本發明屬于生物醫用材料技術領域，特別是涉及一種天然高分子親水凝膠與納米化葉黃素復合膜的制備方法。

背景技術：

近年來研究發現，植物所含的天然葉黃素不僅是一種性能優異的抗氧化劑，可抵御氧自由基在人體內造成細胞與器官損傷，預防機體衰老引發的心血管硬化、冠心病等癥狀[中醫內科雜志,2011,25(4)：22-23.][skinpharmacologyandappliedskinphysiology,2003,15,291–296.]。更重要的是葉黃素是視網膜黃斑的主要色素和抗氧化成分，對維持明視覺和敏銳視覺起著重要作用[photochemphotobiolb,2006,85(3):205-215.]。太陽光中的紫外線及藍光進入眼睛會產生大量自由基，導致白內障，黃斑區退化，甚至癌癥。紫外線一般能被眼角膜及晶狀體過濾掉，但藍光卻可穿透眼球直達視網膜及黃斑，研究認為，黃斑中的葉黃素能通過過濾藍光和猝滅、清除活性氧，消除藍光對眼睛的損害[annualreviewsinnutrition,2003,23,171–201]。具有預防黃斑變性及視網膜色素變性，減少玻璃膜疣的產生，促進黃斑發育，促進視網膜細胞中視紫質再生，預防重度近視及視網膜剝離，緩解視疲勞等一序列功能。

但人體不能合成葉黃素，人體中的葉黃素主要來自食物。葉黃素是一種親油性的物質，不溶于水，對光、熱和氧敏感，不穩定，極易被氧化。而且，與其它類胡蘿卜素一樣，葉黃素晶體的生物利用率很低。近幾年，針對葉黃素不溶于水、生物利用度低的缺點，國內外學者均開展了大量研究工作，采用聚乙二醇-聚己內酯兩親性嵌段共聚物為載體包載葉黃素形成納米膠束，可提高葉黃素的水溶性[天津科技大學學報,2010，04]，采用瞬時高溫油溶和噴霧冷凝法對葉黃素進行微囊化，可改善葉黃素產品的穩定性、異構和高脂溶難吸收等問題[中國食品添加劑,2012(01)：60-65]，利用水溶性低分子量殼聚糖作為載體，采用離子交聯方法制備出葉黃素-殼聚糖納米粒等，可大大提高葉黃素的生物利用度[foodchemistry,2013,141(1):327-337]。

載藥納米微粒是近年來出現的藥物控釋和緩釋的新劑型，應用于水溶性差和不穩定的藥物具有巨大的優勢。它是通過化學或物理的作用，將功能成分分散于生物相容性納米級膠態粒子內部或吸附于表面，有效提高藥物的水溶性和體內外穩定性。

cn201210499309.0公開了一種葉黃素眼用納米乳-溫度敏感型原位凝膠及其制備方法。先將葉黃素制成葉黃素納米乳增加葉黃素的水溶性，并且將乳劑制成納米級增加葉黃素的角膜透過率；再制備成原位凝膠，具有生物粘附性好和組織相容性、生物利用度高的特點。但使用了大量的化學添加劑，對人體有一定影響；且溶膠狀滴眼液在夏季室溫接近或高于體表溫度(眼部溫度接近體表溫度)時，會轉變為凝膠，影響使用。

