本發明屬于高分子材料技術領域，涉及一種細胞內構筑溫度響應性聚集體的材料及其制備方法和應用。

背景技術：

納米材料的生物利用率在生物應用材料的應用中扮演著重要角色。為了提高納米材料的生物功能，開發了各種策略來提高納米材料在目標位置的積累和滯留，例如，高通透性和滯留(epr)效應，主動靶向機制，長效血液循環等等?；谝陨细拍?，人們致力于設計并合成物理化學性能易于控制的納米材料，例如，尺寸、形態、電荷、表面化學、有效負載量和穩定性。然而，精確制備大體積的納米材料仍然是一個巨大的挑戰。

除了發展可控制備納米材料的新策略，也開發了一種在活體水平探索功能材料的新策略。這種策略的主要思想是在特殊生理或病理環境下通過小分子的自組裝來構筑有特殊功能的納米結構。

由于溫度響應性聚合物的溫度誘導的線-球轉換特性，溫度響應性聚合物在藥物/蛋白遞送系統，免疫佐劑，人工抗體，造影劑等發面有極大應用。為了在生物體應用溫度響應性聚合物，溫度的改變并不總是在生理條件范圍內。因此，迫切需要開發更智能，更溫和的生物相容性的觸發而不是溫度的改變。

技術實現要素：

針對現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種細胞內構筑溫度響應性聚集體的材料及其制備方法和應用。

為達到此發明目的，本發明采用以下技術方案：

一方面，本發明提供一種細胞內構筑溫度響應性聚集體的材料，所述材料包括響應性多肽和穿膜肽組成的多肽序列以及溫敏聚合物，所述多肽序列的響應性多肽連接在溫敏聚合物上。

本發明的材料可以通過穿膜肽輔助材料進胞，進入細胞后對胞內特定刺激信號做出響應，移除親水性的多肽(即響應性多肽部分)，改變材料的相轉化溫度到生理溫度37℃以下，最終導致材料的塌縮聚集，形成納米聚集體。

傳統的方法是將大的納米顆粒遞送到需要的位置(如腫瘤)，但是這種方法會導致材料在肝腎富集產生毒性。本發明的細胞內構筑溫度響應性聚集體的材料是親水性較強的材料，其通過舒展的狀態以水溶液的形式進入活體，改善生物分布，在需要的位置(如腫瘤)在某種條件觸發下原位聚集或組裝，可以提高材料的利用度，同時因為不會導致肝腎毒性，并且可以改善藥物或熒光分子的生物分布，增加其在作用部位的滯留時間，增加利用度，降低給藥次數等。

優選地，所述溫敏聚合物為聚n-異丙基丙烯酰胺、聚n,n-二乙基丙烯酰胺、聚n-羥甲基丙基甲基丙烯酰胺、聚n-2,2-二甲基1,3-二氧戊環甲基丙烯酰胺、聚n-2-甲氧基1,3-二氧乙環甲基丙烯酰胺、聚n-2-乙氧基1,3-二氧乙環甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸寡聚乙二醇酯、聚n-乙烯基異丁酰胺、聚甲基乙烯基醚、聚n-乙烯基己內酰胺或聚2-乙基惡唑啉中的任意一種或至少兩種的組合，優選聚n-異丙基丙烯酰胺。

優選地，所述溫敏聚合物的合成方法為活性/可控自由基聚合，優選raft聚合(可逆加成-斷裂鏈轉移聚合)。

優選地，所述raft聚合的鏈轉移試劑為n,n'-二甲基n,n'-二(4-吡啶基)秋蘭姆二硫化物、2-(十二烷基三硫代碳酸酯基)-2-甲基丙酸、雙(十二烷基硫烷基硫代羰基)二硫化物、2-氰基-2-丙基十二烷基三硫代碳酸酯、2-氰基-2-丙基苯并二硫、4-氰基-4-[(十二烷基硫烷基硫羰基)硫烷基]戊酸、4-氰基-4-(苯基硫代甲酰硫基)戊酸、氰甲基十二烷基三硫代碳酸酯、氰甲基甲基(苯基)氨基二硫代甲酸酯、甲基-2-丙酸甲基(4-吡啶)氨基二硫代甲酸酯、甲基-2-(十二烷基三硫代碳酸酯)-2-甲基丙酸酯或2-苯基-2-丙基苯并二硫中任意一種或至少兩種的組合，進一步優選2-氰基-2-丙基十二烷基三硫代碳酸酯。

