本發明具體涉及一種胃修復用貽貝來源生物粘合劑及其制備方法。

背景技術：

海洋貽貝屬于軟體動物門瓣腮綱，是沿岸和近海中普遍存在的一種生物，其足絲腺能分泌足絲附著在堅硬的基體上，使它們能在巨浪沖刷下仍緊緊附著于礁石而不分離。這種足絲粘膠的主要成分足絲粘附蛋白(musselfootproteins，mefp)具有高強度、高韌性和防水性。已有文獻報道具有黏附功能的蛋白主要包括mefp-3和mefp-5。

近幾十年，對仿賠貝蛋白粘合劑的研究工作越來越多，并且持續受到了關注，其無細胞毒性，無免疫原性，具有粘接多樣性，因此在醫用方面具有十分廣闊的前景。目前已有美國bdbioscience公司從紫貽貝(mytilusedulis)的足部提取到粘附蛋白，用作細胞和組織黏附劑，該商品已商業化，名稱和貨號分別為bdcell-taktm，cellandtissueadhesive，catalogno.354240，catalogno.354241。該產品可涂覆用于細胞培養和組織切片等的玻片、塑料或金屬表面以增強與樣品的黏附。將此產品涂敷于接觸面后，可承受1.5mpa的壓強。然而由于紫貽貝分泌的黏附蛋白含量極少，從大約10000個貽貝中也僅能提取到1mg黏附蛋白，所以由此獲得的黏附蛋白產品cell-talk^tm價格十分昂貴，1mg高達90美元(practicalrecombinanthybridmusselbioadhesivefp-151，biomaterials.2007)。因此由于貽貝黏附蛋白的提取工作工藝復雜、成本較高且產率較低，從而限制了它的應用。

目前有很多科研團隊和專家在模擬及制備貽貝粘附蛋白方面做了很多的研究工作。這些工作主要包括使用dna基因重組技術來制造粘附蛋白以及合成高分子的仿生。粘著蛋白原在貽貝足腺細胞中被合成時經歷了復雜的糖基化修飾、羥基化修飾及交聯反應，而利用基因工程途徑所得到的粘著蛋白產物則缺少這種嚴格而充分的修飾和加工過程。盡管學者們在體外對其進行了部分糖基化修飾，但所添加的寡糖鏈的數量、羥基化以及交聯程度與天然蛋白質相比均相差甚遠，致使所得蛋白產物的粘度遠遠不及天然蛋白，因此無法獲取理想粘度的粘著蛋白產品。而基于貽貝仿生設計制備的高分子材料(如聚多巴胺粘合劑)，它的生物相容性、安全性亟待改善。而根據文獻報道，這種合成性聚多巴胺粘合劑最多能夠承受20kpa的壓強(mussel-inspiredhyperbranchedpoly(aminoester)polymerasstrongwettissueadhesive,biomaterials.2014)。

所以獲得價格低廉，良好生物相容性，同時具有強大黏附性能的天然貽貝來源的生物粘合劑具有重大意義。

現今用于臟器修復(胃，肝臟)的粘合材料種類多樣，以合成性材料為主。這些合成性材料主要包括：聚乳酸納米薄片(free-standingbiodegradablepoly(lacticacid)nanosheetforsealingoperationsinsurgeryadv.mater.2009),聚乙交酯及其共聚物合成的粘附性材料(mussel-inspirednanofibroussheetforsuture-lessstomachincisionsurgery，chem.commun.2015)。這些材料能夠承受小于500kpa的壓強，然而這些合成型材料的制作過程復雜，此外某些化學成分還會對機體產生毒副作用，影響修復效果。舉例來說，胃作為消化器官，周圍是潮濕的環境，胃的表面也會有各種成分的粘液，此外，機體還會分泌胃酸和各種消化酶，所以用于胃修復的粘合材料除了需要具有良好的生物相容性，強大的粘附能力，還需要具有較佳的防水功能，以及一定抵御胃酸和各種消化酶的能力。

