本發(fā)明屬聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體制備與應(yīng)用，具體為包封疏水性藥物a-317491的糖脂聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體及制備方法。

背景技術(shù)：

疼痛是子宮內(nèi)膜異位癥的主要臨床表現(xiàn)癥狀，主要采用激素和手術(shù)治療。激素療法副作用大，療效不確切，手術(shù)治療易復(fù)發(fā)，因此，探索藥物治療的新方法是內(nèi)異疼痛新療法發(fā)展的重要方向。atp及其p2x3受體可能在內(nèi)異癥疼痛敏化及信息傳遞中發(fā)揮了重要作用，

a-317491是p2x3選擇性受體拮抗劑，可抑制atp激活p2x3受體引起的ca²⁺內(nèi)流，抑制動(dòng)作電位產(chǎn)生，抑制疼痛。a-317491(5-[(3-phenoxyphenyl)methyl-[(1s)-1,2,3,4-tetrahydronaphthalen-1-yl]carbamoyl]benzene-1,2,4-tricarboxylicacid)作用于p2x3受體高表達(dá)的內(nèi)異病灶，一般情況下，藥物很難分布到該作用位點(diǎn)，藥物療效差。因此，采用包封a-317491的藥物傳遞系統(tǒng)顯得尤為重要。a-317491的結(jié)構(gòu)式如下：

殼聚糖-硬脂酸嫁接物通過硬脂酸的羧基與殼聚糖上活性氨基的化學(xué)嫁接，合成的“糖脂結(jié)構(gòu)”兩親性陽離子嫁接物，能在水性介質(zhì)中自聚集形成膠束，并具有負(fù)載親、疏水性化療藥物和生物大分子藥物的能力。但其存在載藥能力有限的潛在局限性。

納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體，由固體脂質(zhì)和液體脂質(zhì)組成，具有包封難溶性藥物的特有優(yōu)勢。納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體可實(shí)現(xiàn)a-317491的有效包封，但存在針對內(nèi)異病灶p2x3高表達(dá)部位的有效分布問題。本課題組前期研究顯示，糖脂聚合物膠束在大鼠異位內(nèi)膜組織有較好分布。因此，采用糖脂聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體給藥，有可能實(shí)現(xiàn)a-317491的內(nèi)異疼痛有效治療。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種糖脂聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體，由殼聚糖-硬脂酸嫁接物、單硬脂酸甘油酯、油酸和疏水性藥物a-317491組成，其組成的重量百分比為：50.0～90.9wt％的殼聚糖-硬脂酸嫁接物，7.27～40.0wt％的單硬脂酸甘油酯，1.82～10.0wt％的油酸，0或3.23wt％的a-317491。

本發(fā)明所使用的殼聚糖脂肪酸嫁接物已為國家發(fā)明專利“熒光標(biāo)記疏水改性殼聚糖聚合物及制備方法和應(yīng)用”(專利號：zl2005100507981)；和“表面修飾疏水改性殼寡糖聚合物給藥膠團(tuán)及其制備方法”(專利號：zl200610051601.0)所涵蓋。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述的糖脂聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的制備方法，通過以下步驟實(shí)現(xiàn)：

(1)首先采用專利號：zl200610051601.0的方法合成殼聚糖-硬脂酸嫁接物：取硬脂酸0.13g，碳二亞胺(edc)0.54g，精密稱定，溶于10ml無水乙醇，60℃活化50min。另取殼聚糖0.3g，精密稱定，溶于20ml去離子水，加熱至60℃。將上述乙醇溶液緩慢滴加至殼聚糖水溶液，60℃磁力攪拌反應(yīng)12h。將終反應(yīng)液置于透析袋中，去離子水透析48h。透析液冷凍干燥，凍干粉末分散于20ml無水乙醇，水浴超聲，加熱、趁熱0.45μm微孔濾膜過濾，除去未反應(yīng)的硬脂酸，重復(fù)3次。濾餅復(fù)溶于水，冷凍干燥，得殼聚糖-硬脂酸嫁接物；

