本發(fā)明屬于中醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種胡黃連提取物香草酸的新用途。

背景技術(shù)：

胡黃連（picrorrhizascrophularaeflorapennell）作為我國傳統(tǒng)中藥，首載于《蜀本草》，后各朝代本草書目均有記載，是玄參科植物胡黃連的干燥根莖，為多年生草本植物。其性味苦寒，歸肝、胃、大腸經(jīng)，具有退虛熱、除疳熱、清濕熱的功效，臨床上常作為清虛熱藥使用，為“退肝脾伏熱、濕熱之藥也”。廣泛應(yīng)用于兒科、內(nèi)科及瘍科，對骨蒸勞熱、小兒驚癇、疳積、瀉痢、盜汗、自汗、吐血等癥療效甚佳。

胡黃連是兒科常用藥，《本草品匯精要》中指出“小兒藥中多用之”。李時珍在《本草綱目》中記載到：《秘寶方》中用胡黃連治小兒潮熱往來、盜汗；《全幼心鑒》中用治小兒疳熱肚脹潮熱發(fā)焦；《小兒方訣》中胡黃連丸用治肥熱疳疾；《易簡方》中用治五心煩熱；《保幼大全》中用治小兒自汗盜汗、潮熱往來；《鉤玄》中用治熱痢腹痛；《濟急仙方》用治嬰兒赤目。曾世榮《活幼口議》《小兒衛(wèi)生總微論》中用治小兒疳瀉冷熱不調(diào)、小兒黃癉，是胡黃連治濕熱之例；夏禹鑄《幼科鐵鏡》用治便血日久不止，是用胡黃連清血熱之例；《小兒藥證直訣》所載的胡黃連圓用治虛熱證；李子豐運用藥對胡黃連配紫河車治療厭食癥,李老言胡黃連乃小兒疳熱積氣之峻藥，對久積之癥有特效等。一些文獻中還記載了胡黃連用于外治法的例子，如：《小兒衛(wèi)生總微論》外用治陰腫生瘡；《握靈本草》外用治嬰兒赤目；劉曉輝、牛仁秀等外用治小兒急乳蛾等，以上論述表明胡黃連臨床應(yīng)用甚廣。

胡黃連其性味苦寒，歸肝、胃、大腸經(jīng)，具有退虛熱、除疳熱、清濕熱的功效，臨床上常作為清虛熱藥使用，廣泛應(yīng)用于兒科、內(nèi)科及瘍科，對骨蒸勞熱、小兒驚癇、疳積、瀉痢、盜汗、自汗、吐血等癥療效甚佳。胡黃連為我國傳統(tǒng)的常用中藥之一，始見于五代時期韓保昇所著之《蜀本草》，屬玄參科植物胡黃連的干燥根莖，為多年生草本植物。20世紀70年代以前，我國所用胡黃連均賴印度進口，70年代在我國西藏和云南等地區(qū)發(fā)現(xiàn)了一種多年生草本植物，為印度胡黃連的同屬，故將其命名為西藏胡黃連。研究表明，西藏胡黃連在生藥的形態(tài)、組織結(jié)構(gòu)、苦味度、化學(xué)成分及療效等方面，與印度胡黃連極其相似，因而逐漸替代印度胡黃連，《中華人民共和國藥典》（2005版一部）將其收載并作為法定藥材使用。當(dāng)代藥理學(xué)研究表明，胡黃連的化學(xué)成分按照其化學(xué)結(jié)構(gòu)分，主要為環(huán)烯醚萜類、葫蘆素類、苯乙醇糖苷類及酚苷類，還包括少許甘露醇、胡黃連醇、胡黃連甾醇、香莢蘭乙酮及酚酸等，對于保肝利膽、抗菌消炎、抗哮喘、提高免疫活性、降血糖、保護受損的神經(jīng)細胞及凋亡的心肌細胞等具有顯著的療效。

《胡黃連免煎劑的瀉下作用》（趙懷舟、王小蕓、馮文海、趙敏、宋雨、宋明鎖，山西中醫(yī)，2016年2月第32卷第2期，49-51），文中公開了胡黃連免煎劑具有瀉下作用，但是其發(fā)揮瀉下作用的化學(xué)物質(zhì)是什么，目前尚不清楚，因此有必要對其瀉下作用物質(zhì)進行進一步研究，以期更好的服務(wù)于臨床用藥。

經(jīng)現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，胡黃連的主要化學(xué)成分有環(huán)烯醚萜苷類、葫蘆素類、酚苷類、芳香酸和d-甘露醇。我國許多學(xué)者詳細研究了西藏胡黃連的化學(xué)成分,分離到3個已知的環(huán)烯醚萜苷類,一個已知的酚苷，兩個葫蘆素類苦味苷、酚苷類,還有芳香酸(香莢酸、桂皮酸、阿魏酸)和d-甘露醇。近年來,又從其根部分離到了新的環(huán)烯醚萜苷類化合物pikuroside。因香草酸、肉桂酸等芳香酸類物質(zhì)在胡黃連中含量較少，故有關(guān)胡黃連的文獻中對其活性和作用記載和探討較少。

香草酸又名香莢蘭酸，是胡黃連有效成分之一。胡黃連苷類的結(jié)構(gòu)中分別含有香草酸基、阿魏酸基和桂皮酰基，水解后即為香草酸、阿魏酸和肉桂酸，香草酸是胡黃連的抗菌成分之一，測定其所含的香草酸量,可以作為衡量胡黃連質(zhì)量的指標(biāo)。國內(nèi)外對香草酸及其衍生物的活性研究報道較少，主要集中于抗菌消炎、抗氧化、抑制酪氨酸酶活性、化感作用、調(diào)節(jié)神經(jīng)、促凝血活性等方面。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明為了解決胡黃連瀉下功效不明確的問題，提供了一種胡黃連提取物香草酸的新用途。

