本發明涉及生物制藥領域，具體涉及一種免疫增強劑、口蹄疫滅活疫苗及其制備方法。
背景技術：
口蹄疫(foot-and-mouthdisease,fmd)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouthdiseasevirus,fmdv)引起的一種急性、熱性、高度接觸傳染性的傳染病。口蹄疫病毒屬小rna病毒科(picornaviridae)口蹄疫病毒屬(aphthavirus)，有7個血清型：a、o、c、sat1、sat2、sat3以及asia1型，每個血清型又包含若干個亞型。該病毒不僅在各型間沒有交叉免疫性，同血清型的各亞型之間也僅有部分交叉免疫性。2012年，國務院辦公廳印發了《國家中長期動物疫病防治規劃(2012—2020年)》，將口蹄疫列為優先防治病種之一。
在我國，口蹄疫疫苗屬于強制免疫疫苗，滅活疫苗是目前使用的疫苗主體，但其也有如抗體產生慢、免疫期短、抗原譜窄，滅活不徹底等不足之處。現在，許多研究人員正在改進和研究新的滅活疫苗，如新的流行毒株，生產工藝，使抗原更純，免疫效果更好，佐劑更有效，滅活更加可靠等，但每項工藝的研究周期和驗證周期都比較長。而豬群常規的口蹄疫疫苗免疫次數一般要免疫2～3次，但免疫保護持續期僅3～4個月，加強免疫后保護效力也最高僅為70～80％。因此，口蹄疫疫苗存在很大的質量提升空間，免疫增強劑改進是可行技術途徑之一。
黃芪多糖可顯著增強非特異性免疫功能和體液免疫功能，黃芪多糖能誘導機體產生干擾素，干擾病毒在機體內的復制，提高機體的免疫功能；并能強化和刺激淋巴細胞和網狀內皮層細胞的生成，增強網狀內皮層細胞和巨噬細胞的吞噬功能，并對體液、粘膜和細胞免疫有很好的促進和調節作用。作為飼料添加劑在動物養殖上的應用，具有促進動物生長，提高機體抵抗力等效力。其作為天然產品具有來源豐富、價格低廉、長期使用對組織細胞毒副作用小、殘留低。然而在飼料或飲水中添加量較大，基本用量至少為克/天，造成較大的浪費且免疫增強效力不確實或者較難評價。
toll樣受體(tlr)是存在于哺乳動物免疫細胞的一類跨膜蛋白，其主要免疫學功能是監視與識別各種不同的病原微生物相關分子(tlr激動劑)，快速誘發先天性免疫反應，為抗原特異性獲得性免疫反應打下基礎。tlr激動劑應用于獸用疫苗研究多處于實驗室階段，大量研究結果表明tlr激動劑可以用于疫苗免疫增強劑。在疫苗中添加tlr激動劑，例如cpg、polyi:c、咪喹莫特等，均有明顯的免疫增強效力。其中tlr4激動劑已于2009年批準應用于乙型肝炎和人乳頭瘤病毒疫苗。
現存的主要應用瓶頸是多數tlr激動劑制造成本太高問題。
技術實現要素：
發明目的：本發明所要解決的技術問題是提供了一種復方免疫增強劑。本發明在于提供一種復方免疫增強劑，使用微量tlr激動劑，配合使用微量中藥免疫增強劑黃芪多糖可以產生協同增效作用，不僅降低了單獨使用tlr激動劑類免疫增強劑的成本，也提高了免疫效力，更好的提高了口蹄疫疫苗的免疫效果，對于仔豬可以一針保護到出欄，同時縮短抗體產生的窗口期至7天，抗體持續期延長至8個月以上，顯著降低養豬成本。
本發明還要解決的技術問題是提供了復方免疫增強劑的制備方法。
本發明還要解決的技術問題是提供了含復方免疫增強劑的口蹄疫滅活疫苗。
本發明還要解決的技術問題是提供了含復方免疫增強劑的口蹄疫滅活疫苗的制備方法。
技術方案：為了解決上述問題，本發明的技術方案是提供一種復方免疫增強劑，所述復方免疫增強劑含有單磷酰脂a5～520μg/ml、胞壁酰二肽10～520μg/ml、β-葡聚糖1～520μg/ml和黃芪多糖0.05～5.2mg/ml。