技術實現要素：

本發明目的在于提供一種純天然原料制劑、便利、穩定的外用護眼貼劑，緩解現代人長期使用電腦、手機熒屏引起的視疲勞和視力損傷。

為達到上述目的，采用技術方案如下：

天然高分子親水凝膠與納米化葉黃素復合膜的制備方法，包括以下步驟：

親水凝膠膜的制備：

以醋酸溶液溶解殼聚糖，調ph5.0～5.5，加熱條件下攪拌加入edta，得到殼聚糖溶液；

取明膠、魔芋多糖以水加熱溶解，調ph中性，加入到上述殼聚糖溶液中；

加入交聯劑，繼續攪拌45～60min，加入甘油，攪拌均勻，消泡；

在加熱板上涂布成2～3mm厚凝膠層，覆上一層蠶絲無紡布，冷卻后揭起，晾干或凍干；

以nahco3水溶液洗滌，取出晾干，得到天然高分子親水凝膠膜；

納米化葉黃素的制備：

60℃攪拌條件下將有機相滴加至第一水相，乙醇揮發完全后繼續攪拌2～3h，適時補充蒸發掉的水份；冷卻至室溫后轉移至第二水相，攪拌混勻得到納米化葉黃素溶液；

所述有機相的配制：按重量份數計將20～30份卵磷脂，10份vite和vita加入至無水乙醇中加熱溶解，冷卻后，加入20～30份葉黃素，震蕩至完全溶解得到有機相；

所述第一水相的配制：取0.3～0.5％g/ml的殼聚糖醋酸溶液，以稀堿溶液調ph至4.5-5.5，加入牛黃酸、豬膽鹽，再加吐溫-20或peg400，混勻，0.2um濾膜過濾，得到第一水相；

所述第二水相的配制：體積百分數為1-2％的甘油/水混合液為第二水相；

親水凝膠負載納米化葉黃素的制備：

將所述親水凝膠膜的凝膠面浸泡在所述納米化葉黃素溶液中，直至溶液被吸收完全，遮光放置至表面干爽，即得天然親水凝膠-納米化葉黃素復合膜。

按上述方案，納米化葉黃素的制備過程中，冷卻至室溫后，以20～30ml/h轉移至第二水相。

按上述方案，親水凝膠負載納米化葉黃素的制備過程中，按每100cm²親水凝膠膜10ml納米化葉黃素溶液的用量進行浸泡。

殼聚糖納米粒作為一種新型的藥物載體，具有廣泛的應用前景，其荷電氨基、羥基和疏水基團可與藥物分子產生廣泛的非共價相互作用，吸附或包裹藥物分子，可作為多種藥物載體，有效提高藥物水溶性和體內外穩定性，增加藥物吸收；其高分子特性和良好的生物相容性及生物可降解性，有利于控制藥物平緩釋放，提高藥物生物利用度，降低藥物的毒副作用。

葉黃素是視網膜黃斑的主要色素和抗氧化成分，能通過過濾藍光和猝滅、清除活性氧，消除藍光對眼睛的損害，對維持明視覺和敏銳視覺，預防黃斑變性及視網膜色素變性具有重要作用。殼聚糖具有良好的生物相容性、親水性，作為納米化藥物載體包裹或攜帶葉黃素，可有效提高葉黃素水溶性、穩定性和生物利用度，同時具有良好的成膜、絮凝、黏膜吸附等物理特性。

本發明將二者性能結合制備得到一種負載納米化葉黃素的天然高分子親水凝膠，同時加入多種生物活性成分和眼部營養精華，用于眼部及周圍皮膚敷貼，緩解長期使用熒屏導致的光損傷和視力疲勞，同時，具有緊致眼部肌膚，促進血液循環，消除黑眼圈的功能。該凝膠膜無任何添加劑和防腐劑，安全無刺激，制備條件溫和，設備簡單，無三廢排放，環保經濟，特別適合作為眼部護理和面部皮膚護理，以及其他經皮給藥的藥物載體或敷料。

以殼聚糖作為載體，通過相轉移法將不穩定的油溶性葉黃素包裹成親水性聚合物納米粒，不僅改善葉黃素的水溶性，且有效提高了葉黃素的穩定性和透皮吸收效率，同時加入了維生素a、維生素e和牛黃酸等活性成分，具有抗氧化，維持正常視覺，保護視細胞的功能。

牛磺酸還具有賦活肌膚細胞的功能，可提供年輕肌膚快速與持久的能量補充和多重保護。

利用天然高分子的結構和性質特點，通過控制ph、溫度、攪拌速度和加入方式等工藝條件，經非共價交聯形成多孔性親水凝膠；以殼聚糖為載體，卵磷脂為乳化劑，吐溫-20和甘油等為助乳化劑和分散劑，通過相轉移法納米化葉黃素形成納米葉黃素水分散體系，再由多孔性親水膜吸附負載，構建成親水凝膠-納米化葉黃素復合膜，不使用任何反應性化學試劑，產品自身具有抗菌抑菌功能，不添加防腐劑，安全可靠。原材料均來源于天然產物，綠色環保。