目前來說，從貽貝中提取合成的貽貝黏附蛋白產品cell-talk^tm等粘附劑由于價格昂貴，僅使用極少量應用于各種培養板的包被，或精子細胞、t47d人乳腺癌細胞和嗜中性粒細胞的培養，其在器官修復中的使用以及效果尚未見研究報道。

技術實現要素：

為了解決上述存在的問題，本發明提供了一種利用尿素抽提法從原材料來源廣泛、價格低廉的貽貝(mytilusedulis)中提取粘附成份，低成本制備具有良好生物相容性以及強大黏附性能的貽貝來源防水生物粘合劑方法，可用于胃修復的相關產品中。

本發明所采取的技術方案是：

一種生物粘合劑的制備方法，是取貽貝中厚度不超過4mm的與殼緊密粘附的閉殼肌及其韌帶和殼，加入尿素溶液進行超聲提取，取上清液透析后凍干得到。

優選的，貽貝的種類包括厚殼貽貝、翡翠貽貝、紫貽貝。本發明采用我國東南沿海盛產的厚殼貽貝或翡翠貽貝作為原料，取材方便，價格8～10元一只；如果是批量購買，價格更優惠。紫貽貝一般產自國外。

優選的，取貽貝中厚度為1-3mm的與殼緊密粘附的閉殼肌及其韌帶和殼，加入尿素溶液進行超聲提取。

現有技術中通常都是從貽貝的分泌物中提取粘附成分。而本發明首創，采用不超過4mm的閉殼肌及其韌帶與殼(保留殼)作為提取的對象，取得了良好的效果。

優選的，加入尿素溶液的濃度為6～8m，在0～4℃下進行超聲提取。

優選的，加入尿素溶液的濃度為8m。

優選的，超聲提取的時間為14～16小時,功率55-65khz，強度60％-80％。

優選的，透析時，采用截留分子量大小為3～8kd的透析袋。

優選的，透析時，采用截留分子量大小為5kd的透析袋。

優選的，所述的制備方法包括下列步驟：

1)取活的貽貝，清除臟器，切除大部分閉殼肌，僅留取厚度不超過4mm的與殼緊密粘附的閉殼肌及其韌帶和殼，用預冷的pbs液洗凈；

2)加入預冷的濃度為6～8m的尿素溶液，覆蓋組織表面，0～4℃超聲提取14～16小時；

3)取上清，選取截留分子量大小為3～8kd的透析袋進行透析4～6天；

4)透析后將液體凍干，即得生物粘合劑粗提品；

5)用去離子水溶解粘合劑粗提品，70～100℃水浴2～4小時；

6)離心取上清液；

7)上清液繼續70～100℃水浴1～2小時，離心，獲得可溶性成份；

8)凍干得到水溶性生物粘合劑。

優選的，貽貝的種類包括厚殼貽貝、翡翠貽貝、紫貽貝。本發明采用我國東南沿海盛產的厚殼貽貝或翡翠貽貝作為原料，取材方便，價格8～10元一只。紫貽貝一般產自國外。

優選的，步驟1)留取臨近粘附面，厚度為1-3mm的與殼緊密粘附的閉殼肌及其韌帶和殼。

優選的，步驟2)尿素溶液濃度為8m。

優選的，步驟2)超聲時間為14-16小時，功率55-65khz，強度60％-80％。

優選的，步驟2)和步驟3)中pbs和尿素溶液預冷的溫度為0-4℃。考慮到這些粘附蛋白中存在糖蛋白，為了保證蛋白活性，所以整個過程均在0-4℃的環境下進行。

優選的，步驟3)選取截留分子量大小為5kd的透析袋進行透析。

優選的，步驟5)去離子水溶解粘合劑粗提品，其中每g粘合劑粗提品添加30～50ml的去離子水。

優選的，步驟5)和步驟6)中所述的水浴溫度為70～90℃。

優選的，步驟6)所述的轉速為1500～2000rpm，時間為5～10min。