本發(fā)明由如下技術(shù)方案實現(xiàn)的：一種胡黃連提取物香草酸的新用途，所述胡黃連提取物香草酸在制備瀉下通便藥物中的應(yīng)用。

前期研究表明，單一胡黃連水煎劑和免煎劑均有瀉下作用，但水煎劑的腸推進作用較免煎劑好，二者有差異（p＜0.05），說明其產(chǎn)生此作用的主要原因是促進腸蠕動加快，但不排除還有其他一些作用機制。而將胡黃連與其他藥物組合成方水煎后卻無明顯的瀉下效果，考慮臨床將胡黃連與其他藥物成方后使用，其活性成分主要為有機酸性物質(zhì)，臨床使用時水煎過程中與共同使用的其他藥物中的堿性成分發(fā)生反應(yīng)，將其瀉下作用抵消，因此臨床應(yīng)用時水煎后瀉下效果消失；臨床免煎劑僅是經(jīng)過單味藥物水提、低溫濃縮、瞬間干燥、制粒、包裝，結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定，未與其他藥物的堿性成分發(fā)生反應(yīng)，因此保留了瀉下功效。

本發(fā)明通過對胡黃連中有效成分進行進一步的瀉下功效的研究，顯示，胡黃連中香草酸是胡黃連致瀉的主要已知成分，香草酸與胡黃連產(chǎn)生瀉下作用密切相關(guān)，且香草酸的相關(guān)性具有統(tǒng)計學(xué)意義。通過多層次對香草酸的瀉下作用進行考察，驗證了香草酸的瀉下活性。

附圖說明

圖1為胡黃連混合對照品的指紋圖譜；圖2為胡黃連飲片的指紋圖譜；圖3為香草酸的回歸方程及標(biāo)準(zhǔn)曲線，r²=0.999；圖4為胡黃連苷i的回歸方程及標(biāo)準(zhǔn)曲線，r²=0.999；圖5為胡黃連苷ii的回歸方程及標(biāo)準(zhǔn)曲線，r²=0.9992；圖6為胡黃連苷iii的回歸方程及標(biāo)準(zhǔn)曲線，r²=0.9994；圖7為肉桂酸的回歸方程及標(biāo)準(zhǔn)曲線，r²=0.999；圖8為胡黃連各劑型及不同溶劑萃取物指紋圖譜，（注：按照從下到上的順序：s1胡黃連乙酸乙酯層；s2胡黃連醇提物；s3胡黃連三聚甲烷層；s4胡黃連免煎劑低劑量；s5胡黃連免煎劑高劑量；s6胡黃連石油醚層；s7胡黃連剩余水層；s8胡黃連水提物；s9胡黃連藥材生粉；s10胡黃連正丁醇層；圖9為指紋圖譜共有峰圖；圖10為香草酸對照品紫外吸收光譜圖與3#峰紫外吸收光譜圖；圖11為胡黃連苷i對照品與14#峰紫外吸收光譜圖；圖12為胡黃連苷ii對照品與10#峰紫外吸收光譜圖；圖13為胡黃連苷iii對照品與15#峰紫外吸收光譜圖；圖14為肉桂酸對照品與16#峰紫外吸收光譜圖；（注:紫外吸收光譜未能完全重合者，說明除主要成分外，還混合有其他化合物）；圖15為供試品混合溶液總離子流圖；圖16為胡黃連對照品混合溶液總離子流圖；圖17為對照品和供試品中14#（胡黃連苷ⅰ）峰質(zhì)譜圖對比圖，其中上圖為對照品，下圖為供試品14#；圖18為對照品和供試品中10#（胡黃連苷ⅱ）峰質(zhì)譜圖對比圖，其中上圖為對照品，下圖為供試品10#；圖19為對照品和供試品中15#（胡黃連苷ⅲ）峰質(zhì)譜圖對照圖，其中上圖為對照品，下圖為供試品15#。

具體實施方式

本發(fā)明依據(jù)上述研究結(jié)果進行進一步對胡黃連中具體成分進行實驗研究，并通過以下實施例來進一步闡述本發(fā)明。

實施例1：胡黃連不同溶劑萃取物的瀉下作用檢測

1.材料：由于前期研究顯示胡黃連水煎劑瀉下效果最好，因此選用胡黃連水煎劑進行萃取。

胡黃連飲片及胡黃連免煎顆粒均由江蘇江陰天江藥業(yè)有限公司提供（批號：1510011），生大黃免煎顆粒劑購于山西省中醫(yī)院藥房（江蘇江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號：1510124）。所有藥材均按預(yù)實驗有效劑量為起始劑量（即低劑量），即3歲小兒15kg用飲片3g為起始劑量。按照灌胃體積20ml/kg灌胃，20g小鼠灌胃體積為0.4ml；胡黃連生藥材由江蘇江陰天江藥業(yè)有限公司提供。

胡黃連生粉：取50g胡黃連飲片用粉碎機多次粉碎后過100目篩，將過篩后的細粉按照相應(yīng)濃度配制需要量，灌胃量為2g/kg。

胡黃連水煎劑：灌胃量為2g/kg，灌胃濃度為0.1g/ml。50g飲片加8倍量蒸餾水煎煮60min，將煎液過100目篩，藥渣續(xù)加6倍量蒸餾水煎煮60min，過篩后將兩次煎液合并濃縮至500ml備用。

