技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種降齊墩果酸化合物pyrocincholicacid3β‐o‐β‐d‐quinovopyranosyl‐28‐o‐β‐d‐glucopyranoside(paqg)在3t3‐l1細胞中調(diào)控脂代謝的新功能，以及其在制備改善肥胖及肥胖相關(guān)代謝性疾病的藥物、食品及保健品中的應(yīng)用。

技術(shù)背景：

糖尿病作為一種慢性代謝性疾病，它的并發(fā)癥嚴重危及著人類的身體健康。尤其是與人類生活方式密切相關(guān)的2型糖尿病的研究也越來越多。研究表明，50％的肥胖人群都患有2型糖尿病，并且肥胖能夠使2型糖尿病的患病率增加3倍。所以，肥胖與糖尿病的研究也越來越備受關(guān)注。

世界衛(wèi)生組織(who)明確將肥胖定義為“體內(nèi)過多或異常的脂肪累積”，而造成體內(nèi)脂肪累積的原因可以從脂肪細胞數(shù)目和脂肪細胞中脂肪的含量兩方面考慮。對脂肪累積的研究也成為一個治療糖尿病的新靶點。雖然，市面上存在著各種各樣改善肥胖的藥物，但大多由于藥效低、副作用大而滯銷，所以，研究一種安全有效的改善肥胖、治療糖尿病的藥物或者化合物仍然是極有必要的。

paqg是一種新型的降齊墩果酸型皂苷小分子，從黃棉木中提取。黃棉木是茜草科黃棉木屬中的單種屬植物，廣泛生長于中國西南部，越南，印度等地。目前，這一類化合物僅分離出二十多種，paqg就是其中的一種。而且，這些化合物的活性研究也比較少。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了paqg在3t3‐l1細胞中對脂代謝的調(diào)控作用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
：

本發(fā)明的目的在于提供一種具有顯著抑制3t3‐l1細胞分化和脂肪累積的化合物paqg，以及該化合物在制備改善肥胖及肥胖相關(guān)代謝性疾病的藥物、食品及保健品方面的應(yīng)用。

為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案：

化合物paqg在制備對3t3‐l1前脂肪細胞分化的抑制劑中的應(yīng)用，

化合物paqg在制備對成熟脂肪細胞脂肪代謝的調(diào)節(jié)劑中的應(yīng)用。

化合物paqg在制備減肥藥物中的應(yīng)用。

化合物paqg在制備調(diào)節(jié)血脂的藥物中的應(yīng)用。

根據(jù)所述的化合物paqg在制備減肥藥物中的應(yīng)用，以及所述的化合物paqg在制備調(diào)節(jié)血脂的藥物中的應(yīng)用，其中paqg是通過顯著抑制3t3‐l1前脂肪細胞分化，下調(diào)分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子和蛋白pparγ,c/ebpβ,c/ebpα和fabp4的表達以及脂聯(lián)素的釋放，并通過抑制脂肪酸合成和促進脂氧化來抑制脂肪細胞中的脂肪累積，達到減肥和調(diào)節(jié)血脂作用。

本發(fā)明同時還提供了化合物paqg在制備改善肥胖及治療或預(yù)防肥胖相關(guān)代謝性疾病的藥物中的應(yīng)用。

根據(jù)所述的化合物paqg在制備改善肥胖及治療或預(yù)防肥胖相關(guān)代謝性疾病的藥物中的應(yīng)用，其中paqg是通過顯著抑制3t3‐l1前脂肪細胞分化，下調(diào)分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子和蛋白pparγ,c/ebpβ,c/ebpα和fabp4的表達以及脂聯(lián)素的釋放，并通過抑制脂肪酸合成和促進脂氧化來抑制脂肪細胞中的脂肪累積，達到減肥作用。