一種生物粘合劑，是利用上述任一項所述方法制備得到的，包括生物粘合劑粗提品和/或水溶性生物粘合劑。

本發明得到的生物粘合劑粗提品，以及經過精煉以后的水溶性生物粘合劑。其中，生物生物粘合劑粗提品能夠承受>200n的拉力，>770kpa的壓強。水溶性粘合劑則能夠承受170n左右的拉力，350kpa的壓強。均優于現有技術得到的貽貝粘附蛋白的效果。

將生物粘合劑粗提品進行精煉水提的目的是考慮到粘附蛋白的有效成分中包含有糖蛋白，但是非糖蛋白的成分的精煉工藝還在摸索中。

上述任一項所述方法制備得到的生物粘合劑在制備治療胃修復產品中的的應用，所述生物粘合劑包括生物粘合劑粗提品和/或水溶性生物粘合劑。

優選的，所述生物粘合劑粗提品在胃修復應用時，每50mg粗提粘合劑給予80-120ul去離子水溶解(或25mg粗提粘合劑溶于40-60μl水)。

本發明產品由于來自天然提取的貽貝生物中，無毒安全，具有良好的組織親和性，并且展現出較佳的防水功能，可以很好地克服現有仿生材料的粘合劑產品的缺陷。此外，通過動物實驗證實本發明的生物粘合劑具備抵御胃酸和各種消化酶的能力，在胃修復中取得了良好的效果，能夠適用于醫療材料領域，具有更廣泛的應用前景。

上述任一項所述方法制備得到的生物粘合劑在制備粘合產品中的應用，所述生物粘合劑包括生物粘合劑粗提品和/或水溶性生物粘合劑。

本發明的有益效果是：

本發明技術取材于盛產于我國東南沿海的厚殼貽貝或翡翠貽貝，并首創性地將厚度不超過4mm的閉殼肌及其韌帶與殼(保留殼)作為提取的對象，提出得到生物粘合劑。用本發明方法制備的貽貝生物粘合劑，具有產量高、成本低廉、生物相容性好、粘附效果好等特點，還具有較佳的防水功能，具有廣闊的市場前景。

本發明的技術平均可以從每30只貽貝中提取出1.06g粗提粘合劑，以及0.42g水溶性粘合劑。整個制備過程僅需要少量的尿素溶液，配制方便，價格低廉，制備操作便捷。

本發明所制備的生物粘合劑(粗提品)具有防水的性能，在潮濕的環境下粘附在載玻片表面，能夠承受>200n的拉力，>770kpa的壓強。水提后得到的水溶性粘合劑則能夠承受170n左右的拉力，350kpa的壓強。而根據文獻報道，貽貝足部來源的粘蛋白最多能夠承受20kpa的壓強(mussel-inspiredhyperbranchedpoly(aminoester)polymerasstrongwettissueadhesive,biomaterials.2014)。而美國bdbioscience公司從紫貽貝(mytilusedulis)足部提取的粘附蛋白(bdcell-taktm，cellandtissueadhesive)，可承受1.5mpa的壓強(具體信息可見于產品的信息說明)。也即，本發明所獲得貽貝來源粘合劑的粘附能力大大優于現有技術中心提到的仿生材料粘合劑，或是貽貝來源提取的貽貝粘附蛋白的粘附能力。

本發明所獲得生物粘合劑以及相關產品可用于胃修復中。申請人研究中發現，本發明得到的生物粘合劑具有良好的生物相容性、防水性能以及一定的抵御胃酸和各種消化酶的能力，在大鼠胃損傷模型中，經少量的粗提生物粘合劑覆蓋于傷口表面，七天后，損傷的胃表面完全得到修復。所制得的防水粘合劑(粗提粘合劑)在臨床使用中可作為一種生物醫用材料，具有良好的應用前景。

