本發明涉及藥物用途的
技術領域：
，具體地說，本發明涉及一種阿魏菇多糖在疫苗佐劑中的應用。
背景技術：
：由于流浪犬生育無法控制，致使許多大城市流浪犬數量激增，傷人、咬死家畜和傳播疾病時有發生，過去控制流浪犬數量多是采用誘殺、棒打等不為人道的方法，這種捕殺方法方式較為殘忍，極容易引起愛狗人士的不滿以及社會輿論的壓力。采用犬zp3(caninezonapellucida3，czp3)為靶抗原，研制犬zp3dna疫苗pcdna3-czp3，不僅具有一定的抗生育效果，也具有廣泛的應用前景。但該疫苗存在抗原性不高，在使用過程中出現了免疫效果不佳，且疫苗抗原用量較高，不能達到對流浪犬的數量進行有效控制的目的。佐劑是指加入疫苗制劑后能促進、增強或延長機體對抗原特異性免疫應答的物質。佐劑也是一種抗原輔助劑,與疫苗共同使用可以明顯提高疫苗的免疫效果。佐劑被用來增強疫苗免疫作用已有80多年的歷史。免疫佐劑可輔佐免疫原刺激機體產生較早、較強、持久的免疫應答,現有的免疫佐劑存在免疫增強效果不理想，免疫力不持久等問題。阿魏菇，學名阿魏側耳，是一類食藥兩用珍稀真菌，因專性寄生或腐生于藥用植物阿魏的根莖上而得名。阿魏菇的子實體含有豐富的多糖、蛋白質、碳水化合物、多種維生素及礦物質等活性成分，具有較高的營養和藥用價值。多糖是一類特殊的生物活性物質，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、增強免疫力、抗輻射、降血脂等多種活性，被稱為生物反應調節劑，是繼核酸、蛋白質之后的另一種有待深入研究色生物大分子。阿魏菇多糖(pleurotusferulaepolysaccharide,pflp)是阿魏菇中的一種重要有效成分，能夠增強t細胞功能，促進抗體形成，誘導干擾素產生，從而使機體的免疫系統得到激活。王金輝、黃健等人對阿魏菇多糖免疫活性進行研究，發現阿魏菇多糖能顯著提高小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬能力，并且呈現明顯的劑量依賴性。此外，之前的研究表明純化的阿魏菇多糖可以有效的激活樹突狀細胞疫苗，但利用阿魏菇多糖作為佐劑聯合犬透明帶3dna免疫不育疫苗佐劑影響疫苗的免疫效果未見有報道。技術實現要素：為解決現有的犬透明帶3dna疫苗存在的抗原性不高，在使用過程中免疫效果不佳，且疫苗抗原用量較高，不能達到對流浪犬的數量進行有效控制的目的的問題，本發明提供阿魏菇多糖在制備犬透明帶3dna疫苗佐劑中的應用，能有效提高疫苗免疫效果，降低疫苗抗原用量。本發明通過以下技術方案實現的:阿魏菇多糖在制備犬透明帶3dna疫苗佐劑中的應用。優選的，本發明中的阿魏菇多糖由新鮮阿魏菇或阿魏菇凍干粉中提取獲得。優選的，本發明中的阿魏菇多糖的純度為96％。優選的，本發明應用中的阿魏菇多糖與犬卵透明帶3dna疫苗的質量比為1:1～10:1。更優選的，本發明應用中的阿魏菇多糖與犬卵透明帶3dna疫苗的質量比為2:1。進一步，阿魏菇多糖在制備犬透明帶3dna疫苗佐劑中的應用，接種步驟為先注射阿魏菇多糖，后注射pcdna3-czp3dna疫苗。阿魏菇多糖在制備犬透明帶3dna疫苗佐劑中的應用，接種步驟為pcdna3-czp3dna疫苗和阿魏菇多糖同時注射。阿魏菇多糖在制備犬透明帶3dna疫苗佐劑中的應用，免疫動物為犬類、小鼠、大鼠中的任意一種。通過實施本發明的技術方案，可以達到以下有益效果:(1)用阿魏菇多糖作為犬透明帶3dna疫苗佐劑，在用大鼠進行效果驗證實驗時，igg抗體水平相比于單用pcdna3-czp3組明顯升高，總產仔數相比于單用pcdna3-czp3組的41只阿魏菇多糖配伍之后下降至最低13只，展現出了良好的有效性，能夠更好的提高抗原的免疫原性，增強免疫效果。