本發(fā)明另外還提供了化合物paqg在制備改善肥胖及肥胖相關(guān)代謝性疾病的食品及保健品中的應(yīng)用。

經(jīng)過大量多次的獨立重復(fù)試驗，首次發(fā)現(xiàn)了paqg在3t3‐l1細胞中對脂代謝的調(diào)控作用。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)paqg能夠顯著抑制3t3‐l1前脂肪細胞分化，下調(diào)分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子和蛋白(pparγ,c/ebpβ,c/ebpα和fabp4)的表達以及脂聯(lián)素的釋放。同時，通過抑制脂肪酸合成和促進脂氧化來抑制脂肪細胞中的脂肪累積。其調(diào)節(jié)脂代謝的作用可能與ampk信號通路的激活有關(guān)。在安全有效的給藥劑量下，paqg從脂肪細胞數(shù)目和脂肪含量大小兩方面來改善肥胖。

附圖說明

圖1.油紅o染色。3t3‐l1前脂肪細胞誘導(dǎo)分化6天。實驗組添加不同濃度的paqg；con組不加化合物，用0.1％dmso替代；undifferentiated組不添加誘導(dǎo)試劑作為空白對照。實驗獨立重復(fù)三次。

圖2.3t3‐l1前脂肪細胞誘導(dǎo)分化6天，實驗組添加不同濃度的paqg，對照組不加化合物，用0.1％dmso替代。(a)分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(pparγ,c/ebpβ和c/ebpα)以及蛋白fabp4的電泳結(jié)果；(b)培養(yǎng)基中的脂聯(lián)素釋放水平。實驗獨立重復(fù)三次，組間比較使用獨立樣本t檢驗，誤差線為標準誤。與對照組比較，*p<0.05,**p<0.01。

圖3.分化完成的脂肪細胞，用不同濃度paqg處理48小時，0.1％dmso作對照。(a)，上圖，給藥方法；下圖，給藥48小時后，脂肪細胞中脂滴含量；(b)，正常情況下，3t3‐l1脂肪細胞中的甘油三酯的時間‐濃度曲線；(c)，給藥處理后，3t3‐l1脂肪細胞中甘油三酯的時間‐濃度曲線；(d)，給藥處理后，3t3‐l1脂肪細胞中的游離脂肪酸的時間‐濃度曲線；(e)，給藥處理后，3t3‐l1脂肪細胞中的甘油的時間‐濃度曲線；(f)，3t3‐l1脂肪細胞中甘油釋放的時間‐濃度曲線。實驗獨立重復(fù)三次，組間比較使用獨立樣本t檢驗，誤差線為標準誤。與對照組比較，*p<0.05,**p<0.01。

圖4.(a)，3t3‐l1前脂肪細胞在含有不同濃度paqg的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中分化，6天后，用聚丙烯酰胺凝膠電泳法檢測的蛋白ampk和p‐ampk的表達；(b)，對(a)實驗結(jié)果的量化；(c)，在3t3‐l1前脂肪細胞誘導(dǎo)分化的全過程加入20μmpaqg，對照組添加0.1％的dmso，然后在不同的時間點收集蛋白樣品檢測ampk和p‐ampk的表達水平；(d)，對(c)實驗結(jié)果的量化(箭頭表示化合物paqg開始給藥處理)。實驗獨立重復(fù)三次，組間比較使用獨立樣本t檢驗，誤差線為標準誤。與對照組比較，*p<0.05,**p<0.01。

圖5.將分化好的3t3‐l1脂肪細胞用不同濃度的paqg孵育48小時(收集蛋白樣品和rt‐pcr樣品)。(a)，p‐ampk和ampk的電泳結(jié)果；(b)，對(a)蛋白電泳結(jié)果的量化；(c)，rt‐pcr結(jié)果：受ampk調(diào)控的與脂肪酸合成相關(guān)的基因(srebp1c、accα、scd1、fas)的表達；(d)，rt‐pcr結(jié)果：受ampk調(diào)控的與脂氧化相關(guān)的基因(pdk4、cpt1a、acox1)的表達。實驗獨立重復(fù)三次，組間比較使用獨立樣本t檢驗，誤差線為標準誤。與對照組比較，*p<0.05,**p<0.01。

圖6.在3t3‐l1細胞中，化合物paqg的細胞毒性實驗。實驗獨立重復(fù)三次。

具體實施方式：

下面結(jié)合附圖，用本發(fā)明的實施例來進一步說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此來限定本發(fā)明。

實施例1：

本發(fā)明化合物paqg，結(jié)構(gòu)式如下式(i)所示，提取于黃棉木，由中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園提供，制備方法請參考如下文獻中所記載的方法。

zhangy,tann,huangh,etal.triterpenoidsaponinsfrommetadinatrichotoma[j].zeitschriftfürnaturforschungb,2007,62(5):745‐748.