原料來源于生物體的天然高分子，具有良好的生物相容性和親水性，殼聚糖所帶正電荷與明膠所帶負電荷通過靜電作用發生交聯，無須反應性化學試劑的作用，再由金屬離子介導進一步交聯，形成的網絡結構柔軟、富彈性，且具有較高的強度，與皮膚親和力強，易揭帖，使用簡便，其孔隙可吸收負載納米化葉黃素，并對葉黃素起穩定和保護作用。

利用天然高分子的結構和性質特點，通過控制ph、溫度、攪拌速度和加入方式等工藝條件，經非共價交聯形成多孔性親水凝膠；以殼聚糖為載體，卵磷脂為乳化劑，吐溫-20和甘油等為助乳化劑和分散劑，通過相轉移法納米化葉黃素形成納米葉黃素水分散體系，再由多孔性親水膜吸附負載，構建成親水凝膠-納米化葉黃素復合膜，不使用任何反應性化學試劑，產品自身具有抗菌抑菌功能，不添加防腐劑，安全可靠。原材料均來源于天然產物，綠色環保。

相對于現有技術，本發明有益效果如下：

本發明將納米化葉黃素吸附于多孔性親水凝膠膜上，用于眼部敷貼，納米級顆粒有助于攜帶的葉黃素等活性成分的透皮吸收，減緩長期使用熒屏引起的視網膜藍光損傷，緩解眼部疲勞，同時具有緊致肌膚、補充水分、賦予肌膚活力的美容功效，親水凝膠也可用于攜載其它活性物質，用于頸面部和手部等的肌膚護理，具有補水、清潔和緊致肌膚、促進血液循環等功效。或作為外用藥敷料，具有親膚不粘膚，無刺激，可反復揭帖等特性。

本發明天然高分子親水凝膠與納米化葉黃素復合膜的制備工藝簡單、條件溫和、無三廢排放，膜的厚度、形狀、載藥量均可控，原料易得。

本發明制備的天然高分子親水凝膠與納米化葉黃素構成的復合膜，適用于眼部護理，緩解和預防長期使用熒屏導致的視疲勞和視力損傷；親水凝膠適用于作為清潔、緊致肌膚的敷料和功能成分的載體，可廣泛應用于化妝品行業和醫藥行業。

附圖說明

圖1：凝膠膜對納米化葉黃素和未納米化葉黃素的載藥量比較；

圖2：膜載納米化葉黃素體外透皮釋放率；

圖3：納米化葉黃素與未經納米化的葉黃素穩定性比較。

具體實施方式

為更好地理解本發明，下面結合實施例進一步闡明本發明的內容，但本發明的內容不僅僅局限于下面的實施例。

實施例1：

天然高分子親水凝膠與納米化葉黃素復合膜，它包括如下步驟：

(1)親水凝膠的制備

稱取7.5g殼聚糖，加200ml2％(w/v)的醋酸溶液溶解，電動攪拌均勻，以0.2mol/lnaoh溶液調ph5.0，在80℃水浴條件下，邊攪拌邊加入0.1mol/ledta3.0ml，繼續攪拌均勻；

稱取9.0g明膠，0.3g魔芋多糖于燒杯中，加80ml水加熱溶解，調ph7.0左右；加入到上述殼聚糖溶液中，再以20ml熱水洗滌燒杯，洗滌液轉入殼聚糖溶液中，攪拌均勻，再加入0.5mol/lmgcl2溶液1.8ml，攪拌均勻后，繼續低速攪拌45min，加入3ml甘油和peg400的等量混合液，攪拌均勻，消泡，趁熱在約80℃加熱板上鋪展或涂布成2mm厚凝膠層，冷卻后揭起，晾干，以1％的nahco3快速洗滌2-3次，再無菌水漂洗1min，取出晾干，得到薄膜狀、柔軟、富彈性的天然高分子親水凝膠。

(2)納米葉黃素的制備

有機相的配制：將20mg卵磷脂，10mgvite和vita加入至50ml無水乙醇中，60℃水浴中加熱溶解，冷卻后，加入20mg葉黃素，震蕩至完全溶解，為有機相，裝棕色試劑瓶中封口，鋁箔紙包裹避光，待用；