附圖說明

圖1為貽貝來源生物粘合劑實物圖；

圖2為貽貝來源生物粘合劑主要成份分析圖；

圖3為貽貝來源生物粘合劑在載玻片銜接面粘附生物力學圖；

圖4為不同濃度貽貝來源生物粘合劑粗提物在載玻片銜接面粘附生物力學圖；

圖5為貽貝來源生物粘合劑修復胃損傷后的效果示意圖；

圖6為貽貝來源生物粘合劑修復胃組織后he染色結果圖；

圖7為貽貝來源生物粘合劑修復胃組織后masson染色結果圖。

具體實施方式

本發明的原材料選自盛產于我國東南沿海的厚殼貽貝或翡翠貽貝，價格約為8～10元一只，大量購買價格更優。

下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明，但并不局限于此。

實施例1

1)取活的貽貝，清除臟器，切除大部分閉殼肌，僅留取厚度為1-3mm的與貝殼內表面緊密粘附的閉殼肌及其韌帶和殼，用預冷的pbs液洗凈(4℃)；

2)加入8m尿素溶液(4℃)，覆蓋組織表面，4℃超聲抽提16小時；

3)取上清，選取截留分子量大小為5kd透析袋進行透析6天；

4)透析后液體凍干，即得生物粘合劑粗提品。

結果如圖1所示。臨近粘附面的瑤柱組織經過8m尿素溶液過夜處理后，脫離殼的表面，粘性成份保存在尿素溶液中。經過透析、凍干處理后，所得到的凍干粉末即為生物粘合劑(粗提品)。

圖1為貽貝來源生物粘合劑(粗提品)實物圖。a為實施例1中8m尿素溶液過夜處理后臨近粘附面的瑤柱組織脫離了殼的表面。b為經過實施例1中透析、凍干處理后提取的粘性材料(粗提品)大體觀。

實施例2

1)取活的紫貽貝，切除大部分瑤柱組織，僅留取小塊臨近粘附面，2mm的與貝殼內表面緊密黏附的閉殼肌及其韌帶和殼，用冷的pbs液洗凈(4℃)；

2)加入6m尿素溶液(4℃)，覆蓋組織表面即可，4℃超聲抽提14小時；

3)取上清，選取截留分子量大小為5kd透析袋進行透析5天；

4)透析后液體凍干，即得粘合劑粗提品；

5)用去離子水溶解粘合劑粗提品，其中每g粘合劑粗提品添加50ml的去離子水進行溶解，80℃水浴2小時；

6)1500rpm離心15min，取上清；

7)上清繼續80℃水浴1小時，離心，獲得可溶性成份；

8)凍干得到水溶性生物粘合劑。

經過計算，本技術平均可以從每30只貽貝中提取出1.06g粗提粘合劑，和/或0.42g水溶性粘合劑。整個制備過程僅需要少量的尿素溶液，配制方便，價格低廉，制備操作便捷。