1、paqg抑制3t3‐l1前脂肪細胞分化：

3t3‐l1前脂肪細胞饑餓兩天，用誘導(dǎo)試劑誘導(dǎo)分化三天，再用維持培養(yǎng)基培養(yǎng)一天，之后更換新鮮培養(yǎng)基正常培養(yǎng)即分化為脂肪細胞。按照該實驗方法，在整個分化過程中用不同濃度(0,2.5μm,5μm,10μm,20μm)的paqg處理，對照組用0.1％的dmso替代。待細胞完全分化好后，用油紅o染色的方法檢測脂肪細胞中的脂肪含量。如圖1所示，與正常分化的對照組細胞相比，給藥組脂肪細胞的分化受到明顯抑制，并且呈現(xiàn)濃度梯度依賴性，而20μmpaqg對脂肪細胞分化的抑制水平高達90％，此時的細胞中基本觀察不到脂滴。

圖1.油紅o染色。3t3‐l1前脂肪細胞誘導(dǎo)分化6天。實驗組添加不同濃度的paqg；con組不加化合物，用0.1％dmso替代；undifferentiated組不添加誘導(dǎo)試劑作為空白對照。實驗獨立重復(fù)三次。

圖2.3t3‐l1前脂肪細胞誘導(dǎo)分化6天，實驗組添加不同濃度的paqg，對照組不加化合物，用0.1％dmso替代。(a)分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(pparγ,c/ebpβ和c/ebpα)以及蛋白fabp4的電泳結(jié)果；(b)培養(yǎng)基中的脂聯(lián)素釋放水平。實驗獨立重復(fù)三次，組間比較使用獨立樣本t檢驗，誤差線為標準誤。與對照組比較，*p<0.05,**p<0.01。

同時，本發(fā)明收集以上實驗的蛋白樣品，用瓊脂糖凝膠電泳法檢測，發(fā)現(xiàn)分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子及蛋白(pparγ,c/ebpβ,c/ebpα和fabp4)的表達顯著下降(圖2a)，并且，用脂聯(lián)素試劑盒檢測到培養(yǎng)基中脂聯(lián)素的釋放也降低如圖2b所示。以上三個方面的結(jié)果均證明paqg顯著抑制3t3‐l1前脂肪細胞分化。

2、paqg抑制成熟脂肪細胞中的脂肪累積

3t3‐l1前脂肪細胞正常分化結(jié)束后，分別用10μm和20μmpaqg處理48小時，對照組為0.1％dmso(如圖3a上)。在顯微鏡下觀察結(jié)果如圖3a所示，與對照組細胞相比，實驗組細胞中的脂含量顯著降低。同時，我們用無水乙醇溶解并收集細胞中的脂，并檢測其中甘油三酯(tg)的含量。如圖3b所示，與鏡檢結(jié)果一致，paqg處理后胞內(nèi)tg含量顯著降低，呈濃度梯度依賴性。而不做給藥處理的細胞，正常分化后，胞內(nèi)的tg是不斷累積的(圖3b)。paqg導(dǎo)致脂肪細胞中tg減少，可能由于它促進了脂肪細胞中的tg水解，生成游離脂肪酸(ffa)和甘油(glycerol)，釋放到培養(yǎng)基。因此，我們用試劑盒檢測了培養(yǎng)基中ffa和glycerol的含量，如圖3d和3e所示，培養(yǎng)基中的ffa和glycerol含量都顯著增加(與正常對照組相比)，并且也呈濃度梯度依賴性。