第一水相的配制：0.3％(w/v)的殼聚糖醋酸溶液50ml，以稀naoh溶液調節ph5.0，加入10mg牛黃酸酸至完全溶解，加100ul吐溫-20，0.2um濾膜過濾，為第一水相；

第二水相的配制：48ml無菌水，加2ml甘油，為第二水相；

取第一水相50ml，60℃水浴中，磁力攪拌下，將有機相以20ml/h的速度恒速滴加至第一水相，并繼續攪拌至無乙醇氣味后，再攪拌2h，適時補充蒸發掉的水份。取出，待溶液冷卻后，磁力攪拌下，以30ml/h的速度恒速將上述溶液轉移至第二水相，繼續攪拌過夜，得到納米化葉黃素。制備過程中含葉黃素的溶液均以鋁箔紙包裹避光。

(3)親水凝膠負載納米化葉黃素

在一潔凈平底盤內倒入12ml納米葉黃素溶液，剪取10cm×10cm親水凝膠膜，將凝膠面向下泡入納米葉黃素溶液中，直至溶液被吸收完全，遮光放置20～30min，至表面干爽，即得天然親水凝膠-納米化葉黃素復合膜。

實施例2：

天然高分子親水凝膠與納米化葉黃素復合膜，它包括如下步驟：

(1)親水凝膠的制備

稱取6.0g殼聚糖，加200ml2％(w/v)的醋酸溶液溶解，電動攪拌均勻，以0.2mol/lnaoh溶液調ph5.0，在80℃水浴條件下，邊攪拌邊加入0.1mol/ledta2.4ml，繼續攪拌均勻；

稱取12g明膠，0.3g魔芋多糖，加80ml水加熱溶解，調ph7.0左右；加入到上述殼聚糖溶液中，再以20ml熱水洗滌燒杯，洗滌液轉入殼聚糖溶液中，攪拌均勻，再加入0.5mol/lmgcl2溶液1.5ml，攪拌均勻后，繼續低速攪拌45min，加入3ml甘油和peg400的等量混合液，攪拌均勻，消泡，趁熱在約80℃加熱板上鋪展或涂布成2mm厚凝膠層，冷卻后揭起，晾干，以1％的nahco3快速洗滌2-3次，再無菌水漂洗1min，取出晾干，得到薄膜狀、柔軟、富彈性的天然高分子親水凝膠。

(2)納米葉黃素的制備

有機相的配制：將30mg卵磷脂，10mgvite和vita加入至50ml無水乙醇中，60℃水浴中加熱溶解，冷卻后，加入25mg葉黃素，震蕩至完全溶解，為有機相，裝棕色試劑瓶中封口，鋁箔紙包裹避光，待用；

第一水相的配制：0.3％(w/v)的殼聚糖醋酸溶液50ml，以稀naoh溶液調節ph5.0，加入10mg牛黃酸酸至完全溶解，加50ul吐溫-20，0.2um濾膜過濾，為第一水相；

第二水相的配制：48ml無菌水，加2ml甘油，為第二水相；

取第一水相50ml，60℃水浴中，磁力攪拌下，將有機相以20ml/h的速度恒速滴加至第一水相，并繼續攪拌至無乙醇氣味后，再攪拌2h，適時補充蒸發掉的水份。取出，待溶液冷卻后，磁力攪拌下，以30ml/h的速度恒速將上述溶液轉移至第二水相，繼續攪拌過夜，得到納米化葉黃素。制備過程中含葉黃素的溶液均以鋁箔紙包裹避光。

(3)親水凝膠負載納米化葉黃素

在一潔凈平底盤內倒入10ml納米葉黃素溶液，剪取10cm×10cm親水凝膠膜，將凝膠面向下泡入納米葉黃素溶液中，直至溶液被吸收完全，遮光放置20～30min，至表面干爽，即得天然親水凝膠-納米化葉黃素復合膜。