實施例3

1)取活的貽貝，切除大部分瑤柱組織(閉殼肌)，僅留取小塊臨近粘附面，1mm的閉殼肌及其韌帶與殼，用冷的pbs液洗凈(4℃)；

2)加入7m尿素溶液(4℃)，覆蓋組織表面即可，4℃超聲抽提15小時；

3)取上清，6-8kd透析袋中透析4天；

4)透析后液體凍干，即得粘合劑粗提品；

5)用去離子水溶解粘合劑粗提品，其中每g粘合劑粗提品添加30ml的去離子水；80℃水浴2小時；

6)2000rpm離心10min，取上清；

7)上清繼續80℃水浴1小時，離心，獲得可溶性成份；

8)凍干得到水溶性生物粘合劑。

實施例4

1)取活的貽貝，切除大部分瑤柱組織，僅留取小塊臨近粘附面，1.5mm的與貝殼內表面緊密黏附的閉殼肌及其韌帶和殼，用冷的pbs液洗凈(4℃)；

2)加入8m尿素溶液(4℃)，覆蓋組織表面即可，4℃超聲抽提15小時；

3)取上清，7kd透析袋中透析5天；

4)透析后液體凍干，即得粘合劑粗提品；

5)用去離子水溶解粘合劑粗提品，其中每g粘合劑粗提品添加40ml的去離子水；80℃水浴2小時；

6)2000rpm離心10min，取上清；

7)上清繼續水浴1小時，離心，獲得可溶性成份；

8)凍干得到水溶性生物粘合劑。

下面對實施例所獲得貽貝來源生物粘合劑(包括粘合劑粗提品和水溶性生物粘合劑)進行分析。

一、貽貝來源生物粘合劑質譜分析

1)吸取已制備好的粗提樣品(實施例1，約30μg)，加入30μlstdbuffer，沸水浴5min，冷卻至室溫。加入200μluabuffer(8murea，150mmtris-hclph8.5)混勻，轉入30kda超濾管離心。加入200μluabuffer離心，棄濾液。加入100μliaa(50mmiaainua)，振蕩1min，避光室溫孵育30min，離心。加入100μluabuffer，離心，重復2次。加入100μl25mmnh4hco3，離心，重復2次。加入40μl25mmnh4hco3同時加入trypsin，酶切過夜后離心。再加入40μl25nmnh4hco3，離心，酸化。

2)分別配置a液和b液。a液為0.1％甲酸的水溶液，b液為0.1％甲酸的乙腈水溶液(乙腈為84％)。色譜柱以95％的a液平衡后，樣品由自動進樣器上樣至trap柱。色譜梯度:0---50min，b液線性梯度從4％到50％；50min---54min，b液線性梯度從50％到100％；54min----60min，b液維持在100％。

3)質譜數據采集:多肽和多肽的碎片的質量電荷比按照下列方法采集:每次全掃描(fullscan)后采集10個碎片圖譜(ms2scan)。

4)數據分析：質譜測試原始文件(rawfile)用mascot2.2軟件檢索相應的數據庫，最后得到鑒定的蛋白質結果。

實驗結果如圖2所示。圖2表示的是粗提成份的基峰圖(圖2a)以及二級質譜圖(圖2b)。通過chemcalc軟件，基于二級質譜圖所顯示的每個峰值，最終篩出100種可能的目標分子式，以及糖基化相關的關鍵酶，糖蛋白的進一步提純還在摸索過程中。

二、貽貝來源生物粘合劑生物力學拉伸

稱取實施例2的樣品，包括25mg的粘合劑粗提品和25mg的水溶性生物粘合劑，分別溶于50ul去離子水中(潮濕環境下實驗)，生物粘合劑在常溫下加入本發明限定的水量，可以獲得口香糖狀粘合劑，混勻后均勻涂抹于兩塊載玻片的接觸界面(接觸面寬2cm，長2.5cm)，按壓兩塊玻片的接觸面，處理半小時后，通過electroforce試驗機(～220n)來檢測粘合劑的拉伸性能。儀器拉伸速率為0.02mm/s，測試三次。處理數據后作應力-應變曲線。

實驗結果如圖3所示。圖3a為經過上述步驟后，兩塊玻片的接觸面緊密地粘附在一起。圖3b為經過實施例3中的生物力學實驗后，所繪制的應力-應變曲線，其中b圖左側為粗提粘合劑的生物力學拉伸圖，右側為水溶性粘合劑的生物力學拉伸圖，其中形變，即兩玻片受力后的接觸長度改變與原來接觸長度的比值；壓強，即兩玻片單位接觸面積上的受力大小。