(2)用阿魏菇多糖制備的佐劑與犬透明帶3dna疫苗配合使用，不僅佐劑效果明顯，而且佐劑易獲得，質量容易控制。具體實施方式下面，舉實施例說明本發明，但是，本發明并不限于下述的實施例。本發明中選用的所有材料、試劑和儀器都為本領域熟知的，但不限制本發明的實施，其他本領域熟知的一些試劑和設備都可適用于本發明以下實施方式的實施。實施例一：阿魏菇多糖在制備犬透明帶3dna疫苗佐劑中的應用，其中，阿魏菇多糖與犬卵透明帶3dna疫苗的質量比為10:1。實施例二：阿魏菇多糖在制備犬透明帶3dna疫苗佐劑中的應用，其中，阿魏菇多糖與犬卵透明帶3dna疫苗的質量比為1:1。實施例三：阿魏菇多糖在制備犬透明帶3dna疫苗佐劑中的應用，其中，阿魏菇多糖與犬卵透明帶3dna疫苗的質量比為2:1。實施例四：阿魏菇多糖在制備犬透明帶3dna疫苗佐劑中的應用，其中，阿魏菇多糖與犬卵透明帶3dna疫苗的質量比為5:1。實施例五：阿魏菇多糖在制備犬透明帶3dna疫苗佐劑中的應用，其中，阿魏菇多糖與犬卵透明帶3dna疫苗的質量比為7:1。實施例六：阿魏菇多糖在制備犬透明帶3dna疫苗佐劑中的應用，其中，阿魏菇多糖與犬卵透明帶3dna疫苗的質量比為9:1。實施例七：阿魏菇多糖在制備犬透明帶3dna疫苗佐劑中的應用，其中，阿魏菇多糖與犬卵透明帶3dna疫苗的質量比為3:1。實施例八：阿魏菇多糖在制備犬透明帶3dna疫苗佐劑中的應用，其中，阿魏菇多糖與犬卵透明帶3dna疫苗的質量比為8:1。實施例九：阿魏菇多糖在制備犬透明帶3dna疫苗佐劑中的應用，其中，阿魏菇多糖與犬卵透明帶3dna疫苗的質量比為6:1。實施例十：阿魏菇多糖在制備犬透明帶3dna疫苗佐劑中的應用，其中，阿魏菇多糖與犬卵透明帶3dna疫苗的質量比為4:1。實施例十一：阿魏菇多糖在制備犬透明帶3dna疫苗佐劑中的應用，其中，接種步驟為先注射阿魏菇多糖，后注射pcdna3-czp3dna疫苗。實施例十二：阿魏菇多糖在制備犬透明帶3dna疫苗佐劑中的應用，其中，接種步驟為先注射pcdna3-czp3dna疫苗，后注射阿魏菇多糖。實施例十三：阿魏菇多糖在制備犬透明帶3dna疫苗佐劑中的應用，其中，接種步驟為pcdna3-czp3dna疫苗和阿魏菇多糖同時注射。實施例十四：將上述實施例一至十提供的十個不同方案分別按照實施例十三提供的注射步驟進行系列效果驗證試驗，隨機抽取樣本實驗結果如下所示：1、取40只6～8周齡雌性balb/c小鼠隨機分為4組，每組小鼠10只。具體劃分為:1注射生理鹽水對照組；2注射質粒pcdna3-czp3組(100μg/鼠)；31:1注射組：注射pcdna3-czp3(100μg/鼠)+阿魏菇多糖(100μg/鼠)，；42:1注射組：注射pcdna3-czp3(100μg/鼠)+阿魏菇多糖(200μg/鼠)然后對小鼠后肢肌內進行注射；在小鼠初次免疫后14d進行第2次加強免疫、第2次免疫后14d進行第3次加強免疫，在初次免疫14d、二免后14d和三免14d后，分別在小鼠眼后眶采血，測定免疫小鼠血清igg的抗體水平。結果如表1所示：表1：小鼠血清中igg抗體的間接elisa檢測的od值注：*p＜0.05，***p＜0.001，均與pcdna3-czp3實驗組相比由表1可知，較pcdna3-czp3組相比阿魏菇多糖組小鼠血清igg的抗體水平顯著升高，從第2次免疫開始就有極顯著差異(p＜0.001)，pcdna3-czp3+pfp(200μg)組igg升高水平更為顯著。