本發明屬于生物材料表面改性技術領域，具體涉及一種特異性促內皮細胞生長的抗凝血表面構建方法。

背景技術：

血管內植入材料或器械在心血管疾病的治療方面具有十分重要的關鍵作用，然而，材料或器械植入后，由于血液成分及內皮細胞功能改變導致的表面血栓形成及內皮功能紊亂常常導致植入失敗。

基于材料與人體血液及內皮細胞之間界面生物反應的認識，在材料表面沉積無機涂層、制備高分子層或固定生物活性分子可以在一定程度上提高材料的血液相容性和賦予材料一定的內皮形成能力，但這些表面改性方法不能完全抑制血栓形成或促進內皮完全愈合。

研究表明，完整的天然的內皮細胞層，是調節凝血-抗凝平衡、內膜修復-增生平衡的關鍵。因而材料或植入器械表面快速覆蓋內皮細胞層將顯著降低血栓發生和平滑肌過度增殖的程度，進而顯著提高材料或器械的植入成功率。

為了在材料表面形成天然的內皮細胞層，目前主要的方法有：在材料表面種植內皮細胞、材料表面接枝細胞外基質蛋白或內皮細胞生長因子促進細胞粘附和生長、表面固定能夠促進內皮祖細胞的誘導分化的生物活性分子、表面固定特異性促內皮細胞生長分化的抗體等方法。這些方法雖然都可以顯著促進內皮細胞的粘附和生長，但其抗凝血性能有限，并且細胞在材料表面無序生長，因此獲得的內皮細胞層還不能完全實現正常內皮組織的功能。

技術實現要素：

發明目的：本發明的目的在于提供一種特異性促內皮細胞生長的抗凝血表面構建方法，能顯著提升材料的抗凝血性能，并能特異性地促進內皮細胞有序生長，從而構建特異性的促內皮細胞生長表面，在心血管內植入材料或器械方面獲得應用。

技術方案：為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種特異性促內皮細胞生長的抗凝血表面構建方法，包括如下步驟：

1)生物材料表面制備聚多巴胺層

將生物材料浸沒到多巴胺溶液中，充分自聚合，清洗后干燥，重復三次，得到有聚多巴胺層的生物材料表面；

2)生物材料表面微接觸印刷固定雙氨基聚乙二醇

將雙氨基聚乙二醇溶液滴加在條帶狀pdms印章表面，條帶狀pdms印章表面充分吸附雙氨基聚乙二醇后，n2干燥，然后將pdms印章與步驟1)有聚多巴胺層的生物材料表面充分接觸，清洗后干燥，得到氨基聚乙二醇改性的生物材料表面；

3)生物材料表面固定殼聚糖和肝素

將步驟2)得到的生物材料依次浸沒到殼聚糖和肝素溶液中充分反應后，清洗干燥，得到表面固定了殼聚糖和肝素的生物材料表面；

4)生物材料表面固定redv

將步驟3)中的生物材料浸沒到端基為n-琥珀酰亞胺的redv溶液中充分反應，清洗后干燥，得到表面含有redv的生物材料表面。

步驟1)中，多巴胺溶液的濃度為0.1～1mg/ml。

步驟1)中，多巴胺溶液ph為8.0-8.5。

步驟1)中，充分自聚合時間為12-24小時。

步驟2)中，條帶的寬度及間隔為5～50μm，聚乙二醇溶液的濃度為0.1～1mg/ml。

步驟3)中，將步驟2)得到的生物材料首先浸沒到殼聚糖溶液中充分反應4～12小時，清洗干燥后，再浸沒到肝素溶液中充分吸附4～8小時。

步驟3)中，所述的殼聚糖和肝素溶液的濃度為1～10mg/ml。

步驟4)中，充分反應的時間為4～8小時，redv的濃度為0.1～1mg/ml。

有益效果：與現有技術相比，本發明的一種特異性促內皮細胞生長的抗凝血表面構建方法，通過該方法對心血管植入材料進行表面改性，具備以下優勢：

1)微接觸印刷術可以將肝素及redv固定在材料表面特定區域，從而在材料表面形成特定圖案的生物活性拓撲結構，有利于控制內皮細胞的粘附生長行為，實現內皮組織的完全愈合；

2)redv多肽分子可以特異性促進內皮細胞的粘附與生長，同時還可以抑制平滑肌細胞的生長；肝素分子具有優異的抗凝血性能，因此，用于血管內植入材料或器械表面改性時，可以同時賦予材料優異的促內皮細胞生長性能和抗凝血性能；