由圖3可知，將粘性成份均勻涂抹于兩塊載玻片接觸面后，接觸面緊密地粘附在一起。通過粗提粘合劑和水溶性粘合劑應力-應變曲線可以看出，接觸面分別能承受770kpa(>200n的拉力)和350kpa(170n左右的拉力)的壓強，說明所提取的粘性成份具有很強的粘附能力。此外，這兩種粘合劑凍干粉均在潮濕的環境下黏附載玻片接觸面的，可見其有一定的防水性。而根據文獻報道，合成性聚多巴胺粘合劑最多能夠承受20kpa的壓強(mussel-inspiredhyperbranchedpoly(aminoester)polymerasstrongwettissueadhesive,biomaterials.2014)。而美國bdbioscience公司從紫貽貝(mytilusedulis)足部提取的粘附蛋白(bdcell-taktm，cellandtissueadhesive)，可承受1.5mpa的壓強(具體信息可見于產品的信息說明)。通過對比發現，本發明技術所獲得粘性材料效果更佳。

為了研究粘合劑使用時所需添加的最佳水量，稱取一定量的粗提品(25mg)，分別溶于25μl,50μl,100μl去離子水中，混勻后均勻，涂抹于兩塊載玻片的接觸界面(接觸面寬2cm，長2.5cm)，按壓兩塊玻片的接觸面，處理半小時后，通過electroforce試驗機(～220n)來檢測粘合劑的拉伸性能。儀器拉伸速率為0.02mm/s，測試三次。處理數據后作應力-應變曲線，見圖4。

圖4表明：以50μl水溶解粘合劑后所制樣品相比于25μl水溶解所得樣品來說，其能夠承受的力要大。雖然100μl水溶解粘合劑后，其樣品能承受更大的力，但是之后出現了玻片滑脫現象。因此以25mg粘合劑溶于50μl水后所得的樣品具有較好的粘附性能。

三、貽貝來源生物粘合劑修復大鼠胃損傷模型

為了在體內檢測粘合劑對組織臟器缺口的修復作用，我們構建了大鼠胃損傷模型。從南方醫科大學動物中心購買10只sd大鼠，雄性，180～220g。構建胃損傷模型前予禁水4小時，禁食12小時術前處理。手術臺以及手術器械消毒備用。

材料準備：濾紙高溫消毒，烤干。濾紙上均勻涂抹粗提的貽貝來源粘合劑(50mg粗提粘合劑予100ul去離子水溶解，這里所選的粘合劑稀釋比例是綜合生物力學和前期動物預實驗結果得到的，這種濃度對胃損傷切口的修復作用較好，粘合力增強，且未產生毒副作用；其效果優于單純的利用粘合劑粗提品的粉末直接涂敷到胃傷口中的效果；此外，粘合劑以所述比例水稀釋后，性狀發生變化，會變成強粘合性的口香糖狀物質)。稀釋比例實驗見圖4結果。

10％水合氯醛常規麻醉大鼠，將麻醉后大鼠置于手術臺，在腹部沿腹中線切口，暴露腹腔，在胃前壁作一長1cm的切口，將涂有粘合劑的濾紙(1×0.5cm)貼附于胃切口表面，為固定濾紙，采用7-0尼龍線將濾紙固定在胃黏膜表面，將胃組織放入腹腔，關閉腹腔，術后禁水四小時，禁食一天。觀察七天。所有動物實驗程序獲得南方醫科大學動物倫理委員會的許可，并在嚴格遵循《中國實驗動物管理條例》的情況下進行。

圖5為貽貝來源生物粘合劑修復大鼠胃損傷圖。圖5a為經過上述步驟后，粘合劑移植到胃損傷表面的大體圖。圖5b為經過上述步驟后，粘合劑材料治療胃傷7天后修復的胃組織表面大體圖。

由圖5可知，胃部傷口經過粘性材料處理后7天，可見胃損傷表面光滑，未見明顯傷口擴大，出血和感染等現象，傷口恢復較好，修復后的組織和周圍未組織并沒有明顯差異。表明本發明所提取的這種材料有明顯的粘附傷口，促進損傷臟器修復的功能。