2、取免疫小鼠的脾細胞懸液測定cd4+、cd8+、cd4+和cd8+細胞的比值，結果如表2所示：表2：對免疫小鼠脾中cd4+和cd8+細胞亞群的影響組別cd4+(％)cd8+(％)cd4+/cd8+0.9％nacl27.37±1.5711.13±0.282.45±0.08pcdna3-czp332.37±0.9611.47±0.502.83±0.08pcdna3-czp3+pfp(100μg)39.30±1.40*16.23±0.69**2.42±0.05**pcdna3-czp3+pfp(200μg)45.87±0.90***19.42±0.24***2.19±0.03***注：*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，均與pcdna3-czp3實驗組相比由表2可知，阿魏菇多糖組能同時提高小鼠脾cd4+t淋巴細胞和cd8+t淋巴細胞的百分比，同時降低cd4+/cd8+的比值，pcdna3-czp3+pfp(200μg)組的變化更為顯著，可見加入阿魏菇多糖作為佐劑有利于cd4+t淋巴細胞和cd8+t淋巴細胞向ctl細胞的分化。3、三次免疫后的14d，將具有正常生育能力的balb/c雄鼠按照1：3的比例與免疫過的雌鼠進行合籠，每天輪換雄鼠。21d后將雄鼠取出，觀察統計雌鼠的窩仔數，計算抗生育率，結果如表3所示：表3：小鼠抗生育免疫實驗結果由表3可知，免疫阿魏菇多糖組相比于pcdna3-czp3疫苗單獨免疫組免疫小鼠的不育率明顯增加，總產仔數相比于pcdna3-czp3組的41只阿魏菇多糖配伍之后下降到17只，pcdna3-czp3+pflp(200μg)組低至13只。此外，用斯皮爾曼相關系數分析小鼠抗體水平和產仔數之間的關系，結果表明無論是單獨免疫pcdna3-czp3組、阿魏菇多糖佐劑組小鼠抗體水平和產仔數均呈負相關。繼續用犬類和大鼠以上述步驟進行實驗，得出相同的實驗結論：用阿魏菇多糖作為犬透明帶3dna疫苗佐劑，igg抗體水平相比于單用pcdna3-czp3組升高明顯，不育率顯著升高。實施例十五：按照實施例十四所述的試驗方法進行多次重復試驗，采用阿魏菇多糖的純度為96％，將小鼠按注射阿魏菇多糖與犬卵透明帶3dna疫苗的不同質量比分為1：1組、2:1組、3:1組、4:1組、5:1組、6:1組、7:1組、8:1組、9:1組和10:1組，不同組別的不育率如表4所示：表4：不同阿魏菇多糖與犬卵透明帶3dna疫苗的質量比小鼠不育率組別1:1組2:1組3:1組4:1組5:1組6:1組7:1組8:1組9:1組10:1組不育率(％)41.6156.2950.5848.4345.3246.7349.6539.4741.2230.57由表4可知，在阿魏菇多糖與犬卵透明帶3dna疫苗的質量比為1:1至10:1之間，小鼠的不育率與質量比不呈正相關關系，在2:1時不育率最高，免疫效果最佳。綜上所述通過實施本發明的技術方案，本發明提供的用阿魏菇多糖作為犬透明帶3dna疫苗佐劑，用阿魏菇多糖作為犬透明帶3dna疫苗佐劑，在進行效果驗證實驗時，igg抗體水平相比于單用pcdna3-czp3組升高明顯，總產仔數相比于單用pcdna3-czp3組的41只阿魏菇多糖配伍之后下降至最低13只，展現出了良好的有效性，能夠更好的提高抗原的免疫原性，增強免疫效果；用阿魏菇多糖制備的佐劑與犬透明帶3dna疫苗配合使用，不僅佐劑效果明顯，而且佐劑易獲得，質量容易控制。如上所述，即可較好地實現本發明,上述的實施例僅僅是對本發明的優選實施方式進行描述，并非對本發明的范圍進行限定，在不脫離本發明設計精神的前提下，本領域普通技術人員對本發明的技術方案做出的各種改變和改進，均應落入本發明確定的保護范圍內。當前第1頁12