本發(fā)明屬聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體制備與應(yīng)用,具體為包封疏水性藥物a-317491的糖脂聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體及制備方法。
背景技術(shù):
疼痛是子宮內(nèi)膜異位癥的主要臨床表現(xiàn)癥狀,主要采用激素和手術(shù)治療。激素療法副作用大,療效不確切,手術(shù)治療易復(fù)發(fā),因此,探索藥物治療的新方法是內(nèi)異疼痛新療法發(fā)展的重要方向。atp及其p2x3受體可能在內(nèi)異癥疼痛敏化及信息傳遞中發(fā)揮了重要作用,
a-317491是p2x3選擇性受體拮抗劑,可抑制atp激活p2x3受體引起的ca2+內(nèi)流,抑制動(dòng)作電位產(chǎn)生,抑制疼痛。a-317491(5-[(3-phenoxyphenyl)methyl-[(1s)-1,2,3,4-tetrahydronaphthalen-1-yl]carbamoyl]benzene-1,2,4-tricarboxylicacid)作用于p2x3受體高表達(dá)的內(nèi)異病灶,一般情況下,藥物很難分布到該作用位點(diǎn),藥物療效差。因此,采用包封a-317491的藥物傳遞系統(tǒng)顯得尤為重要。a-317491的結(jié)構(gòu)式如下:
殼聚糖-硬脂酸嫁接物通過硬脂酸的羧基與殼聚糖上活性氨基的化學(xué)嫁接,合成的“糖脂結(jié)構(gòu)”兩親性陽離子嫁接物,能在水性介質(zhì)中自聚集形成膠束,并具有負(fù)載親、疏水性化療藥物和生物大分子藥物的能力。但其存在載藥能力有限的潛在局限性。
納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體,由固體脂質(zhì)和液體脂質(zhì)組成,具有包封難溶性藥物的特有優(yōu)勢。納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體可實(shí)現(xiàn)a-317491的有效包封,但存在針對內(nèi)異病灶p2x3高表達(dá)部位的有效分布問題。本課題組前期研究顯示,糖脂聚合物膠束在大鼠異位內(nèi)膜組織有較好分布。因此,采用糖脂聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體給藥,有可能實(shí)現(xiàn)a-317491的內(nèi)異疼痛有效治療。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種糖脂聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體,由殼聚糖-硬脂酸嫁接物、單硬脂酸甘油酯、油酸和疏水性藥物a-317491組成,其組成的重量百分比為:50.0~90.9wt%的殼聚糖-硬脂酸嫁接物,7.27~40.0wt%的單硬脂酸甘油酯,1.82~10.0wt%的油酸,0或3.23wt%的a-317491。
本發(fā)明所使用的殼聚糖脂肪酸嫁接物已為國家發(fā)明專利“熒光標(biāo)記疏水改性殼聚糖聚合物及制備方法和應(yīng)用”(專利號:zl2005100507981);和“表面修飾疏水改性殼寡糖聚合物給藥膠團(tuán)及其制備方法”(專利號:zl200610051601.0)所涵蓋。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述的糖脂聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的制備方法,通過以下步驟實(shí)現(xiàn):
(1)首先采用專利號:zl200610051601.0的方法合成殼聚糖-硬脂酸嫁接物:取硬脂酸0.13g,碳二亞胺(edc)0.54g,精密稱定,溶于10ml無水乙醇,60℃活化50min。另取殼聚糖0.3g,精密稱定,溶于20ml去離子水,加熱至60℃。將上述乙醇溶液緩慢滴加至殼聚糖水溶液,60℃磁力攪拌反應(yīng)12h。將終反應(yīng)液置于透析袋中,去離子水透析48h。透析液冷凍干燥,凍干粉末分散于20ml無水乙醇,水浴超聲,加熱、趁熱0.45μm微孔濾膜過濾,除去未反應(yīng)的硬脂酸,重復(fù)3次。濾餅復(fù)溶于水,冷凍干燥,得殼聚糖-硬脂酸嫁接物;
(2)分別取單硬脂酸甘油酯、油酸和a-317491,質(zhì)量比為8:2:0/1。溶于無水乙醇,50℃加熱溶解,配成脂質(zhì)濃度25mg/ml的溶液。取泊洛沙姆188,置于去離子水,50℃加熱溶解,配成濃度為0.1wt%的溶液。400rpm磁力攪拌條件下,將溶有脂質(zhì)的乙醇溶液注入水溶液,體積比為1:10,攪拌5min,得包封a-317491的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體分散液,脂質(zhì)濃度約為2.5mg/ml,制備未包封/包封a-317491的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體溶液;