優選地，所述響應性多肽為谷胱甘肽響應性多肽、半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶-3響應性多肽、半胱氨酸蛋白酶atg4響應性多肽、基質金屬蛋白酶響應性多肽或磷酸酶響應性多肽中的任意一種，優選谷胱甘肽響應性多肽、半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶-3響應性多肽或半胱氨酸蛋白酶atg4響應性多肽。

優選地，所述谷胱甘肽響應性多肽為cys-lys-(s-s)-asp。

優選地，所述半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶-3響應性多肽為cys-lys-asp-glu-val-asp。

優選地，所述半胱氨酸蛋白酶atg4響應性多肽為cys-lys-thr-phe-gly-phe。

優選地，所述基質金屬蛋白酶響應性多肽為cys-lys-gly-pro-leu-gly-val-arg-gly-lys或cys-lys-pro-leu-gly-leu-ala-gly。

優選地，所述磷酸酶響應性多肽為cys-lys-leu-val-phe-tyr(hpo3)或cys-lys-leu-val-phe-tyr(hpo3)-lys-leu-val-phe-tyr(hpo3)。

優選地，所述穿膜肽為grkkrrqrrrpq(gly-arg-lys-lys-arg-arg-gln-arg-arg-arg-pro-gln)、rqikwfqnrrmkwkk(arg-gln-ile-lys-trp-phe-gln-asn-arg-arg-met-lys-trp-lys-lys)、ygrkkrrqrrr(tyr-gly-arg-lys-lys-arg-arg-gln-arg-arg-arg)、rggrlsysrrrfststgr(arg-gly-gly-arg-leu-ser-tyr-ser-arg-arg-arg-phe-ser-thr-ser-thr-gly-arg)、rrlsysrrrf(arg-arg-leu-ser-tyr-ser-arg-arg-arg-phe)、pirrrkklrrlk(pro-ile-arg-arg-arg-lys-lys-leu-arg-arg-leu-lys)、rrqrrtsklmkr(arg-arg-gln-arg-arg-thr-ser-lys-leu-met-lys-arg)、rrrrnrtrrnrrrvr(arg-arg-arg-arg-asn-arg-thr-arg-arg-asn-arg-arg-arg-val-arg)、kmtraqrraaarrnrwtar(lys-met-thr-arg-ala-gln-arg-arg-ala-ala-ala-arg-arg-asn-arg-trp-thr-ala-arg)、trrqrtrrarrnr(thr-arg-arg-gln-arg-arg-ala-arg-arg-asn-arg)、rrrrrrrr(arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg)或grrrrrrrrrppq(gly-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-pro-pro-gln)中的任意一種。

優選地，所述材料還包括信號分子和/或藥物分子，所述信號分子和/或藥物分子連接在響應性多肽上。信號分子可以用于觀察材料在細胞內的滯留以及材料的形態變化等，藥物分子可以用于腫瘤化療或系統免疫激活用于免疫治療。

優選地，所述信號分子為具有光聲成像效應的分子、具有極性響應熒光效應分子或具有近紅外熒光效應的分子中的任意一種。

優選地，所述具有光聲成像效應的分子為紫紅素-18卟啉類化合物。

優選地，所述具有極性響應熒光效應分子為4-(n,n-二甲氨基磺酰)-7-氟-2,1,3-苯并惡二唑(dbd)類化合物。

優選地，所述具有近紅外熒光效應的分子為花菁類化合物，優選cy5、cy6或cy7中的任意一種或至少兩種的組合進一步優選cy7。

優選地，所述藥物分子為苯達莫斯汀、苯丁酸氮芥或甲氨蝶呤中的任意一種或至少兩種的組合。

優選地，所述響應性多肽和穿膜肽通過酰胺鍵連接在一起。

優選地，所述多肽序列作為側鏈接枝在溫敏聚合物的骨架上。

優選地，所述接枝通過邁克爾加成法實現，即通過溫敏聚合物中的雙鍵與響應性多肽中巰基進行邁克爾加成，從而實現將多肽序列接枝在溫敏聚合物的骨架上。

優選地，所述溫敏聚合物的分子量為20-80kd，例如20kd、25kd、30kd、35kd、40kd、45kd、50kd、55kd、60kd、65kd、70kd、75kd或80kd，優選40kd。當溫敏聚合物的分子量小于20kd時，會使得本發明所述的細胞內構筑溫度響應性聚集體的材料的響應性變差，并且分子量太小或太大，均會使得材料對細胞的毒性增大。