(2)分別取單硬脂酸甘油酯、油酸和a-317491，質(zhì)量比為8:2:0/1。溶于無水乙醇，50℃加熱溶解，配成脂質(zhì)濃度25mg/ml的溶液。取泊洛沙姆188，置于去離子水，50℃加熱溶解，配成濃度為0.1wt％的溶液。400rpm磁力攪拌條件下，將溶有脂質(zhì)的乙醇溶液注入水溶液，體積比為1:10，攪拌5min，得包封a-317491的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體分散液，脂質(zhì)濃度約為2.5mg/ml，制備未包封/包封a-317491的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體溶液；

(3)取殼聚糖-硬脂酸嫁接物，加入去離子水溶解，配成5mg/ml的殼聚糖-硬脂酸溶液，加入0.2～2倍體積的濃度為2.5mg/ml的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體分散液，殼聚糖-硬脂酸與納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的質(zhì)量比為1～10，室溫20rpm的速度緩慢震蕩10min，得糖脂聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體。5mg/ml的殼聚糖-硬脂酸溶液加入同體積的濃度為2.5mg/ml的包封a-317491的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體分散液，室溫20rpm的速度緩慢震蕩10min，得包封a-317491的糖脂聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體。

本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供所述的糖脂聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體在制備抗內(nèi)異疼痛藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益之處是：a-317491為p2x3選擇性受體拮抗劑，可有效抑制疼痛信號的傳導(dǎo)，然而其水難溶，不利于臨床用藥，該發(fā)明利用納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體實(shí)現(xiàn)對疏水藥物a-317491的包封，增強(qiáng)其在水性介質(zhì)中的溶解度。殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體，吸附且分布于納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體外周，可發(fā)揮異位子宮內(nèi)膜靶向的作用，增強(qiáng)該納米載體及藥物在異位內(nèi)膜組織的分布，利于藥物分子在子宮內(nèi)異部位的濃度增加，提高抗子宮內(nèi)膜異位癥疼痛的療效。

附圖說明

圖1為糖脂聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體(a)、包封a-317491的糖脂聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體(b)的透射電鏡照片。

圖2為糖脂聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體、納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體、殼聚糖-硬脂酸嫁接物在子宮內(nèi)膜異位癥模型裸鼠體內(nèi)不同組織器官的半定量分布圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明結(jié)合附圖和實(shí)例作進(jìn)一步的說明。

實(shí)施例1

(1)殼聚糖-硬脂酸嫁接物的合成

取硬脂酸0.13g，碳二亞胺(edc)0.54g，精密稱定，溶于10ml無水乙醇，60℃活化50min。另取上述殼聚糖0.3g，精密稱定，溶于20ml去離子水，加熱至60℃。將上述乙醇溶液緩慢滴加至殼聚糖水溶液，60℃磁力攪拌反應(yīng)12h。將終反應(yīng)液置于透析袋中，去離子水透析48h。透析液冷凍干燥，凍干粉末分散于20ml無水乙醇，水浴超聲，加熱、趁熱0.45μm微孔濾膜過濾，除去未反應(yīng)的硬脂酸，重復(fù)3次。濾餅復(fù)溶于水，冷凍干燥，得殼聚糖-硬脂酸嫁接物。

(2)納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的制備

取24mg單硬脂酸甘油酯，6mg油酸，精密稱定，溶于3.0ml無水乙醇，50℃水浴溶解。取30mg泊洛沙姆188，精密稱定，置于30ml去離子水，加熱至50℃。400rpm磁力攪拌條件下，將溶有脂質(zhì)的乙醇溶液注入水溶液，攪拌5min，得納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體分散液。

(3)糖脂聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的制備

取25mg殼聚糖-硬脂酸嫁接物，加入5ml去離子水溶解，得5mg/ml的膠束溶液，加入10ml濃度為2.5mg/ml的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體分散液，室溫緩慢震蕩10min，得糖脂聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體。