胡黃連免煎顆粒：規(guī)格為0.5g（相當(dāng)于飲片3g），按照上述灌胃體積和劑量計算得灌胃量為：胡黃連免煎劑低劑量0.33g/kg，免煎高劑量0.67g/kg。

胡黃連醇提物：為保證提取物的量，將50g胡黃連飲片用95%乙醇回流提取3次。分別為10倍量乙醇回流提取2小時、6倍量乙醇回流提取1.5小時、4倍量乙醇回流提取1小時，分別收集三次藥液，合并后減壓濃縮干燥后得到醇提物干膏為16g，計算出膏率，計算用藥量濃度為0.032g/ml，灌胃量為0.64g/kg。

試劑：石油醚：批號20160511，天津市申泰化學(xué)試劑有限公司。三氯甲烷：批號20150622，天津市申泰化學(xué)試劑有限公司。乙酸乙酯：批號20160427，天津市申泰化學(xué)試劑有限公司。正丁醇：批號20160519，天津市申泰化學(xué)試劑有限公司。

動物：小鼠：km種，spf級，雌雄各半，共48只，體重（25±2）g，來源：北京華阜康生物科技股份有限公司scxk（京）2014-0004，合格證號：11401300048163。

儀器：離心沉淀機：lxj-2，上海醫(yī)用分析儀總廠。超聲波清洗機：m3800—c必能信超聲波機械設(shè)備有限公司。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：re5298a，上海亞榮生化儀器廠。數(shù)顯三用恒溫水箱：江蘇省金壇市金城國勝實驗儀器廠。電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：101—2—s，上海躍進醫(yī)療器械廠。定型濾紙：撫順市民政濾紙廠。電子天平：bp—310s，德國賽多利斯sartorius電子分析天平。高速中藥粉碎機：hx—100，浙江省永康市溪岸五金藥具廠。可調(diào)式電熱套：mh—5000，深圳市科偉達超聲波設(shè)備有限公司。

2.萃取物的制備：取胡黃連生藥材1000g，加10倍量水煎煮120min（水沸騰后開始計算時間），過80目篩后將濾液放入干凈容器中；將藥渣加8倍量的水煎煮90min，過80目篩將濾液收集；將藥渣加6倍量水煎煮60min，過80目篩；將三次濾液合并后減壓濃縮，干燥成膏備用，稱得膏重為385g（出膏率為0.385）。

取胡黃連膏100g，加400ml水，超聲60min，完全溶解后，離心機2000轉(zhuǎn)/min離心10min,取上清液，將沉淀干燥后稱重為20g。將上清液按溶液極性從小到大順序進行依次萃取，先按1:1比例用石油醚萃取3次，合并醚層；后將水層按1:1比例用三氯甲烷萃取3次，合并萃取層；后將水層按1:1比例用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取層；最后將水層按1:1比例用水飽和正丁醇（下簡述為正丁醇）萃取3次，合并萃取層；最后得剩余水層。將各萃取層溶液減壓濃縮干燥成膏備用，稱量得醚層1g、三氯甲烷層4g、乙酸乙酯層8g、正丁醇層18g、剩余水層44g；萃取率分別為：石油醚層0.01125、乙酸乙酯層0.1、三氯甲烷0.05層、正丁醇層0.225、水層0.55。

3.分組與給藥

3.1分組與給藥方法：小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3天，隨機劃分為6組，分別為1組空白組，2組石油醚組，3組乙酸乙酯組，4組三氯甲烷組，5組正丁醇組，6組水層組。每組雌雄各半，1-4號為雌，5-8號為雄。

上午9點開始灌藥，除空白組給予蒸餾水外，其余組分別給予對應(yīng)的藥物，灌胃體積相同，均為20ml/kg；灌胃量（g·kg^-1）為石油醚0.0348、乙酸乙酯0.308、三氯甲烷0.154、正丁醇0.693、剩余水層169.4、空白組給予蒸餾水。灌藥后將小鼠單籠單只飼養(yǎng)，籠底鋪墊定性濾紙，分別觀察和記錄各組小鼠的首次瀉下時間，稱量大便總量、稀便量，測量稀便級，計算稀便率和腹瀉指數(shù)，連續(xù)觀察5h。

3.2觀察指標(biāo)：瀉下指標(biāo)：①稀便率：每只動物所排的稀便量與其所排總便量之比。②稀便級：表示稀便的程度，采用周干南稀便級確定法：以稀便污染所墊濾紙后所形成的污跡面積的大小定級，共分4級,標(biāo)準(zhǔn)如下：1級，污跡直徑＜1.0cm；2級，污跡直徑1.0～2.0cm；3級，2.0cm＜污跡直徑＜3.0cm；4級，污跡直徑≥3.0cm。③腹瀉指數(shù)：稀便率乘以稀便級的值。

統(tǒng)計時先挨個測量每一堆稀便的直徑級數(shù)，然后將該鼠所有的稀便級數(shù)相加除以稀便次，如此得到的平均級數(shù)，即為稀便級。（級數(shù)直徑的測量:若污跡近似圓形就直接測量其直徑；若污跡近似橢圓形或形狀呈不規(guī)則形則測量其最長直徑和近似圓的直徑,兩者相加除以2即為直徑。

