥物開始魚數發病魚數死亡魚數發病率％死亡率％1#當歸粗多糖247684733834.213.72#生理鹽水24821433108357.743.6應用實例2：在石斑魚疾病易發季節，選2池體重為45-65g/尾的石斑魚幼魚。用無菌生理鹽水將脫蛋白當歸多糖配成45mg/ml。1號池每尾魚腹腔注射當歸粗多糖0.2ml，2號池每尾魚腹腔注射無菌生理鹽水0.2ml。每天記錄每池石斑魚發病和死亡情況，連續飼養30天。結果表明，腹腔注射脫蛋白當歸多糖能顯著降低石斑魚的發病率和死亡率(表2)。表2脫蛋白當歸多糖腹腔注射試驗結果當前第1頁12