經(jīng)測定糖脂聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的電位為25.4±0.2mv。

實(shí)施例2

(1)納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的制備

取24mg單硬脂酸甘油酯，6mg油酸，精密稱定，溶于3.0ml無水乙醇，50℃水浴溶解。取30mg泊洛沙姆188，精密稱定，置于30ml去離子水，加熱至50℃。400rpm磁力攪拌條件下，將溶有脂質(zhì)的乙醇溶液注入水溶液，攪拌5min，得納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體分散液。

(2)糖脂聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的制備

取25mg殼聚糖-硬脂酸嫁接物，加入5ml去離子水溶解，得5mg/ml的膠束溶液，加入5ml濃度為2.5mg/ml的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體分散液，室溫緩慢震蕩10min，得糖脂聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體。

經(jīng)測定糖脂聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的電位為27.0±0.9mv。

實(shí)施例3

(1)納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的制備

取24mg單硬脂酸甘油酯，6mg油酸，精密稱定，溶于3.0ml無水乙醇，50℃水浴溶解。取30mg泊洛沙姆188，精密稱定，置于30ml去離子水，加熱至50℃。400rpm磁力攪拌條件下，將溶有脂質(zhì)的乙醇溶液注入水溶液，攪拌5min，得納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體分散液。

(2)糖脂聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的制備

取25mg殼聚糖-硬脂酸嫁接物，加入5ml去離子水溶解，得5mg/ml的膠束溶液，加入2ml濃度為2.5mg/ml的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體分散液，室溫緩慢震蕩10min，得糖脂聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體。

經(jīng)測定糖脂聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的電位為23.8±0.6mv。

實(shí)施例4

(1)納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的制備

取24mg單硬脂酸甘油酯，6mg油酸，精密稱定，溶于3.0ml無水乙醇，50℃水浴溶解。取30mg泊洛沙姆188，精密稱定，置于30ml去離子水，加熱至50℃。400rpm磁力攪拌條件下，將溶有脂質(zhì)的乙醇溶液注入水溶液，攪拌5min，得納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體分散液。

(2)糖脂聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的制備

取25mg殼聚糖-硬脂酸嫁接物，加入5ml去離子水溶解，得5mg/ml的膠束溶液，加入1ml濃度為2.5mg/ml的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體分散液，室溫緩慢震蕩10min，得糖脂聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體。

經(jīng)測定糖脂聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的電位為20.9±0.6mv。

實(shí)施例5

(1)包封a-317491的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的制備

取24mg單硬脂酸甘油酯，6mg油酸，3mga-317491，精密稱定，溶于3.0ml無水乙醇，50℃水浴溶解。取30mg泊洛沙姆188，精密稱定，置于30ml去離子水，加熱至50℃。400rpm磁力攪拌條件下，將溶有脂質(zhì)的乙醇溶液注入水溶液，攪拌5min，得包封a-317491的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體分散液。

(2)包封a-317491的糖脂聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的制備

取25mg殼聚糖-硬脂酸嫁接物，加入5ml去離子水溶解，得5mg/ml的膠束溶液，加入5ml濃度為2.5mg/ml的a-317491納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體分散液，室溫緩慢震蕩10min，得包封a-317491的糖脂聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體。

采用微粒粒度與表面電位分析儀，測定包封a-317491的糖脂聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的粒徑和表面電位。經(jīng)測定包封a-317491的糖脂聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的粒徑為48.1±5.2nm，電位為28.3±0.4mv。包封藥物前后糖脂修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的外觀形態(tài)見附圖1，呈球形，粒徑與微粒粒度與表面電位分析儀測定結(jié)果一致。