優選地，所述多肽連接比例為0.5-3％，例如0.5％、0.8％、1％、1.2％、1.5％、1.8％、2％、2.3％、2.5％、2.8％或3％，優選1％。在本發明中，所述多肽連接比例指的是多肽連接在溫敏聚合物骨架上的量，具體的是：多肽與構成溫敏聚合物的單體或單體混合物(當聚合物由兩種以上單體聚合得到時，單體混合物指兩種以上單體的總和)的摩爾百分比。

優選地，所述信號分子通過酰胺鍵與響應性多肽連接在一起。

在本發明中，所述細胞內構筑溫度響應性聚集體的材料可以通過本領域已知的技術手段進行制備，例如可以通過本領域已知的聚合手段例如raft聚合來合成所需的溫敏聚合物，通過多肽固相合成法合成多肽序列，任選地在多肽序列上連接上信號分子和/或藥物分子，并通過邁克爾加成將多肽序列的響應性多肽端接枝在溫敏聚合物的骨架上得到所述的細胞內構筑溫度響應性聚集體的材料。

另一方面，本發明提供了一種成像劑，所述成像劑包括如上所述的細胞內構筑溫度響應性聚集體的材料。

在本發明中可以利用所述細胞內構筑溫度響應性聚集體的材料作為成像劑，以觀察材料在細胞內的滯留以及材料的形態變化等。

另一方面，本發明提供了一種藥物遞送材料，所述藥物遞送材料包括如上所述的細胞內構筑溫度響應性聚集體的材料。

在本發明中可以利用所述的細胞內構筑溫度響應性聚集體的材料作為藥物遞送材料，將該材料攜帶的藥物遞送至細胞內，達到靶向遞送目的，并且提高在細胞內的滯留。

相對于現有技術，本發明具有以下有益效果：

本發明的細胞內構筑溫度響應性聚集體的材料通過穿膜肽輔助進胞，進入細胞后對胞內特定刺激信號做出響應，移除親水性的多肽，改變材料的相轉化溫度到生理溫度37℃以下，最終導致材料的塌縮聚集，形成納米聚集體。該策略可以實現材料在細胞內的長時間滯留，對于活細胞成像或高滯留率的藥物遞送，具有良好的應用前景。

附圖說明

圖1為實施例1的步驟(1)制備得到的多肽序列的hplc譜圖；

圖2為實施例1的步驟(1)制備得到的多肽序列的maldi-tof譜圖；

圖3是實施例1的步驟(2)制備得到的雙鍵功能化的聚合物以及步驟(3)制備得到的細胞內構筑溫度響應性聚集體的材料的核磁氫譜；

圖4為實施例1制備得到的細胞內構筑溫度響應性聚集體的材料在半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶-3切割前后的最低臨界溶解溫度曲線圖；

圖5為實施例1中制備得到的細胞內構筑溫度響應性聚集體的材料在半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶-3切割后的聚集體的掃描電子顯微鏡圖，其標尺為2μm；

圖6為實施例3的步驟(1)制備得到的多肽序列的hplc譜圖；

圖7為實施例3的步驟(1)制備得到的多肽序列的maldi-tof譜圖；

圖8為實施例4的步驟(1)制備得到的多肽序列的hplc譜圖；

圖9為實施例4的步驟(1)制備得到的多肽序列的maldi-tof譜圖；

圖10為實施例1制備得到的細胞內構筑溫度響應性聚集體的材料在荷瘤小鼠腫瘤部位形成聚集體后的熒光長效成像圖；

圖11為實施例1制備得到的細胞內構筑溫度響應性聚集體的材料在荷瘤小鼠腫瘤部位形成聚集體后的熒光成像量化圖；

圖12為實施例1制備得到的細胞內構筑溫度響應性聚集體的材料在荷瘤小鼠體內形成聚集體后熒光強度與腫瘤大小的關系圖。

具體實施方式

下面通過具體實施方式來進一步說明本發明的技術方案。本領域技術人員應該明了，所述實施例僅僅是幫助理解本發明，不應視為對本發明的具體限制。

實施例1

在本實施例中，所述細胞內構筑溫度響應性聚集體的材料中多肽序列(包括響應性多肽和穿膜肽)為cys-lys-asp-glu-val-asp-gly-arg-lys-lys-arg-arg-gln-arg-arg-arg-pro-gln，溫敏性聚合物為聚n-異丙基丙烯酰胺，合成方法如下：