其中，作為優選，上述免疫增強劑含有單磷酰脂a單磷酰脂a5～500μg/ml、胞壁酰二肽10～500μg/ml、β-葡聚糖1～500μg/ml和黃芪多糖0.05～5.0mg/ml。
其中，作為優選，所述免疫增強劑含有單磷酰脂a100～500μg/ml、胞壁酰二肽100～500μg/ml、β-葡聚糖50～500μg/ml和黃芪多糖1～5.0mg/ml。
本發明內容還包括上述的免疫增強劑的制備方法，包括以下步驟：
1).配制含有單磷酰脂質a、胞壁酰二肽、β-葡聚糖和黃芪多糖的溶液，與吐溫-80混合，得到成水相溶液；
2).將白油和司盤-80混合，得到油相溶液；
3).將所述水相溶液與油相溶液混合乳化后得到含復方免疫增強劑的伴侶疫苗。
本發明內容還包括上述的免疫增強劑在制備疫苗方面的應用。
本發明內容還包括上述的一種含有所述的含復方免疫增強劑的口蹄疫滅活疫苗。
其中，上述口蹄疫滅活疫苗還包括滅活的抗原溶液。
其中，上述口蹄疫滅活疫苗中的滅活的抗原溶液與復方免疫增強劑的體積比為9:1～8:1。
其中，上述滅活的抗原溶液為含o，a，亞i型口蹄疫滅活抗原、多肽或其他基因工程表達產物中的一種或幾種。
本發明內容還包括上述含復方免疫增強劑的口蹄疫滅活疫苗的制備方法，包括以下步驟：
1)將復方免疫增強劑與滅活的抗原溶液混合，再與吐溫-80混合得到水相溶液；
2)將白油和司盤-80混合，得到油相溶液；
3)將所述水相溶液與油相溶液充分混合即得含復方免疫增強劑的口蹄疫滅活疫苗。
有益效果：本發明相對于現有技術，具有以下優點：
1、本發明研制了一種復方免疫增強劑，將其與口蹄疫滅活疫苗混合后使用可以有效的提高疫苗的效力，不但可以提高抗體的合格率和平均抗體水平，還可以明顯的縮短抗體產生的窗口期至7天，同時提高抗體的持續期至7個月以上。
2、黃芪多糖來源豐富、價格低廉、長期使用對組織細胞毒副作用小、殘留低，添加少量黃芪多糖可以明顯降低其他三種toll樣受體激動劑的用量，降低了90％的生產成本，但免疫效力卻沒有下降。
3、本發明的復方免疫增強劑和口蹄疫滅活疫苗聯合使用，可以明顯提高疫苗的免疫效力，豬場可以根據自身情況減少疫苗免疫次數，從而減少養殖成本，減少豬群應激。
附圖說明
圖1含復方免疫增強劑疫苗免疫后的平均抗體水平及抗體持續期；具體為各組含不同復方免疫增強劑組分的o型fmd滅活疫苗免疫仔豬后不同時間點的平均液相阻斷
elisa抗體水平。
具體實施方式
下面結合附圖對本發明作更進一步的說明。
實施例1：復方免疫增強劑、口蹄疫疫苗的制備
1、實驗材料
單磷酰脂質a縮寫為mpl。
胞壁酰二肽縮寫為mdp。
mpl、mdp和β-葡聚糖均購自invivogen公司。
黃芪多糖購自陜西正大生物科技有限公司。
isa206購自賽百克公司，白油，司本，吐溫為本實驗室自行采購。
滅活的豬o型口蹄疫病毒液(毒株為豬o型口蹄疫病毒緬甸98株)，經二乙烯亞胺滅活，146s含量為5.87μg/ml，內蒙古金宇集團惠贈。
商品化的口蹄疫o、a、亞i三價疫苗購自內蒙古金宇集團。
6-7周齡健康易感仔豬，液相阻斷elisa抗體滴度≤1:8。
本發明采用口蹄疫液相阻斷elisa試劑盒(蘭州獸醫研究所)檢測液相阻斷elisa抗體滴度。
1、免疫增強劑的配置
免疫增強劑的主要成份為：單磷酰脂質a(mpl)，胞壁酰二肽(mdp)，β-葡聚糖和黃芪多糖。其制備方法為將各主要成份溶解于ph8.0的0.1mtris-hcl中。