實(shí)施例6

(1)包封a-317491的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的制備

取24mg單硬脂酸甘油酯，6mg油酸，3mga-317491，精密稱定，溶于3.0ml無水乙醇，50℃水浴溶解。取30mg泊洛沙姆188，精密稱定，置于30ml去離子水，加熱至50℃。400rpm磁力攪拌條件下，將溶有脂質(zhì)的乙醇溶液注入水溶液，攪拌5min，得包封a-317491的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體分散液。

(2)包封a-317491的糖脂聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的制備

取25mg殼聚糖-硬脂酸嫁接物，加入5ml去離子水溶解，得5mg/ml的膠束溶液，加入5ml濃度為2.5mg/ml的包封a-317491納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體分散液，室溫緩慢震蕩10min，得包封a-317491的糖脂聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體。

(3)包封a-317491的糖脂聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體載藥量及包封率測定

采用高效液相色譜法，測定包封a-317491的糖脂聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的載藥量和包封率。色譜條件：c18反相色譜柱，流動(dòng)相a：h2o(0.05％三氟乙酸)，流動(dòng)相b：乙腈(0.05％三氟乙酸)，梯度洗脫(0.0min，70％a和30％b；8.0min，10％a和90％b；13.0min，10％a和90％b；13.1min，70％a和30％b；16min，70％a和30％b)，流速：1.0ml/min，檢測波長210nm，進(jìn)樣量：50μl，柱溫30℃。包封a-317491的糖脂聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的載藥量為2.10±0.08％，包封率為64.4±2.57％，有效包封藥物。

實(shí)施例7

糖脂聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體、納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體、殼聚糖-硬脂酸嫁接物在內(nèi)異模型裸鼠的體內(nèi)分布。采用近紅外染料dir標(biāo)記，考察上述三種納米載體的體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)分布過程。

(1)取10mg殼聚糖-硬脂酸嫁接物，精密稱定，溶于2ml去離子水，探頭超聲20次(400w，工作2s停3s)，得5mg/ml的膠束溶液。按照1％投藥量，逐滴加入dir/二甲基亞砜溶液，室溫?cái)嚢?h，移至透析袋(mwco3.5kda)，避光去離子水透析12h。透析液定容，離心取上清，得dir標(biāo)記的殼聚糖-硬脂酸嫁接物溶液。

(2)取24mg單硬脂酸甘油酯，6mg油酸，精密稱定，溶于3.0ml無水乙醇，50℃水浴溶解。按1％投藥量，向乙醇中加入dir/二甲基亞砜溶液。取30mg泊洛沙姆188，精密稱定，置于30ml去離子水，加熱至50℃。400rpm磁力攪拌條件下，將乙醇溶液注入水溶液，攪拌5min，得dir標(biāo)記的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體。

(3)取25mg殼聚糖-硬脂酸嫁接物，加入5ml去離子水溶解，得5mg/ml的膠束溶液，加入5ml濃度為2.5mg/ml的dir標(biāo)記的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體分散液，室溫緩慢震蕩10min，得dir標(biāo)記的糖脂聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體。

(4)取3只內(nèi)異裸鼠，尾靜脈分別注射dir標(biāo)記的殼聚糖-硬脂酸嫁接物溶液、dir標(biāo)記的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體分散液和dir標(biāo)記的糖脂聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體分散液各0.2ml。8、12、24、36、48h后，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，活體熒光成像觀察三種載體的內(nèi)異裸鼠體內(nèi)分布，并拍攝熒光照片。激發(fā)波長設(shè)置為704nm，發(fā)射波長范圍為740nm至950nm，濾光片為nir。48h裸鼠頸椎脫臼處死，取出病灶、心、肝、脾、肺、腎、大腦、胃、小腸、骨、肌肉，稱重并拍攝納米載體的分布照片。熒光半定量分析，計(jì)算不同組織的每克質(zhì)量的熒光強(qiáng)度值，見附圖2。糖脂聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體在內(nèi)膜異位病灶的分布與納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體相比，有明顯增強(qiáng)。