(1)合成響應性多肽cys-lys-asp-glu-val-asp-gly-arg-lys-lys-arg-arg-gln-arg-arg-arg-pro-gln，即

多肽合成采用fmoc固相合成法合成：合成選用0.35mm修飾密度的wang樹脂，其中第一個氨基酸(谷酰胺)c端被固定于樹脂上，n端被fmoc保護。用20％(v/v)的六氫吡啶的dmf溶液脫去fmoc保護，然后用茚三酮測試法測試去保護結果。然后將下一個氨基酸的羧基用0.4m的4-甲基嗎啉(nmm)和0.4m的苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯(hbtu)的dmf溶液活化，并加入到脫去保護的樹脂中反應1小時。完成所有序列氨基酸的反應后，用含有2.5％水、2.5％三異丙基硅烷和2.5％1,2-乙二硫醇的三氟乙酸溶液將合成好的多肽從樹脂上脫除，同時脫除氨基酸的側鏈保護。將三氟乙酸用旋轉蒸發法去除，然后多肽的粗產物用無水乙醚沉淀，洗滌并干燥。最后選用反相制備液相色譜，將多肽純化。純化過程的條件是：流動相是含有0.1％三氟乙酸的乙腈和含有0.1％三氟乙酸的雙蒸水；參數是梯度洗脫從5％乙腈/95％水到60％乙腈/40％水，流速為10ml/min，處理時間為30min；檢測器為紫外檢測器，檢測波段為220nm。

(2)溫敏聚合物聚n-異丙基丙烯酰胺的制備

稱取39.6mmol的n-異丙基丙烯酰胺、0.4mmol的n-(2-羥乙基)丙烯酰胺、0.1mmol的2-(十二烷基三硫代碳酸酯基)-2-甲基丙酸和0.02mmol的偶氮二異丁腈，并溶解在5ml的n，n'-二甲基甲酰胺中。通氮氣30分鐘后在氮氣氛圍下65℃反應10小時后將反應暴露在空氣中并迅速放入冰浴中停止反應。反應得到的溶液用少量四氫呋喃稀釋并用預冷的己烷沉淀。得到的沉淀通過離心收集，再次溶解在2ml的四氫呋喃中并用己烷沉淀，該純化過程重復五次。最后冷凍干燥得到聚合物。

稱取1g聚合物和過量的異氰酸酯丙烯酸乙酯、0.9wt％的4,4'-亞甲基雙(2,6-二叔丁基苯酚)和0.1wt％的二月桂酸二丁基錫，并溶解在1ml的n，n'-二甲基甲酰胺中，40℃反應36小時后用預冷的乙醚沉淀兩次，抽濾并真空干燥2小時得到雙鍵功能化的聚合物。

(3)溫度響應性聚合物-多肽接合物的制備

稱取30mg的雙鍵功能化的聚合物和7mg多肽，并溶解在300l的二甲基亞砜中，加入兩滴三乙胺后37℃反應24小時，透析后冷凍干燥得到溫度響應性聚合物-多肽接合物，即所述細胞內構筑溫度響應性聚集體的材料。

在本實施例中，步驟(1)制備得到的響應性多肽的hplc譜圖如圖1所示，由該圖可知，多肽在流動相中的保留時間為15.3分鐘。步驟(1)制備得到的響應性多肽的maldi-tof譜圖如圖2所示，由該圖可知，多肽的分子量為2310.8。

步驟(2)制備得到的雙鍵功能化的聚合物以及步驟(3)制備得到的細胞內構筑溫度響應性聚集體的材料的核磁氫譜如圖3所示，化學位移值δ＝3.43ppm和δ＝3.18ppm分別對應-och2-跟-ch2-；δ＝3.85ppm和δ＝1.05ppm對應n-異丙基丙烯酰胺中的-ch-以及-ch3。δ＝9.0-8.0對應多肽上的-conh-。化學位移δ＝6.4-5.8ppm處的消失表示多肽成功連接到聚合物骨架上。

步驟(3)制備得到的細胞內構筑溫度響應性聚集體的材料在添加響應性刺激半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶-3前后的相轉變溫度曲線如圖4所示，在酶加入之前，材料的相轉變溫度在生理溫度37℃之上，保證材料為單鏈舒展狀態，在酶加入后，材料的相轉變溫度降到37℃之下，材料變的疏水而發生聚集，得到較為均一的聚集體，如圖5所示，聚集體大小為670±160nm。