腸推進：實驗前將小鼠禁食不禁水24小時，每組灌藥30分鐘后灌含有活性炭粉末的營養(yǎng)糊0.8ml/只，20分鐘后斷頸處死，每組間隔10分鐘。處死后打開腹腔，取出自幽門至回盲部的小腸，不施加任何牽引，平鋪于報紙上，測量其全長和炭末最前端至幽門的距離，計算其與小腸全長的百分比，即碳末推進率。（碳末推進率=碳末在腸內(nèi)推進距離(cm)/小腸全長(cm)×100%）。

3.3統(tǒng)計方法：采用spss17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析處理。對本實驗所獲得的所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用完全隨機的多組樣本均數(shù)比較，采用單因素方差分析,當(dāng)p＜0.05時，認為其有差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義；當(dāng)p＜0.01時，認為其差異顯著。數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，方差齊，且各組數(shù)值之間有統(tǒng)計學(xué)意義，用lsd-t檢驗進行多重比較分析；若方差不齊，采用welch檢驗，在有統(tǒng)計學(xué)意義的基礎(chǔ)上，采用tamhane′st2檢驗進行多重比較。

4.實驗結(jié)果：本實驗采用不同指標(biāo)和參數(shù)，對胡黃連不同溶劑萃取物的瀉下作用進行了系統(tǒng)考察。總體來看，僅乙酸乙酯層和三氯甲烷層有瀉下作用，但只有乙酸乙酯層與空白組相比有顯著差異，說明胡黃連中的致瀉成分主要存在于乙酸乙酯層中。結(jié)果見表1。

表1：不同溶劑萃取物瀉下作用比較

注：與空白對照組比較，*p<0.05，**p<0.01，與三氯甲烷組比較，^δp<0.05，^δδp<0.01；與其他組比較，^#p<0.05，^##p<0.01。

4.1稀便次：經(jīng)方差齊性檢驗得p＜0.05，認為方差不齊，經(jīng)采用welch檢驗得p＜0.01，認為,有統(tǒng)計學(xué)意義。用tamhane′st2檢驗多重比較得：乙酸乙酯組與三氯甲烷組比較有差異（p＜0.05），與其他各組相比有顯著差異（p＜0.01）。

4.2稀便率：經(jīng)方差齊性檢驗得p＜0.05，認為方差不齊，經(jīng)采用welch檢驗得p＜0.01，認為有統(tǒng)計學(xué)意義。用tamhane′st2檢驗多重比較得：乙酸乙酯組與三氯甲烷組比較有差異（p＜0.05），與其他各組相比有顯著差異（p＜0.01）。

4.3稀便級：經(jīng)方差齊性檢驗得p＜0.05，認為方差不齊，經(jīng)采用welch檢驗得f=21.624，p＜0.01，認為有統(tǒng)計學(xué)意義。用tamhane′st2檢驗多重比較得：乙酸乙酯組與三氯甲烷組比較有差異（p＜0.05），與其他各組相比有顯著差異（p＜0.01）。

4.4腹瀉指數(shù)：經(jīng)方差齊性檢驗得p＜0.05，認為方差不齊，經(jīng)采用welch檢驗得p＜0.01，認為有統(tǒng)計學(xué)意義。用tamhane′st2檢驗多重比較得：乙酸乙酯組與三氯甲烷組比較有顯著差異（p＜0.01），與其他各組相比有顯著差異（p＜0.01）。

4.5小腸推進率：經(jīng)方差齊性檢驗得p＞0.05，認為方差齊，經(jīng)采用單因素方差分析得p＜0.01，認為有統(tǒng)計學(xué)意義。用lsd-t檢驗進行多重比較得：乙酸乙酯組與三氯甲烷組比較有顯著差異（p＜0.01），與其他各組相比有顯著差異（p＜0.01）。實驗結(jié)果見表2。

表2：小腸推進率

注：與空白對照組比較，*p<0.05，**p<0.01，與三氯甲烷組比較，^δp<0.05，^δδp<0.01；與其他組比較，^#p<0.05，^##p<0.01。

實施例2：胡黃連指紋圖譜的建立及譜效關(guān)系分析：

1.材料：胡黃連飲片及免煎劑同實施例1中所述。胡黃連苷1：批號111727-200501，于中國藥品生物制品檢定所。胡黃連苷2：批號160730，上海融禾醫(yī)藥科技公司。胡黃連苷3：批號160729，上海融禾醫(yī)藥科技公司。香草酸：批號110776-20150，中國藥品生物制品檢定所。肉桂酸：批號110786-200503，中國藥品生物制品檢定所。甲醇：均勻分析純，廣州化學(xué)試劑廠生產(chǎn)。甲酸：均勻分析純，廣州化學(xué)試劑廠生產(chǎn)。磷酸：均勻分析純，廣州化學(xué)試劑廠生產(chǎn)。