為了動態(tài)檢測paqg處理過程中，脂肪細胞中的脂肪含量變化。我們在paqg處理的48小時內(nèi)，檢測不同時間點培養(yǎng)基中的甘油含量(圖3f)，并以此繪制了甘油釋放的時間曲線。結(jié)果顯示，在對照組和實驗組中，甘油的含量都是隨著時間延長而逐漸增加，但是化合物處理后，甘油的含量明顯高于對照組，并且呈濃度梯度依賴性。該結(jié)果提示，paqg的降脂作用與促進脂肪細胞中tg降解有關(guān)。

圖3.分化完成的脂肪細胞，用不同濃度paqg處理48小時，0.1％dmso作對照。(a)，上圖，給藥方法；下圖，給藥48小時后，脂肪細胞中脂滴含量；(b)，正常情況下，3t3‐l1脂肪細胞中的甘油三酯的時間‐濃度曲線；(c)，給藥處理后，3t3‐l1脂肪細胞中甘油三酯的時間‐濃度曲線；(d)，給藥處理后，3t3‐l1脂肪細胞中的游離脂肪酸的時間‐濃度曲線；(e)，給藥處理后，3t3‐l1脂肪細胞中的甘油的時間‐濃度曲線；(f)，3t3‐l1脂肪細胞中甘油釋放的時間‐濃度曲線。實驗獨立重復(fù)三次，組間比較使用獨立樣本t檢驗，誤差線為標準誤。與對照組比較，*p<0.05,**p<0.01。

3、paqg在3t3‐l1細胞中激活ampk信號通路

當(dāng)觀察到paqg抑制3t3‐l1前脂肪細胞分化現(xiàn)象的時候，我們收集該蛋白樣品，并用瓊脂糖凝膠電泳法檢測ampk和p‐ampk的蛋白表達。如圖4a和4b所示，ampk的磷酸化水平隨著paqg的濃度變化呈現(xiàn)梯度性增加。為了進一步探究3t3‐l1前脂肪細胞分化過程中ampk磷酸化的變化情況，我們進行了如下實驗。即從剛開始誘導(dǎo)分化時給藥，對照組用0.1％dmso替代，在day1、day3、day4、day6這幾個不同時間點收蛋白，檢測ampk和p‐ampk的表達。結(jié)果如圖4c和4d所示，paqg在3t3‐l1前脂肪細胞分化的整個過程中都能夠持續(xù)激活ampk的磷酸化。

為了探究paqg抑制3t3-l1細胞脂肪累積的作用機制，我們進行了如下實驗：當(dāng)細胞分化結(jié)束后，分別用10μm和20μmpaqg處理細胞，用0.1％dmso作為對照。兩天后，一部分收集蛋白樣品檢測ampk和p-ampk的表達；另一部分收集rna樣品檢測ampk信號通路下游與脂代謝相關(guān)的基因表達。其中，ampk信號通路與脂代謝相關(guān)的基因主要包括脂肪酸合成和脂氧化兩類。而與脂肪酸合成相關(guān)的基因主要有：srebp1c、accα、scd1、fas；與脂氧化相關(guān)的基因主要有：pdk4、cpt1a、acox1。實驗結(jié)果如圖5a-d所示，ampk的磷酸化水平隨著paqg的濃度變化呈現(xiàn)梯度性增加。此外，基因srebp1c、accα、scd1、fas的表達降低，而pdk4和cpt1a的表達增加，acox1的表達基本不變。由此說明，paqg可能通過激活ampk信號通路，抑制脂肪酸合成并促進脂氧化，從而發(fā)揮降脂作用。