本發明產品由于來自天然提取的貽貝生物中，無毒安全，具有良好的組織親和性，并且展現出較佳的防水功能，可以很好地克服現有仿生材料的粘合劑產品的缺陷。此外，通過動物實驗證實本發明的生物粘合劑具備一定抵御胃酸和各種消化酶的能力，在胃修復中取得了良好的效果，能夠適用于醫療材料領域，具有更廣泛的應用前景。

四、修復后胃組織he染色

為了檢測粘合劑修復胃組織的成效，我們采用he染色檢測胃組織各層的修復狀況。10％水合氯醛常規麻醉大鼠，將麻醉后大鼠置于手術臺，在腹部沿腹中線切口，暴露腹腔，找出胃組織，取出胃前壁損傷修復后的胃組織，pbs清洗后予4％多聚甲醛固定組織4小時，30％蔗糖脫水后，將組織放于冷凍臺上，滴上包埋劑。將包埋好的組織夾緊于切片機持承器上，修平組織。調好欲切的厚度(6～8um)。切片。

切片在37度烤箱烘4小時后予he染色。切片分別按照以下程序進行處理：70％酒精(3s)，80％酒精(3s)，90％酒精(3s)，95％酒精(3s)，100％酒精(3s)，100％酒精(3s)，二甲苯(3s)，二甲苯(3s)，蘇木素染色(5min)，流水沖洗(10min)，伊紅染色(5s)，流水沖洗(5min)，中性樹膠封片，采集圖片。

實驗結果如圖6所示，其中圖6b為圖6a的局部放大圖。he結果表明胃組織三層(漿膜層，肌層，粘膜層)經粘合材料治療后修復較好。

五、修復后胃組織masson染色

為了檢測修復胃組織是否出現瘢痕修復，我們采用masson染色檢測膠原纖維增殖狀況。10％水合氯醛常規麻醉大鼠，將麻醉后大鼠置于手術臺，在腹部沿腹中線切口，暴露腹腔，找出胃組織，取出胃前壁損傷修復后的胃組織，pbs清洗后予4％多聚甲醛固定組織4小時，30％蔗糖脫水后，將組織放于冷凍臺上，滴上包埋劑。將包埋好的組織夾緊于切片機持承器上，修平組織。調好欲切的厚度(6～8um)。切片。

切片在37℃烤箱烘4小時后予masson染色。步驟如下：

1)滴加一滴(50-100ul)蘇木素染液染色5-10min。蒸餾水沖掉染液；

2)蒸餾水或自來水沖洗2-5min；

3)滴加一滴(50-100ul)復合染色液染色5min；

4)蒸餾水沖洗2-3s；

5)滴加一滴(50-100ul)磷鉬酸染色1min；

6)甩干；

7)滴加一滴(50-100ul)亮綠染色液染色5min左右；

8)蒸餾水沖洗2-3s；

9)晾干，中性樹膠封片，采集相片。

實驗結果如圖7所示，其中圖7b為圖7a的局部放大圖。masson染色結果表明胃組織經粘合材料治療后修復較好，未見較厚的膠原纖維組織增生，無瘢痕修復過程。

六：價格對比

根據計算本發明的技術平均可以從每30只貽貝中提取出1.06g粗提粘合劑，以及0.42g水溶性粘合劑。貽貝的價格約為8～10元一只。整個制備過程僅需要少量的尿素溶液，配制方便，價格低廉，制備操作便捷。

而美國bdbioscience公司從紫貽貝(mytilusedulis)的足部提取到粘附蛋白，名稱和貨號分別為bdcell-taktmcellandtissueadhesive，catalogno.354240，catalogno.354241。該產品從大約10000個貽貝中也僅能提取到1mg黏附蛋白，所以由此獲得的黏附蛋白產品cell-talktm價格十分昂貴，1mg高達90美元。

通過對比，可以發現本發明所獲得黏附蛋白的技術，操作簡單，價格低廉，所獲產品性價比高，具有良好的應用前景。

上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。