2.試劑制備：對照品制備參考中華人民共和國藥典（2015年版一）。

胡黃連苷ⅰ：精密稱取本品2.69mg，置于容量瓶中，加25ml甲醇，置于超聲波清洗機中，超聲30min，放冷，定容至25ml備用，濃度0.1076mg/ml。

胡黃連苷ⅱ：精密稱取本品5.19mg，置于容量瓶中，加50ml甲醇，置于超聲波清洗機中，超聲30min，放冷，定容至50ml備用，濃度0.1038mg/ml。

胡黃連苷ⅲ：精密稱取本品5.04mg，置于容量瓶中，加50ml甲醇，置于超聲波清洗機中，超聲30min，放冷，定容至50ml備用，濃度0.1008mg/ml。

香草酸：精密稱取本品2.22mg，置于容量瓶中，加25ml甲醇，置于超聲波清洗機中，超聲30min，放冷，定容至25ml備用，濃度0.0888mg/ml。

肉桂酸：精密稱取本品5.13mg，置于容量瓶中，加25ml甲醇，置于超聲波清洗機中，超聲30min，放冷，定容至25ml備用，濃度0.2052mg/ml。

胡黃連混合對照品：精密稱取胡黃連苷ⅰ5.15mg、胡黃連苷ⅱ5.03mg、胡黃連苷ⅲ5.11mg、香草酸5.08mg、肉桂酸5.02mg，置于容量瓶中，加25ml甲醇，置于超聲清洗機中，超聲30min，放冷，定容至50ml備用。各自濃度mg/ml分別為：胡黃連苷ⅰ0.103、胡黃連苷ⅱ0.1006、胡黃連苷ⅲ0.1002、香草酸0.1016、肉桂酸0.1004。

上述試劑分別過0.45μm微孔濾膜備用。

3.供試品制備：

胡黃連飲片：取飲片0.5g，精密稱定后，置于容量瓶中，加甲醇50ml，置于超聲波清洗機中，超聲30min，放冷后定容至50ml備用。

胡黃連生粉：取生藥材適量，粉碎成末后過3號篩（50目），取0.5g粉末精密稱定，置于容量瓶中，加甲醇50ml，置于超聲波清洗機中，超聲30min，放冷后定容至50ml備用。

胡黃連水煎劑：取水煎劑干膏0.1925g（相當(dāng)于生藥材0.5g），精密稱定后，置于容量瓶中，加甲醇50ml，置于超聲波清洗機中，超聲30min，放冷后定容至50ml備用。

胡黃連免煎劑（低）：取胡黃連免煎劑0.0833g（相當(dāng)于生藥材0.5g），置于容量瓶中，加甲醇50ml，置于超聲波清洗機中，超聲30min，放冷后定容至50ml備用。

胡黃連免煎劑（高）：取胡黃連免煎劑0.167g（相當(dāng)于生藥材1g），置于容量瓶中，加甲醇50ml，置于超聲波清洗機中，超聲30min，放冷后定容至50ml備用。

胡黃連醇提物：取胡黃連醇提物0.16g（相當(dāng)于生藥材0.5g），置于容量瓶中，加甲醇50ml，置于超聲波清洗機中，超聲30min，放冷后定容至50ml備用。

胡黃連石油醚層：取醚層0.052g（相當(dāng)于生藥材12g），置于容量瓶中，加甲醇50ml，置于超聲波清洗機中，超聲30min，放冷后定容至50ml備用。

胡黃連乙酸乙酯層：取乙酸乙酯層0.462g（相當(dāng)于生藥材12g），置于容量瓶中，加甲醇50ml，置于超聲波清洗機中，超聲30min，放冷后定容至50ml備用。

胡黃連三氯甲烷層：取三氯甲烷層0.231g（相當(dāng)于生藥材12g），置于容量瓶中，加甲醇50ml，置于超聲波清洗機中，超聲30min，放冷后定容至50ml備用。

胡黃連正丁醇層：取正丁醇層1.04g（相當(dāng)于生藥材12g），置于容量瓶中，加甲醇50ml，置于超聲波清洗機中，超聲30min，放冷后定容至50ml備用。

胡黃連剩余水層：取水層2.51g（相當(dāng)于生藥材12g），置于容量瓶中，加甲醇50ml，置于超聲波清洗機中，超聲30min，放冷后定容至50ml備用。

分別過0.45μm微孔濾膜備用。

4.儀器：高效液相色譜儀：agilenttechologies1200series；色譜柱：agilenteclipsexdbc18柱（150mm*4mm，5μm）。sartorious十萬分之一分析天平：德國賽多利斯公司。真空脫氣機：g1322a。四元泵：g1311a。自動進樣器：g1329a。柱溫箱：g1316a)。dad二極管陣列檢測器：g1315d。hpchemstation色譜工作站。超高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀：型號uplci-class/xevog2xsqtof，waters公司。

5.實驗方法：

5.1胡黃連hplc指紋圖譜確立：色譜條件：色譜柱為agilenteclipsexdbc18柱（150mm*4mm，5μm）；流動相：a為：0.1％h3po4（磷酸），b為：ch3oh（甲醇）。流速：1ml/min；進樣量：10μl；檢測波長：λ=290nm；柱溫：35℃。流動相的洗脫條件見表3。

表3：

5.2胡黃連指紋圖譜：精密吸取混合對照品溶液和胡黃連飲片供試品溶液10μl注入液相色譜儀，所得指紋圖譜見圖1、圖2。

5.3方法學(xué)考察:

(1)重現(xiàn)性實驗：取同一批胡黃連藥材粉末，按照對照品的制備方法進行制備，平行制備6份樣品，分別進樣測定，觀察共有峰的相對保留時間及相對峰面積，結(jié)果見表4、表5。考察胡黃連的樣品指紋圖譜檢測方法的重現(xiàn)性。其共有峰的相對保留時間rsd＜2％，相對峰面積rsd＜2％，表明樣品重復(fù)性實驗良好。

表4：相對保留時間

表5：相對峰面積

（2）精密度實驗：精密吸取各對照品溶液5μl，重復(fù)進樣5次，結(jié)果峰面積值的rsd分別0.4784%、0.5568%、0.6987%、0.4778%及0.5974%，均＜3%，表明儀器精密度良好。結(jié)果見表6。