實施例2

與實施例1不同之處僅在于，在步驟(1)合成的過程中，最后一個氨基酸采用boc-cys(trt)-oh，與該cys相連的lys側鏈氨基由dde保護。當用2％的水合肼脫除dde后，將信號分子cy5的羧基與此lys側鏈氨基以酰胺鍵相連。而后經過與實施例1相同的步驟(2)和步驟(3)制備得到帶有信號分子的細胞內構筑溫度響應性聚集體的材料。

實施例3

在本實施例中通過與實施例2中步驟(1)相同的固相合成法合成了以下結構的多肽序列ck(s-s)dgrkkrrqrrrpq：

圖6為多肽序列ck(s-s)dgrkkrrqrrrpq的hplc譜圖，由該圖可知，多肽在流動相中的保留時間為17.6分鐘。

圖7為多肽序列ck(s-s)dgrkkrrqrrrpq的maldi-tof譜圖，由該圖可知，多肽的分子量為2131.5。

利用該多肽序列ck(s-s)dgrkkrrqrrrpq通過與實施例1中步驟(2)和步驟(3)相同的步驟最終制備得到細胞內構筑溫度響應性聚集體的材料。

實施例4

在本實施例中通過與實施例2中步驟(1)相同的固相合成法合成了以下結構的多肽序列cktfgfgrkkrrqrrrppq：

圖8為多肽序列cktfgfgrkkrrqrrrppq的hplc譜圖，由該圖可知，多肽在流動相中的保留時間為14.6分鐘。

圖9為多肽序列cktfgfgrkkrrqrrrppq的maldi-tof譜圖，由該圖可知，多肽的分子量為2304.9。

利用該多肽序列cktfgfgrkkrrqrrrppq通過與實施例1中步驟(2)和步驟(3)相同的步驟最終制備得到細胞內構筑溫度響應性聚集體的材料。

實施例5

對實施例2制備的得到的細胞內構筑溫度響應性聚集體的材料在荷瘤小鼠體內的長效成像：

向荷瘤小鼠體內通過尾靜脈注射阿霉素和生理鹽水，每四天注射一次，共注射四次，阿霉素的注射濃度為每千克小鼠注射5毫克的阿霉素。注射完阿霉素和生理鹽水后，向荷瘤小鼠體內通過尾靜脈注射熒光分子標記的溫度響應性聚合物-多肽接合物，接合物的注射濃度為每千克小鼠注射80毫克的接合物。選取0.5、1、3、6、9、12和24小時時間節點，觀察在不同的時間點小鼠腫瘤部位的熒光成像。老鼠的影像圖如圖10所示，熒光定量數據如圖11所示，數據顯示未形成聚集體的材料很快在老鼠體內清除，而形成聚集體的材料在腫瘤內在3小時的時候熒光值達到最高，隨著時間的延長，熒光有微弱的降低，說明熒光標記的聚集體在腫瘤內有長效的滯留。對實施例1和實施例3以及實施例4制備得到的細胞內構筑溫度響應性聚集體的材料進行相同的實驗測試，得到同樣的結果，證明熒光標記的聚集體在腫瘤內有長效的滯留。

實施例6

對實施例2制備得到的細胞內構筑溫度響應性聚集體的材料聚集對荷瘤小鼠治療效果的評價：

向荷瘤小鼠體內通過尾靜脈注射阿霉素和生理鹽水，每四天注射一次，共注射四次，阿霉素的注射濃度為每千克小鼠注射5毫克的阿霉素。注射完阿霉素和生理鹽水后，向荷瘤小鼠體內通過尾靜脈注射熒光分子標記的溫度響應性聚合物-多肽接合物，注射濃度為每千克小鼠注射80毫克的聚合物-多肽接合物。每次在接合物注射后的3小時節點讀取熒光數據，將熒光數據與腫瘤的體積變化擬合如圖12所示，聚集體反映的熒光強度與腫瘤的體積變化成線性相關，腫瘤體積小對應的熒光值也小，說明細胞內構筑溫度響應性聚集體可以對荷瘤小鼠治療效果進行評價。對實施例1和實施例3以及實施例4制備得到的細胞內構筑溫度響應性聚集體的材料進行相同的實驗測試，得到同樣的結果，證明得到的材料可以對荷瘤小鼠治療效果進行評價。

申請人聲明，本發明通過上述實施例來說明本發明的工藝方法，但本發明并不局限于上述工藝步驟，即不意味著本發明必須依賴上述工藝步驟才能實施。所屬技術領域的技術人員應該明了，對本發明的任何改進，對本發明所選用原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發明的保護范圍和公開范圍之內。