實施例3：

天然高分子親水凝膠與納米化葉黃素復合膜，它包括如下步驟：

(1)親水凝膠的制備

稱取7.5g殼聚糖，加200ml2％(w/v)的醋酸溶液溶解，電動攪拌均勻，以0.2mol/lnaoh溶液調ph5.0，在80℃水浴條件下，邊攪拌邊加入0.1mol/ledta2.6ml，繼續攪拌均勻；

稱取12g明膠，0.3g魔芋多糖，加80ml水加熱溶解，調ph7.0左右；加入到上述殼聚糖溶液中，再以20ml熱水洗滌燒杯，洗滌液轉入殼聚糖溶液中，攪拌均勻，再加入0.5mol/lmgcl2溶液1.5ml，攪拌均勻后，繼續低速攪拌45min，加入3ml甘油和peg400的等量混合液，攪拌均勻，消泡，趁熱在約80℃加熱板上鋪展或涂布成2mm厚凝膠層，冷卻后揭起，晾干，以1％的nahco3快速洗滌2-3次，再無菌水漂洗1min，取出晾干，得到薄膜狀、柔軟、富彈性的天然高分子親水凝膠。

(2)納米葉黃素的制備

有機相的配制：將30mg卵磷脂，10mgvite和vita加入至50ml無水乙醇中，60℃水浴中加熱溶解，冷卻后，加入30mg葉黃素，震蕩至完全溶解，為有機相，裝棕色試劑瓶中封口，鋁箔紙包裹避光，待用；

第一水相的配制：0.3％(w/v)的殼聚糖醋酸溶液50ml，以稀naoh溶液調節ph5.0，加入10mg牛黃酸酸至完全溶解，加50ulpeg400，0.2um濾膜過濾，為第一水相；

第二水相的配制：48ml無菌水，加2ml甘油，為第二水相；

取第一水相50ml，60℃水浴中，磁力攪拌下，將有機相以20ml/h的速度恒速滴加至第一水相，并繼續攪拌至無乙醇氣味后，再攪拌2h，適時補充蒸發掉的水份。取出，待溶液冷卻后，磁力攪拌下，以30ml/h的速度恒速將上述溶液轉移至第二水相，繼續攪拌過夜，得到納米化葉黃素。制備過程中含葉黃素的溶液均以鋁箔紙包裹避光。

(3)親水凝膠負載納米化葉黃素

在一潔凈平底盤內倒入10ml納米葉黃素溶液，剪取10cm×10cm親水凝膠膜，將凝膠面向下泡入納米葉黃素溶液中，直至溶液被吸收完全，遮光放置20～30min，至表面干爽，即得天然親水凝膠-納米化葉黃素復合膜。

實施例4：

與實施例1基本相同，不同之處在于：擴大了制備量，親水凝膠的一次制備量達1200ml納米葉黃素的一次制備量達500ml,所得復合膜的性能不受影響。

實施例5：

與實施例1基本相同，不同之處在于：凝膠膜凍干,所得凝膠膜孔隙較大，載藥量增大，強度較低，有一定的溶脹，但不影響載藥和使用。

凝膠膜載藥量測定：將葉黃素樣品用95％乙醇配制成0.25mg/ml溶液，剪取2*2cm²的凝膠膜浸泡約30s，取出用濾紙吸干表面溶液，放置5min，再浸泡，重復上述操作三次，至整塊膜吸藥均勻，藥物充分進入凝膠膜中。將載藥凝膠膜剪碎，加入2ml去離子水，水浴加熱使其充分溶脹，加入2ml丙酮，超聲震蕩30s，重復三次，使葉黃素充分溶解，倒出上清液，殘渣再以2ml丙酮按上述方法抽提兩次，合并上清液，10000rpm離心10min，取上清液，hplc法(日立l2000型高效液相色譜儀，c18分析柱，檢測波長446nm，流動相95％乙腈：5％甲醇，流速1.0ml/nim，進樣量10μl)測定葉黃素含量，共測定5個樣，取平均值，計算凝膠膜的載藥量(ug/cm2)。