復方免疫增強劑1：配置mpl、mdp、β-葡聚糖和黃芪多糖終濃度分別為5μg/ml、10μg/ml、1μg/ml和0.05mg/ml。
復方免疫增強劑2：配置mpl、mdp、β-葡聚糖和黃芪多糖終濃度分別為100μg/ml、100μg/ml、50μg/ml和1mg/ml。
復方免疫增強劑3：配置mpl、mdp、β-葡聚糖和黃芪多糖終濃度分別為500μg/ml、500μg/ml、500μg/ml和5mg/ml。
復方免疫增強劑4：配置mpl、mdp、β-葡聚糖和黃芪多糖終濃度分別為5μg/ml、10μg/ml、1μg/ml和20mg/ml。
復方免疫增強劑5：配置mpl、mdp、β-葡聚糖和黃芪多糖終濃度分別為500μg/ml、500μg/ml、500μg/ml和20mg/ml。
免疫增強劑6：配置黃芪多糖終濃度為20mg/ml。
免疫增強劑7：配置黃芪多糖終濃度為5mg/ml。
免疫增強劑8：配置mpl、mdp、β-葡聚糖終濃度分別為2mg/ml、40mg/ml、0.2mg/ml。
將配制好的復方免疫增強劑過濾(0.22μm濾器)除菌后分裝至青瓶中，4℃保存。
口蹄疫疫苗制備方法
第一種方法：制備復方免疫增強劑伴侶疫苗，即復方免疫增強劑與吐溫按照體積比為96:4，充分混合均勻做為水相；白油與司本按照體積比96:4混合均勻作為油相；按照水相：油相體積比為1:2進行疫苗制備，制備成的疫苗即為復方免疫增強劑伴侶疫苗。復方免疫增強劑伴侶疫苗使用前按照體積比1:9與商品化疫苗充分混勻即可。
第二種方法：將復方免疫增強劑與滅活的豬o型口蹄疫病毒液按照體積比為1:9充分混合，制備為水相溶液。先將isa206和水相溶液分別放置于室溫，大約30分鐘。將isa206放入乳化罐中，在200轉/分，將水相溶液放入乳化罐中，攪拌均勻；在2000轉/分攪拌10分鐘，得到疫苗，其中水相與isa206的體積比為46:54。
采用上述兩種方法制備的疫苗，在復方免疫增強劑終濃度相同的條件下，免疫效果上基本一致，只是方便生產上不同需求的用戶使用。
本實施例中，復方免疫增強劑的各組分可以在給出范圍內靈活配比，在此不一一列舉。
實施例2：復方免疫增強劑對口蹄疫滅活疫苗的免疫效力評價
1、疫苗制備
本實施例按照實施例1的第二種方法制備口蹄疫疫苗：
將復方免疫增強劑1與滅活抗原按照1:9混合后做為水相溶液，將isa206放入乳化罐中，在200轉/分，將水相溶液放入乳化罐中，攪拌均勻，在2000轉/分攪拌10分鐘，制備成的口蹄疫滅活疫苗稱為含復方免疫增強劑的fmd滅活疫苗1：簡稱fmd1。
復方免疫增強劑2、3、4、5、6、7的疫苗制備方法同復方免疫增強劑1，制備獲得含復方免疫增強劑的fmd滅活疫苗2、3、4、5、6、7：簡稱fmd2、3、4、5、6、7。
將免疫增強劑8與滅活抗原按照1:1混合后，制備成的口蹄疫滅活疫苗稱為含復方免疫增強劑的fmd滅活疫苗8：簡稱fmd8(按照專利zl201310042983.0進行制備疫苗，將免疫增強劑與滅活的豬口蹄疫病毒液按照體積比1:1混合，得到水相溶液。將isa206和水相溶液分別放置于室溫，大約30分鐘。將isa206放入乳化罐中，在200轉/分，將水相溶液放入乳化罐中，攪拌均勻，在2000轉/分攪拌10分鐘，得到疫苗)。
將0.1mph8.0的tris-hcl與滅活抗原按照1:9混合后做為水相溶液，將isa206放入乳化罐中，在200轉/分，將水相溶液放入乳化罐中，攪拌均勻，在2000轉/分攪拌10分鐘，制備成的口蹄疫滅活疫苗稱為fmd對照疫苗。