3)由于多巴胺聚合可以在所有固體材料表面進行自聚合形成牢固結合的涂層，并且形成的涂層具有較強的與含氨基物質反應的能力，因此，本發明所采用的方法幾乎可以用于所有生物材料的表面改性，用于構建特異性促內皮細胞生長的抗凝血表面。

附圖說明

圖1為在生物材料表面構建特異性促內皮細胞生長的抗凝血表面的示意圖；

圖2為生物材料表面典型的內皮細胞粘附生長圖；

圖3為生物材料表面改性后典型的血小板粘附圖。

具體實施方式

為了進一步說明本發明，以下結合實施例對本發明提供的一種特異性促內皮細胞生長的抗凝血表面構建方法。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。

此外，應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。

如圖1所示，一種特異性促內皮細胞生長的抗凝血表面構建方法，首先采用多巴胺自聚的方法在材料表面形成聚多巴胺層，然后采用微接觸印刷術固定氨基聚乙二醇，進一步在材料表面固定殼聚糖和肝素，最后將具有特異性促內皮細胞生長的精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-纈氨酸(redv)多肽接枝在peg區域，獲得特異性促內皮細胞生長的抗凝血表面；具體包括如下步驟：

1)生物材料表面制備聚多巴胺層

將生物材料浸沒到ph為8.0-8.5的多巴胺溶液中，充分自聚合12-24小時，清洗后干燥，重復三次，得到有聚多巴胺層的生物材料表面；

2)生物材料表面微接觸印刷固定雙氨基聚乙二醇

將雙(3-氨基丙基)封端的聚乙二醇溶液滴加在條帶狀的微圖形聚二甲基硅氧烷(pdms)印章表面，條帶狀的微圖形聚二甲基硅氧烷印章表面充分吸附雙氨基聚乙二醇后，n2干燥，然后將pdms印章與步驟1)有聚多巴胺層的生物材料表面充分接觸2分鐘，清洗后干燥，得到氨基聚乙二醇改性的生物材料表面；

3)生物材料表面固定殼聚糖和肝素

將步驟2)得到的生物材料依次浸沒到殼聚糖和肝素溶液中充分反應后，清洗干燥，得到表面固定了殼聚糖和肝素的生物材料表面；

4)生物材料表面固定redv

將步驟3)中的生物材料浸沒到端基為n-琥珀酰亞胺的redv溶液中充分反應，清洗后干燥，得到表面含有redv的生物材料表面。

步驟1)中，多巴胺溶液的濃度為0.1～1mg/ml。

步驟2)中，條帶的寬度及間隔為5～50μm，聚乙二醇溶液的濃度為0.1～1mg/ml。

步驟3)中，將步驟2)得到的生物材料首先浸沒到殼聚糖溶液中充分反應4～12小時，清洗干燥后，再浸沒到肝素溶液中充分吸附4～8小時，清洗后干燥，其中，殼聚糖及肝素溶液的濃度為1～10mg/ml。

步驟4)中，充分反應的時間為4～8小時，redv的濃度為0.1～1mg/ml。

本發明設計的生物材料包括各種固體類的生物材料，只要能讓多巴胺粘附即可，例如，鈦合金材料、聚氨酯材料、二氧化鈦薄膜。

實施例1-3中采用的生物材料為鈦合金材料。

實施例1制備條帶的寬度及間隔為5μm的生物材料

一種特異性促內皮細胞生長的抗凝血表面構建方法，具體包括如下步驟：

1)生物材料表面制備聚多巴胺層

將生物材料浸沒到ph為8.0的多巴胺溶液中，充分自聚合12小時，清洗后干燥，重復三次，多巴胺溶液的濃度為0.1mg/ml，得到有聚多巴胺層的生物材料表面；

2)生物材料表面微接觸印刷固定雙氨基聚乙二醇

將雙(3-氨基丙基)封端的聚乙二醇溶液滴加在條帶狀的微圖形聚二甲基硅氧烷(pdms)印章表面，條帶狀的微圖形聚二甲基硅氧烷印章表面充分吸附雙氨基聚乙二醇后，n2干燥，然后將pdms印章與步驟1)有聚多巴胺層的生物材料表面充分接觸2分鐘，清洗后干燥，得到氨基聚乙二醇改性的生物材料表面，其中，條帶的寬度及間隔為5μm，聚乙二醇溶液的濃度為0.1mg/ml；

3)生物材料表面固定殼聚糖和肝素

將步驟2)得到的生物材料首先浸沒到殼聚糖溶液中充分反應4小時，清洗干燥后，再浸沒到肝素溶液中充分吸附4小時，得到表面固定了殼聚糖和肝素的生物材料表面，殼聚糖及肝素溶液的濃度為1mg/ml；