(3)取殼聚糖-硬脂酸嫁接物,加入去離子水溶解,配成5mg/ml的殼聚糖-硬脂酸溶液,加入0.2~2倍體積的濃度為2.5mg/ml的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體分散液,殼聚糖-硬脂酸與納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的質(zhì)量比為1~10,室溫20rpm的速度緩慢震蕩10min,得糖脂聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體。5mg/ml的殼聚糖-硬脂酸溶液加入同體積的濃度為2.5mg/ml的包封a-317491的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體分散液,室溫20rpm的速度緩慢震蕩10min,得包封a-317491的糖脂聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供所述的糖脂聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體在制備抗內(nèi)異疼痛藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的有益之處是:a-317491為p2x3選擇性受體拮抗劑,可有效抑制疼痛信號的傳導(dǎo),然而其水難溶,不利于臨床用藥,該發(fā)明利用納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體實(shí)現(xiàn)對疏水藥物a-317491的包封,增強(qiáng)其在水性介質(zhì)中的溶解度。殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體,吸附且分布于納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體外周,可發(fā)揮異位子宮內(nèi)膜靶向的作用,增強(qiáng)該納米載體及藥物在異位內(nèi)膜組織的分布,利于藥物分子在子宮內(nèi)異部位的濃度增加,提高抗子宮內(nèi)膜異位癥疼痛的療效。
附圖說明
圖1為糖脂聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體(a)、包封a-317491的糖脂聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體(b)的透射電鏡照片。
圖2為糖脂聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體、納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體、殼聚糖-硬脂酸嫁接物在子宮內(nèi)膜異位癥模型裸鼠體內(nèi)不同組織器官的半定量分布圖。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明結(jié)合附圖和實(shí)例作進(jìn)一步的說明。
實(shí)施例1
(1)殼聚糖-硬脂酸嫁接物的合成
取硬脂酸0.13g,碳二亞胺(edc)0.54g,精密稱定,溶于10ml無水乙醇,60℃活化50min。另取上述殼聚糖0.3g,精密稱定,溶于20ml去離子水,加熱至60℃。將上述乙醇溶液緩慢滴加至殼聚糖水溶液,60℃磁力攪拌反應(yīng)12h。將終反應(yīng)液置于透析袋中,去離子水透析48h。透析液冷凍干燥,凍干粉末分散于20ml無水乙醇,水浴超聲,加熱、趁熱0.45μm微孔濾膜過濾,除去未反應(yīng)的硬脂酸,重復(fù)3次。濾餅復(fù)溶于水,冷凍干燥,得殼聚糖-硬脂酸嫁接物。
(2)納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的制備
取24mg單硬脂酸甘油酯,6mg油酸,精密稱定,溶于3.0ml無水乙醇,50℃水浴溶解。取30mg泊洛沙姆188,精密稱定,置于30ml去離子水,加熱至50℃。400rpm磁力攪拌條件下,將溶有脂質(zhì)的乙醇溶液注入水溶液,攪拌5min,得納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體分散液。
(3)糖脂聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的制備
取25mg殼聚糖-硬脂酸嫁接物,加入5ml去離子水溶解,得5mg/ml的膠束溶液,加入10ml濃度為2.5mg/ml的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體分散液,室溫緩慢震蕩10min,得糖脂聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體。
經(jīng)測定糖脂聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的電位為25.4±0.2mv。
實(shí)施例2
(1)納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的制備
取24mg單硬脂酸甘油酯,6mg油酸,精密稱定,溶于3.0ml無水乙醇,50℃水浴溶解。取30mg泊洛沙姆188,精密稱定,置于30ml去離子水,加熱至50℃。400rpm磁力攪拌條件下,將溶有脂質(zhì)的乙醇溶液注入水溶液,攪拌5min,得納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體分散液。