2、分組、免疫和抗體檢測
實驗分組及免疫：將健康易感仔豬隨機分組，每組10頭，共6組。每組疫苗各免疫一組健康易感仔豬，免疫劑量為2ml。
免疫后采血：
對免疫后的抗體產生情況進行監測：免疫后第7天、14天、21天和第28天，對各組健康易感仔豬采血分離血清，蘭獸研液相阻斷elisa抗體檢測試劑盒檢測疫苗免疫后的抗體產生情況和窗口期；
對免疫后豬只進行抗體持續期監測：分別在免疫后28天、60天、90天、120天、150天、180天和210天分別采血，蘭獸研液相續斷elisa抗體檢測試劑盒檢測疫苗免疫后的抗體產生情況；
(當液相阻斷elisa抗體滴度大于等于26為抗體合格。)
免疫后抗體合格率如表1，表2所示。
免疫后的平均抗體水平如圖1所示。
表1各組仔豬免疫后抗體合格率
備注：表1中7dpv、14dpv、21dpv、28dpv分別代表免疫后7天、免疫后14天、免疫后21天、免疫后28天；上/下數字分別代表：抗體達到合格線的豬的頭數/免疫豬的頭數；
從表1可以看出，免疫fmd對照疫苗的仔豬，在免疫后7天抗體10頭免疫豬的抗體僅有2頭達到合格線，合格率為2/10；單獨添加黃芪多糖為免疫增強劑的組別fmd6，在高劑量水平有一定的免疫增強作用，但是效果也不理想，明顯較fmd1/fmd2/fmd3組差(合格率8/10，8/10及9/10)；單獨的低劑量黃芪多糖組(fmd7)的免疫增強效果更差；高劑量的黃芪多糖與不同劑量的mpl、mdp和β-葡聚糖復配后(fmd4/fmd5)，沒有明顯的免疫增強作用，但更低劑量的黃芪多糖與低劑量的mpl、mdp和β-葡聚糖復配后(fmd1/fmd2/fmd3)，可以明顯縮短抗體的窗口期至7天，7天即可達到80％以上的抗體達到合格線以上(液相阻斷elisa抗體大于26)，且不降低抗體的合格率(與fmd8比較)。fmd6組，也有明顯的免疫增強水平，但是在抗體產生的窗口期上要比fmd1/fmd2/fmd3相對延后7天，在免疫后14天的抗體合格率與復方免疫增強劑1/2/3(fmd1/fmd2/fmd3)相當，在免疫后14天的抗體合格率與對應的復方免疫增強劑1，2，3(fmd1/fmd2/fmd3)組免疫后7天合格率相當。
表2各組仔豬免疫后抗體持續期內的抗體合格率
從表2可以看出，復方免疫增強劑配方1，2，3即fmd1/fmd2/fmd3三組免疫后均可明顯延長疫苗的抗體持續期，監測至免疫后7個月抗體合格率無明顯下降，維持在10/10；而fmd對照疫苗最高合格率基本在3/10，單獨的黃芪多糖組(fmd6/fmd7)，有一定的免疫增強作用，但效果不明顯，與fmd對照疫苗差異不顯著。
從圖1可以看出，復方免疫增強劑1，2，3(fmd1/fmd2/fmd3)組及免疫增強劑8(fmd8)組可以明顯提高fmd疫苗的免疫效力，縮短抗體產生的窗口期，在免疫后7天，平均液相阻斷elisa抗體水平已高于26，遠遠高于對照疫苗組的23，提高平均抗體水平和抗體持續期。單獨的黃芪多糖(fmd6/fmd7)和高劑量黃多糖與mpl、mdp和β-葡聚糖配伍組(fmd4/fmd5)沒有明顯的免疫增強效果。
因此，由于復方免疫增強劑中添加了一定劑量的黃芪多糖與mpl、mdp和β-葡聚糖的協同效應，能夠顯著提高仔豬對抗原的免疫應答，提高抗體合格率和提早抗體產生時間，進而縮短疫苗產生抗體的窗口期至免疫后7天，提高疫苗的免疫效果。
本實施例中，免疫增強劑的各組分可以在給出范圍內靈活配比，在此不一一列舉。
實施例3：配制復方免疫增強劑伴侶疫苗