按上述方法測得實例3制備的凝膠膜對納米化葉黃素和未納米化葉黃素的載藥量如圖1所示。

膜載納米化葉黃素的體外透皮釋放速率測試方法為：

小鼠眼眶取血(湖北省疾控中心提供，六周齡，10只)，肝素抗凝，加ph7.4的pbs緩沖液稀釋至20ml，3500rpm離心5分鐘，取上清液作為近似模擬體液。取血后小鼠頸椎脫臼處死，剃去腹部毛發，小心剝離腹部皮膚，剪下透皮擴散池外口徑等大的圓片，置ph7.4的pbs緩沖液4℃保存備用。透皮擴散池(15ml，口徑1cm，有效透皮面積0.78cm²)以pbs稀釋血清灌滿，放入磁力攪拌轉子，將小鼠腹部離體皮膚角質層向外貼于瓶口(注意皮膚和溶液液面間不能出現氣泡)，載藥凝膠膜剪成與鼠皮同樣大小的圓片，緊貼于離體皮膚角質層一側，外貼一層保鮮膜防止水分蒸發(皮膚、載藥膜、保鮮膜間不能有氣泡)，蓋上池蓋用橡皮筋固定。裝置固定好后置于磁力攪拌器上36℃水浴中，低速攪拌，分別于10min，20min，30min，40min，50min，60min從擴散池支管口取樣100ul，每次取樣后立即補充等量血清pbs溶液。各樣液中分別加入丙酮50ul，超聲震蕩30s，10000rpm離心10min，取上清液，hplc法(日立l2000型高效液相色譜儀，c18分析柱，檢測波長446nm，流動相95％乙腈：5％甲醇，流速1.0ml/nim，進樣量10μl)測定葉黃素含量，按擴散池中溶液體積換算出葉黃素的皮膚透過量。

以單位面積膜的葉黃素透過量表示葉黃素的透皮率，實例3制備的載藥凝膠按上述方法測得的透皮率如圖2所示，納米化葉黃素可透過皮膚平穩釋放，未經納米化的葉黃素透皮釋放明顯低于納米化葉黃素的透皮釋放量；以透過葉黃素的量占凝膠膜有效面積負載葉黃素量之比表示，或以透過皮膚的絕對量表示，60min時分別達到26.0％或20.33ug/cm²。

本發明納米化葉黃素與未經納米化的葉黃素穩定性比較：

葉黃素的穩定性以自然放置一定時間時其氧化率表示，即放置前葉黃素含量與放置后葉黃素含量之差占放置前葉黃素含量的百分比。

其中葉黃素濃度測定方法：

葉黃素最大吸收波長在445nm處，準確稱取葉黃素標準品20.0mg，加20ml丙酮溶解，配制成1mg/ml的儲備液，再稀釋至25ug/ml，為工作液，分別取工作液0.40ml，0.80ml，1.20ml，1.60ml，2.00ml，2.40ml，再加丙酮補足至4.00ml，以丙酮調零，測定445nm處吸光值a，繪制葉黃素標準曲線，得曲線方程a＝0.0359c(r²＝0.9992)(a為溶液的吸光值，c為測定液中葉黃素濃度ugml)。

樣品處理：

取實例3制備的納米化葉黃素溶液，以去離子水稀釋至葉黃素總濃度約250ug/ml，為納米化葉黃素樣品。

同時配制250ug/ml的葉黃素95％乙醇溶液，為未納米化葉黃素樣品。

分別取兩種樣品各1ml，加入3ml丙酮，超聲震蕩30s，間歇3min，再超聲30s，10000rpm離心10min，取上清液，以丙酮調零，測445nm處吸光值，根據工作曲線計算兩種樣品各自葉黃素的含量。剩余樣品置棕色容量瓶中，蓋緊瓶蓋，室溫放置，第15天以同樣方法測定各自葉黃素含量，以15后葉黃素含量的減少占原葉黃素含量的百分比表示葉黃素的氧化率，氧化率越高穩定性越差。

如圖3，未納米化葉黃素的95％乙醇溶液密封室溫放置15天，葉黃素的氧化率達22.20％，是納米化葉黃素水溶液(15天葉黃素氧化率5.58％)的3倍多。納米化后可有效提高葉黃素的水溶性和穩定性。

本發明的復合膜制備各原料用量以及工藝參數(如ph、時間等)在上述區間內取值，都能實現本發明，在此不一一列舉實施例。