(2)糖脂聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的制備
取25mg殼聚糖-硬脂酸嫁接物,加入5ml去離子水溶解,得5mg/ml的膠束溶液,加入5ml濃度為2.5mg/ml的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體分散液,室溫緩慢震蕩10min,得糖脂聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體。
經(jīng)測定糖脂聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的電位為27.0±0.9mv。
實(shí)施例3
(1)納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的制備
取24mg單硬脂酸甘油酯,6mg油酸,精密稱定,溶于3.0ml無水乙醇,50℃水浴溶解。取30mg泊洛沙姆188,精密稱定,置于30ml去離子水,加熱至50℃。400rpm磁力攪拌條件下,將溶有脂質(zhì)的乙醇溶液注入水溶液,攪拌5min,得納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體分散液。
(2)糖脂聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的制備
取25mg殼聚糖-硬脂酸嫁接物,加入5ml去離子水溶解,得5mg/ml的膠束溶液,加入2ml濃度為2.5mg/ml的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體分散液,室溫緩慢震蕩10min,得糖脂聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體。
經(jīng)測定糖脂聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的電位為23.8±0.6mv。
實(shí)施例4
(1)納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的制備
取24mg單硬脂酸甘油酯,6mg油酸,精密稱定,溶于3.0ml無水乙醇,50℃水浴溶解。取30mg泊洛沙姆188,精密稱定,置于30ml去離子水,加熱至50℃。400rpm磁力攪拌條件下,將溶有脂質(zhì)的乙醇溶液注入水溶液,攪拌5min,得納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體分散液。
(2)糖脂聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的制備
取25mg殼聚糖-硬脂酸嫁接物,加入5ml去離子水溶解,得5mg/ml的膠束溶液,加入1ml濃度為2.5mg/ml的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體分散液,室溫緩慢震蕩10min,得糖脂聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體。
經(jīng)測定糖脂聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的電位為20.9±0.6mv。
實(shí)施例5
(1)包封a-317491的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的制備
取24mg單硬脂酸甘油酯,6mg油酸,3mga-317491,精密稱定,溶于3.0ml無水乙醇,50℃水浴溶解。取30mg泊洛沙姆188,精密稱定,置于30ml去離子水,加熱至50℃。400rpm磁力攪拌條件下,將溶有脂質(zhì)的乙醇溶液注入水溶液,攪拌5min,得包封a-317491的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體分散液。
(2)包封a-317491的糖脂聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的制備
取25mg殼聚糖-硬脂酸嫁接物,加入5ml去離子水溶解,得5mg/ml的膠束溶液,加入5ml濃度為2.5mg/ml的a-317491納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體分散液,室溫緩慢震蕩10min,得包封a-317491的糖脂聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體。
采用微粒粒度與表面電位分析儀,測定包封a-317491的糖脂聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的粒徑和表面電位。經(jīng)測定包封a-317491的糖脂聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的粒徑為48.1±5.2nm,電位為28.3±0.4mv。包封藥物前后糖脂修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的外觀形態(tài)見附圖1,呈球形,粒徑與微粒粒度與表面電位分析儀測定結(jié)果一致。
實(shí)施例6
(1)包封a-317491的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的制備