圖4.a)，3t3‐l1前脂肪細胞在含有不同濃度paqg的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中分化，6天后，用聚丙烯酰胺凝膠電泳法檢測的蛋白ampk和p‐ampk的表達；(b)，對(a)實驗結(jié)果的量化；(c)，在3t3‐l1前脂肪細胞誘導(dǎo)分化的全過程加入20μmpaqg，對照組添加0.1％的dmso，然后在不同的時間點收集蛋白樣品檢測ampk和p‐ampk的表達水平；(d)，對(c)實驗結(jié)果的量化(箭頭表示化合物paqg開始給藥處理)。實驗獨立重復(fù)三次，組間比較使用獨立樣本t檢驗，誤差線為標準誤。與對照組比較，*p<0.05,**p<0.01。

圖5.將分化好的3t3‐l1脂肪細胞用不同濃度的paqg孵育48小時(收集蛋白樣品和rt‐pcr樣品)。(a)，p‐ampk和ampk的電泳結(jié)果；(b)，對(a)蛋白電泳結(jié)果的量化；(c)，rt‐pcr結(jié)果：受ampk調(diào)控的與脂肪酸合成相關(guān)的基因(srebp1c、accα、scd1、fas)的表達；(d)，rt‐pcr結(jié)果：受ampk調(diào)控的與脂氧化相關(guān)的基因(pdk4、cpt1a、acox1)的表達。實驗獨立重復(fù)三次，組間比較使用獨立樣本t檢驗，誤差線為標準誤。與對照組比較，*p<0.05,**p<0.01。

4、paqg的細胞毒性實驗

本發(fā)明檢測了paqg在小鼠3t3‐l1前脂肪細胞中的細胞毒性實驗(圖6)。結(jié)果表明，化合物paqg在0～50μm范圍內(nèi)沒有細胞毒性，本實驗過程中用到的化合物最大濃度為20μm，此濃度在安全范圍內(nèi)。

圖6.在3t3‐l1細胞中，化合物paqg的細胞毒性實驗。實驗獨立重復(fù)三次。

實施例2

按實施例1所得化合物paqg，按化合物與賦形劑重量比1:1或1:2的比例加入賦形劑，制粒壓片。

實施例3：

按實施例1制得化合物paqg，，按常規(guī)膠囊制劑方法制成膠囊。

實施例4：

先按實施例1制得化合物paqg，再按下述方法制成片劑。

片劑：化合物paqg100mg，淀粉適量，玉米漿適量，硬脂酸鎂適量。制備方法：將化合物與助劑混合，過篩，在合適的容器中均勻混合，把得到的混合物制粒壓片。

實施例5：

膠囊劑：化合物paqg100mg，淀粉適量，硬脂酸鎂適量。

制備方法：將化合物paqg與助劑混合，過篩，在合適的容器中均勻混合，把得到的混合物裝入硬明膠膠囊。

實施例6：

片劑：實施例1所得化合物paqg10mg，乳糖180mg，淀粉55mg，硬脂酸鎂5mg；

制備方法：將化合物paqg、乳糖和淀粉混合，用水均勻濕潤，把濕潤后的混合物過篩并干燥，再過篩，加入硬脂酸鎂，然后將混合物壓片，每片重250mg，化合物含量為10mg。

實施例7：

安瓿劑：實施例1所得化合物paqg2mg，氯化鈉10mg；

制備方法：將化合物paqg和氯化鈉溶解于適量的注射用水中，過濾所得溶液，在無菌條件下裝入安瓿瓶中。

實施例8：

膠囊劑：實施例1所得化合物paqg10mg，乳糖187mg，硬脂酸鎂3mg；

制備方法：將化合物與助劑混合，過篩，均勻混合，把得到的混合物裝入硬明膠膠囊，每個膠囊重200mg，活性成分含量為10mg。

實施例9：

食品的制備：

制備方法：取實施例1所得化合物paqg以1:7的比例添加到果醬中，可以增加食品香味，同時也能發(fā)揮保健功效。

實施例10：

食品的制備：

制備方法：取實施例1所得化合物paqg以1:8的比例添加到蜂蜜中，可以增加食品香味，同時也能發(fā)揮保健功效。

實施例11：

含有化合物paqg的乳酸菌飲料配方(w％)：

按常規(guī)制作食品的方法制得本發(fā)明的上述飲料。