表6：相對峰面積

（3）線性關(guān)系考察：精密吸取胡黃連混合對照品溶液（濃度分別為胡黃連苷ⅰ0.103mg/ml、胡黃連苷ⅱ0.1006mg/ml、胡黃連苷ⅲ0.1002mg/ml、肉桂酸0.1004mg/ml、香草酸0.1016mg/ml）1、2、5、8、10、15μl，分別注入液相色譜儀，以峰面積為縱坐標(biāo)，以對照品的進樣量（mg）為橫坐標(biāo)，線性回歸得回歸方程顯示有良好的線性關(guān)系。回歸方程及標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3至圖7。其標(biāo)準(zhǔn)曲線進樣量與峰面積見表7。

表7：標(biāo)準(zhǔn)曲線進樣量（mg）與峰面積

5.4胡黃連各劑型及不同溶劑萃取物指紋圖譜：精密吸取不同劑型供試品溶液和不同溶劑萃取物供試品溶液10μl注入液相色譜儀，所得指紋圖譜見圖8。

5.5共有峰：對比各圖相對保留時間和峰面積，找到16個共有峰，結(jié)果見圖9、表8。

表8：胡黃連各劑型及不同溶劑萃取物指紋圖譜共有峰

5.6譜效關(guān)系分析：

采用譜效關(guān)系分析采用小腸推進率。利用spss17.0統(tǒng)計分析軟件計算各指紋峰與小腸推進率的pearson相關(guān)系數(shù),結(jié)果呈正相關(guān)見表9。

表9：胡黃連不同提取物指紋峰峰面積與腸推進率的pearson相關(guān)性分析:正相關(guān)

注：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

因胡黃連煎劑不同溶劑萃取物與腸推進率相關(guān)性分析的相關(guān)系數(shù)均為r＜0.9，故認為其相關(guān)性不大。

結(jié)果：由上表可得出：r＞0.9的有1#、3#、8#、16#峰，但只有3#峰的pearson相關(guān)性分析的p＜0.05，說明3#峰代表的成分與其他峰代表的成分的作用的差異性有統(tǒng)計學(xué)意義，表明其與小腸推進率的相關(guān)性較大,由此可以推測3#峰具有一定的瀉下和腸推進作用。

由于3#峰代表的成分與胡黃連瀉下作用的關(guān)系較為密切，且3#峰為已知成分，即香草酸；且胡黃連水提物與瀉下和腸推進作用的關(guān)聯(lián)性明顯高于乙酸乙酯萃取物，故用胡黃連水提物中香草酸含量來進行驗證實驗。

5.7紫外光譜掃描：在200-400nm范圍內(nèi)，測定指紋圖譜共有峰的紫外光譜圖，得到3#、10#、14#、15#、16#峰與混合對照品中的五種成分相近的紫外吸收圖譜，圖譜見圖10至圖14。紫外吸收光譜未能完全重合者，說明除主要成分外，還混合有其他化合物。

將胡黃連藥材與對照品指紋圖譜的保留時間和紫外吸收光譜圖對比，可以得出：3#峰（保留時間：7.196min）與香草酸（保留時間：7.514min）相近，紫外光譜基本相同，故可指認3#峰代表的物質(zhì)為為香草酸；10#峰（保留時間：21.934min）與胡黃連苷ⅱ（保留時間：21.901min）相近，紫外光譜基本相同，故指認10#峰為胡黃連苷ⅱ；14#峰（保留時間：30.218min）與胡黃連苷ⅰ（保留時間：30.156min）相近，紫外光譜基本相同，故指認14#峰為胡黃連苷ⅰ；15#峰（保留時間：31.669min）與胡黃連苷ⅲ（保留時間：31.556min）相近，紫外光譜基本相同，故指認15#峰為胡黃連苷ⅲ；16#峰（保留時間：33.296min）與肉桂酸（保留時間：34.012min）相近，紫外光譜基本相同，故指認16#峰為肉桂酸。

5.8：hplc-ms定性分析：胡黃連成分的定性分析采用hplc—ms法的質(zhì)譜檢測器，對胡黃連指紋譜中的各色譜峰進行質(zhì)譜分析，結(jié)合質(zhì)譜圖的光譜數(shù)據(jù)，進行定性分析，確定各峰號所對應(yīng)的具體峰。

質(zhì)譜條件：色譜柱：watersacquityuplcbehc18(1.7μm,2.1*50mmcolumn)lot:0259351281)；去溶劑氣體流量：600l／h；錐孔氣流：50l／h；離子源溫度100℃；去溶劑溫度250℃；離子檢測方式：氣動輔助電噴霧離子化(esi)，負離子模式，掃描范圍50～1200。流動相：a為：0.1％甲醇，b為：甲酸（0.1%），流動相洗脫條件見表10，流速：0.6ml/min。所得質(zhì)譜圖見圖15至圖19。

表10

結(jié)果：用hplc-ms對胡黃連指紋圖譜的特征峰進行定性，得到質(zhì)譜圖，將供試品與對照品各成分的質(zhì)譜圖進行對比可知，其中胡黃連苷i的m/z537為[m+hcoo]、胡黃連苷ⅱ的m/z為511[m-h]和胡黃連苷ⅲ的m/z537[m-h]，其分子量分別為為492、512和538，符合胡黃連總苷ⅱ、胡黃連苷i、胡黃連苷ⅲ的分子量，因此可以確定出10#、14#、15#峰分別為胡黃連總苷ⅱ、苷ⅰ和苷ⅲ；質(zhì)譜圖未能檢測到混合對照品中的香草酸和肉桂酸。