取24mg單硬脂酸甘油酯,6mg油酸,3mga-317491,精密稱定,溶于3.0ml無水乙醇,50℃水浴溶解。取30mg泊洛沙姆188,精密稱定,置于30ml去離子水,加熱至50℃。400rpm磁力攪拌條件下,將溶有脂質(zhì)的乙醇溶液注入水溶液,攪拌5min,得包封a-317491的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體分散液。
(2)包封a-317491的糖脂聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的制備
取25mg殼聚糖-硬脂酸嫁接物,加入5ml去離子水溶解,得5mg/ml的膠束溶液,加入5ml濃度為2.5mg/ml的包封a-317491納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體分散液,室溫緩慢震蕩10min,得包封a-317491的糖脂聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體。
(3)包封a-317491的糖脂聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體載藥量及包封率測定
采用高效液相色譜法,測定包封a-317491的糖脂聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的載藥量和包封率。色譜條件:c18反相色譜柱,流動(dòng)相a:h2o(0.05%三氟乙酸),流動(dòng)相b:乙腈(0.05%三氟乙酸),梯度洗脫(0.0min,70%a和30%b;8.0min,10%a和90%b;13.0min,10%a和90%b;13.1min,70%a和30%b;16min,70%a和30%b),流速:1.0ml/min,檢測波長210nm,進(jìn)樣量:50μl,柱溫30℃。包封a-317491的糖脂聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的載藥量為2.10±0.08%,包封率為64.4±2.57%,有效包封藥物。
實(shí)施例7
糖脂聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體、納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體、殼聚糖-硬脂酸嫁接物在內(nèi)異模型裸鼠的體內(nèi)分布。采用近紅外染料dir標(biāo)記,考察上述三種納米載體的體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)分布過程。
(1)取10mg殼聚糖-硬脂酸嫁接物,精密稱定,溶于2ml去離子水,探頭超聲20次(400w,工作2s停3s),得5mg/ml的膠束溶液。按照1%投藥量,逐滴加入dir/二甲基亞砜溶液,室溫?cái)嚢?h,移至透析袋(mwco3.5kda),避光去離子水透析12h。透析液定容,離心取上清,得dir標(biāo)記的殼聚糖-硬脂酸嫁接物溶液。
(2)取24mg單硬脂酸甘油酯,6mg油酸,精密稱定,溶于3.0ml無水乙醇,50℃水浴溶解。按1%投藥量,向乙醇中加入dir/二甲基亞砜溶液。取30mg泊洛沙姆188,精密稱定,置于30ml去離子水,加熱至50℃。400rpm磁力攪拌條件下,將乙醇溶液注入水溶液,攪拌5min,得dir標(biāo)記的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體。
(3)取25mg殼聚糖-硬脂酸嫁接物,加入5ml去離子水溶解,得5mg/ml的膠束溶液,加入5ml濃度為2.5mg/ml的dir標(biāo)記的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體分散液,室溫緩慢震蕩10min,得dir標(biāo)記的糖脂聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體。
(4)取3只內(nèi)異裸鼠,尾靜脈分別注射dir標(biāo)記的殼聚糖-硬脂酸嫁接物溶液、dir標(biāo)記的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體分散液和dir標(biāo)記的糖脂聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體分散液各0.2ml。8、12、24、36、48h后,腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉,活體熒光成像觀察三種載體的內(nèi)異裸鼠體內(nèi)分布,并拍攝熒光照片。激發(fā)波長設(shè)置為704nm,發(fā)射波長范圍為740nm至950nm,濾光片為nir。48h裸鼠頸椎脫臼處死,取出病灶、心、肝、脾、肺、腎、大腦、胃、小腸、骨、肌肉,稱重并拍攝納米載體的分布照片。熒光半定量分析,計(jì)算不同組織的每克質(zhì)量的熒光強(qiáng)度值,見附圖2。糖脂聚合物修飾納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體在內(nèi)膜異位病灶的分布與納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體相比,有明顯增強(qiáng)。