4)生物材料表面固定redv

將步驟3)中的生物材料浸沒到端基為n-琥珀酰亞胺的redv溶液中充分反應4小時，清洗后干燥，得到表面含有redv的生物材料表面，其中，redv的濃度為0.1mg/ml。

實施例2制備條帶的寬度及間隔為25μm的生物材料

一種特異性促內皮細胞生長的抗凝血表面構建方法，具體包括如下步驟：

1)生物材料表面制備聚多巴胺層

將生物材料浸沒到ph為8.5的多巴胺溶液中，充分自聚合24小時，清洗后干燥，重復三次，多巴胺溶液的濃度為1mg/ml，得到有聚多巴胺層的生物材料表面；

2)生物材料表面微接觸印刷固定雙氨基聚乙二醇

將雙(3-氨基丙基)封端的聚乙二醇溶液滴加在條帶狀的微圖形聚二甲基硅氧烷(pdms)印章表面，條帶狀的微圖形聚二甲基硅氧烷印章表面充分吸附雙氨基聚乙二醇后，n2干燥，然后將pdms印章與步驟1)有聚多巴胺層的生物材料表面充分接觸2分鐘，清洗后干燥，得到氨基聚乙二醇改性的生物材料表面，其中，條帶的寬度及間隔為25μm，聚乙二醇溶液的濃度為1mg/ml；

3)生物材料表面固定殼聚糖和肝素

將步驟2)得到的生物材料首先浸沒到殼聚糖溶液中充分反應12小時，清洗干燥后，再浸沒到肝素溶液中充分吸附8小時，得到表面固定了殼聚糖和肝素的生物材料表面，殼聚糖及肝素溶液的濃度為10mg/ml；

4)生物材料表面固定redv

將步驟3)中的生物材料浸沒到端基為n-琥珀酰亞胺的redv溶液中充分反應8小時，清洗后干燥，得到表面含有redv的生物材料表面，其中，redv的濃度為1mg/ml。

實施例3制備條帶的寬度及間隔為50μm的生物材料

一種特異性促內皮細胞生長的抗凝血表面構建方法，具體包括如下步驟：

1)生物材料表面制備聚多巴胺層

將生物材料浸沒到ph為8.5的多巴胺溶液中，充分自聚合20小時，清洗后干燥，重復三次，多巴胺溶液的濃度為0.5mg/ml，得到有聚多巴胺層的生物材料表面；

2)生物材料表面微接觸印刷固定雙氨基聚乙二醇

將雙(3-氨基丙基)封端的聚乙二醇溶液滴加在條帶狀的微圖形聚二甲基硅氧烷(pdms)印章表面，條帶狀的微圖形聚二甲基硅氧烷印章表面充分吸附雙氨基聚乙二醇后，n2干燥，然后將pdms印章與步驟1)有聚多巴胺層的生物材料表面充分接觸2分鐘，清洗后干燥，得到氨基聚乙二醇改性的生物材料表面，其中，條帶的寬度及間隔為50μm，聚乙二醇溶液的濃度為0.5mg/ml；

3)生物材料表面固定殼聚糖和肝素

將步驟2)得到的生物材料首先浸沒到殼聚糖溶液中充分反應8小時，清洗干燥后，再浸沒到肝素溶液中充分吸附6小時，得到表面固定了殼聚糖和肝素的生物材料表面，殼聚糖及肝素溶液的濃度為5mg/ml；

4)生物材料表面固定redv

將步驟3)中的生物材料浸沒到端基為n-琥珀酰亞胺的redv溶液中充分反應6小時，清洗后干燥，得到表面含有redv的生物材料表面，其中，redv的濃度為0.5mg/ml。

將實施例1-3得到的生物材料，在同等試驗條件下，得到如圖2所示的生物材料表面典型的內皮細胞粘附生長圖，圖2(a)中條帶的寬度及間隔為5μm，圖2(b)中條帶的寬度及間隔為25μm，圖2(c)中條帶的寬度及間隔為50μm。細胞在5μm的圖形上隨機無規生長，當條帶的寬度及間隔增加，細胞呈現出規整排列，表現出定向生長行為。

將實施例2-3得到的生物材料，在同等試驗條件下，得到如圖3所示的生物材料表面改性后典型的血小板粘附圖，圖3(a)為對照樣品，圖3(b)與圖3(c)分別為條帶的寬度及間隔為25μm及50μm的樣品，可以看出，對照樣品表面有大量的血小板粘附，而經過表面改性后，血小板粘附數量大大減少，表明血液相容性得到顯著提高。