根據(jù)紫外光譜掃描及質(zhì)譜圖實驗結(jié)果可以得出：3#峰可確定為香草酸，10#、14#、15#峰分別為胡黃連總苷ⅱ、苷ⅰ和苷ⅲ。

實施例3：胡黃連瀉下活性成分驗證

1.材料：藥物與試劑規(guī)格批號同實施例2所述藥物與試劑。

已知胡黃連對照品混合溶液中香草酸的濃度、峰面積，及其在水提物指紋圖譜中的峰面積，可計算出水提物中香草酸的濃度，香草酸的峰面積和濃度關(guān)系見表11。計算胡黃連生藥材中香草酸的含量，計算公式如下：各自濃度*供試品混合溶液（ml）/水提物的量*水提物出膏率。計算得生藥材中香草酸的含量為5.6mg/g，根據(jù)生藥材灌胃量的高劑量（20倍）計算得：香草酸灌胃濃度為：2mg/ml。

表11：香草酸的峰面積和濃度

2.動物：小鼠：km種，spf級，雌雄各半，共12只，體重（25±2）g，來源：北京華阜康生物科技股份有限公司scxk（京）2014-0004，合格證號：11401300048986。

3.實驗方法：分組和給藥：小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3天，隨機劃分為2組，分別為1組空白組，2組香草酸組，每組雌雄各半，1-3號為雌，4-6號為雄。

上午9點開始灌藥，除空白組給予蒸餾水外，其余組分別給予對應(yīng)的藥物，灌胃體積相同，均為20ml/kg；每日灌胃量（g·kg^-1）為0.04、空白組給予蒸餾水。灌藥后小鼠單籠單只飼養(yǎng)，籠底鋪墊定性濾紙，分別觀察和記錄各組小鼠的首次瀉下時間，稱量大便總量、稀便量，測量稀便級，計算稀便率和腹瀉指數(shù)，連續(xù)觀察5h。

觀察指標(biāo)同實施例1所述觀察指標(biāo)。

統(tǒng)計分析：用spss17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析處理。對本實驗所獲得的所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，若呈正態(tài)分布，采用t檢驗比較，當(dāng)p<0.05時，認為其有差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義；當(dāng)p<0.01時，認為其差異顯著。

4.實驗結(jié)果：結(jié)果見表12和表13，結(jié)果顯示，香草酸組與空白組比較：稀便次p＜0.05，認為有顯著差異；稀便率p＜0.01，認為有顯著差異；稀便級p＜0.01，認為有顯著差異；腹瀉指數(shù)p＜0.01，認為有顯著差異；小腸推進率p＜0.01，認為有顯著差異。顯然，胡黃連中香草酸與其產(chǎn)生瀉下作用密切相關(guān)，香草酸的相關(guān)性具有統(tǒng)計學(xué)意義，但關(guān)于香草酸的現(xiàn)代藥理學(xué)研究的報道中尚未發(fā)現(xiàn)有相關(guān)記載。

表12：瀉下作用對比

注：與空白對照組比較，*p<0.05，**p<0.01

表13：腸推率

注：與空白對照組比較，*p<0.05，**p<0.01。

本發(fā)明旨在研究胡黃連的瀉下作用，故陽性對照藥亦須為瀉下藥。大黃作為瀉下類藥物的代表，其作用肯定，且研究范圍及深度最廣，其成分及作用機制相對明確，且在臨床實踐過程中發(fā)現(xiàn)大黃免煎劑的瀉下作用強于水煎劑，這一點已經(jīng)得到相關(guān)實驗的客觀驗證，趙自明等的研究（趙自明，陳玉興，杜鐵良，等.超微粉碎大黃配方顆粒小腸推進藥理等效性研究［j.中華中醫(yī)藥雜志，2011，26(5):1051－1057.］）證實:“大黃顆粒藥理等效性為超微粉＞細粉＞煎劑”,故選大黃免煎劑做為陽性對照藥。

中醫(yī)治法有很多，程鐘齡在《醫(yī)學(xué)心悟》中總結(jié)概括為“汗、和、下、消、吐、清、溫、補”八法，瀉下就屬于其中的“下”法；瀉下法是指應(yīng)用有“通便、下積、逐水”等功效的處方及藥物，以祛除“燥屎、積滯、實熱、水飲”等病邪的治法。瀉下藥是指凡能通利大便、治療大便干燥秘結(jié)或里實積滯證的藥物。2010年版《中國藥典》（一部）記錄了具有瀉下作用的藥材共有49種之多，其中味多甘、苦，性多寒、溫，主歸肺、大腸經(jīng)，大多含有油脂（包括脂肪酸）類、糖類及黃酮類化合物。一般將瀉下藥分為攻下、潤下、逐水藥，前兩者以腸為主要作用部位，后者以腸和膀胱為主要作用部位，由此可見其藥理效應(yīng)部位主要在“腸”，這與中醫(yī)所講的“六腑實而不滿、以通為用”的生理特點是吻合的。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明瀉下藥產(chǎn)生瀉下作用主要因其含有以下幾種成分，主要有油脂類、糖類、黃酮類、生物堿類、揮發(fā)油類、有機酸類、萜類、蒽醌類等成分。對比本實驗研究的結(jié)果，胡黃連致瀉主要已知成分為香草酸，亦屬于有機酸類。

瀉下類藥及其復(fù)方均能促進腸道蠕動，具有不同程度的瀉下作用，根據(jù)其產(chǎn)生作用的特點，可大致分為刺激性瀉藥、容積性瀉藥及潤滑性瀉藥。

其一為刺激性瀉下藥，主要包括大黃、番瀉葉、蘆薈等藥物，這類藥物的致瀉成分均為結(jié)合型蒽苷，口服后到達大腸，經(jīng)過細菌酶的水解作用轉(zhuǎn)化為苷元，刺激大腸粘膜下神經(jīng)叢，加快腸蠕動從而排便。此外，牽牛子苷、巴豆油以及芫花酯等都有強烈的刺激腸粘膜的作用，從而產(chǎn)生強烈的瀉下作用；近幾年的臨床與實驗研究表明,大黃瀉下作用的機制是通過提高中段和遠段結(jié)腸張力,阻礙na+從腸腔轉(zhuǎn)運至細胞內(nèi)、使“水”停留于腸腔而促使排便，從而得出大黃對結(jié)腸aqp的調(diào)節(jié)效應(yīng)可能是其“瀉下”功效的藥理學(xué)新解釋,亦可能是大黃能產(chǎn)生多種功效的緣由。

其二為容積性瀉下藥，主要包括芒硝等藥物，這類藥物的主要成分為硫酸鈉，口服到達腸腔后不能被腸壁吸收，通過高滲性作用，使腸腔停留了大量水分，增大腸容積，刺激腸壁，促進腸蠕動而瀉下。

其三為潤滑性瀉下藥，主要包括火麻仁、郁李仁等藥物，這類藥物含有大量的脂肪油，能潤滑腸道，軟化糞便，同時脂肪油在堿性腸液中分解產(chǎn)生出的脂肪酸，可對腸壁產(chǎn)生較柔和的刺激作用，從而具有潤腸通便作用，是為潤腸性作用。

對比本實驗研究，認為胡黃連中產(chǎn)生致瀉作用的主要已知成分香草酸，屬有機酸類，亦能促進腸道快速蠕動，故推測可能屬于刺激性瀉下作用。

在研究瀉下作用的實驗中，稀便率、稀便級是最基本的指標(biāo)，幾乎應(yīng)用于所有有關(guān)瀉下研究的文獻中，其中稀便率是指稀便量和大便總量的比；稀便級是指稀便污染濾紙形成的污跡面積的大小。后來隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)這些指標(biāo)并不全面，于是周干南等提出腹瀉指數(shù)這一指標(biāo)。周干南等認為腹瀉率只能反映一個動物群體的瀉下比例，不能反映單個動物的；稀便率與稀便級只能各自單獨反映瀉下的單個方面，當(dāng)二者出現(xiàn)相反的結(jié)果時，會影響結(jié)果，不能做出準(zhǔn)確的判斷，再此基礎(chǔ)上提出腹瀉指數(shù)這一指標(biāo)來對瀉下程度進行綜合的全面的評價。碳末推進實驗是觀察碳末在小腸內(nèi)推進的長度，主要考察小腸推進率，因腸為瀉下劑的主要藥理效應(yīng)部位，且這一指標(biāo)廣泛應(yīng)用于瀉下藥物和方劑的研究中，已成為約定俗成的一個觀察指標(biāo)，杜群等考察大黃的瀉下作用甚至只選用小腸推進率，且與上述幾個指標(biāo)相比，主觀因素相對影響較小，數(shù)據(jù)采集比較全面，故選為觀察指標(biāo)。

本發(fā)明首先從三個層次對胡黃連的瀉下作用進行了考察，選取了稀便次、稀便率、稀便級、腹瀉指數(shù)和小腸推進率等多重指標(biāo)進行考察。實施例1主要考察胡黃連水煎劑中產(chǎn)生瀉下作用的活性成分易溶解于何種試劑。結(jié)果表明乙酸乙酯組與空白組在稀便次、率、級、腹瀉指數(shù)和小腸推進率等各項指標(biāo)上比較均有顯著差異（p＜0.01）；乙酸乙酯組與三氯甲烷組在稀便次、率、及、腸推進上比較均有差異（p＜0.05），在腹瀉指數(shù)上有顯著差異（p＜0.01）。結(jié)果可以得出胡黃連的有效成分主要溶解于乙酸乙酯中。其次，通過高效液相色譜分別分析胡黃連對照品和供試品的指紋圖譜，找到16個共有峰，并對根據(jù)保留時間和紫外吸收圖譜對已知成分進行指認，得出3#峰為香草酸、10#峰為胡黃連苷ⅱ、14#峰為胡黃連苷ⅰ、15#峰為胡黃連苷ⅲ、16#峰為肉桂酸。分別對比胡黃連不同提取物和不同溶劑萃取物的共有峰峰面積和腸推進率的相關(guān)性，胡黃連不同溶劑萃取物的相關(guān)系數(shù)r均小于0.9，認為其相關(guān)性不大；胡黃連不同提取物相關(guān)系數(shù)r＞0.9的有1#、3#、8#、16#峰，但只有3#峰的pearson相關(guān)性分析顯示有差異（p＜0.05），說明3#峰代表的成分有一定的瀉下活性,是胡黃連中產(chǎn)生瀉下和腸推進作用的主要活性物質(zhì)，對比指認出的已知物質(zhì)，得出香草酸有一定活性，且主要存在于煎劑中。最后，驗證香草酸的活性，實驗證明香草酸組與空白組比在稀便次、級、率、腹瀉指數(shù)及想腸推進率等指標(biāo)上均有差異（p＜0.05）。