1、復方免疫增強劑的配制：
復方免疫增強劑的主要成份為：單磷酰脂質a，胞壁酰二肽，β-葡聚糖和黃芪多糖。其制備方法為將各主要成份溶解于ph8.0的0.1mtris-hcl。
復方免疫增強劑9：配置mpl、mdp、β-葡聚糖和黃芪多糖終濃度分別為5.2μg/ml、10.4μg/ml、1.04μg/ml和0.052mg/ml。
復方免疫增強劑10：配置mpl、mdp、β-葡聚糖和黃芪多糖終濃度分別為104μg/ml、104μg/ml、52μg/ml和1.04mg/ml。
復方免疫增強劑11：配置mpl、mdp、β-葡聚糖和黃芪多糖終濃度分別為520μg/ml、520μg/ml、520μg/ml和5.2mg/ml。
將配制好的復方免疫增強劑過濾(0.22μm濾器)除菌后分裝至青瓶中，4℃保存。
2、復方免疫增強劑的伴侶疫苗制備：
(1)、將復方免疫增強劑與吐溫按照96:4進行混勻，制備為水相。
(2)、將白油與司本按照96:4進行充分混合。
(3)、將水相與油相按照體積比1:2充分混合制備為含復發免疫增強劑的伴侶疫苗。按照此方法制備好復方免疫增強劑伴侶疫苗分別根據有復方免疫增強劑9、10、11制備而來命名為復方免疫增強劑伴侶9、10、11。
3、使用方法
取300μl含復方免疫增強劑的伴侶疫苗與1頭份疫苗充分混合后免疫。
本實施例中，復方免疫增強劑的各組分可以在給出范圍內靈活配比，使用體積也可依據實際需要調整，在此不一一列舉。
實施例4復方免疫增強劑伴侶疫苗對商品化o、a、亞i三價苗的免疫效力評價
1、疫苗制備：
復方免疫增強劑伴侶疫苗采用實施例3中制備的三種伴侶疫苗。
三價疫苗為o，a，亞i三價滅活疫苗(精品苗)批號5235039，20151224
2、分組、免疫和抗體檢測
實驗分組及免疫：將健康易感仔豬隨機分組，每組10頭，共4組。
每組疫苗各免疫一組健康易感仔豬。
表3疫苗免疫及分組
免疫后采血：
對免疫后的抗體產生情況進行監測：免疫后第7天、14天、21天和第28天，對各組健康易感仔豬采血分離血清，蘭獸研液相阻斷elisa抗體檢測試劑盒檢測疫苗免疫后的抗體產生情況和窗口期；
對免疫后免疫增強效果較好的復方免疫增強劑組進行抗體持續期監測：分別在免疫后28天、60天、90天、120天、150天、180天和210天分別采血，蘭獸研液相續斷elisa抗體檢測試劑盒檢測疫苗免疫后的抗體產生情況；
(o型液相阻斷elisa抗體滴度大于等于26為抗體合格，a和亞i型液相阻斷elisa抗體滴度大于等于27為抗體合格。)
免疫后抗體合格率如表4，表5所示。
表4各組仔豬免疫后抗體合格率
從表4可以看出，免疫三價疫苗的仔豬，在免疫后7天三個血清型的抗體合格率僅為20％，30％和10％；而免疫了復方免疫增強劑伴侶疫苗9/10/11+三價疫苗的仔豬，在免疫后7天即可達到合格率為70～90％，窗口期明顯縮短；液相阻斷elisa抗體合格率也明顯升高。
表5各組仔豬免疫后抗體持續期內的抗體合格率
從表5可以看出，免疫三價疫苗的仔豬的抗體從免疫后90日齡開始出現緩慢下降；而免疫了復方免疫增強劑伴侶疫苗9/10/11+三價疫苗的仔豬，在免疫后28天后抗體水平基本穩定，持續至7個月沒有明顯的下降趨勢；添加了復方免疫增強劑伴侶疫苗的免疫組，明顯延長了疫苗的抗體持續期。
綜上，復方免疫增強劑伴侶疫苗對o，a，亞i三價口蹄疫滅活疫苗的免疫效力有明顯的提高作用。對o，a，亞i三種血清型的抗體均有明顯的免疫增強作用，且明顯縮短疫苗抗體產生的窗口期，提高疫苗的抗體持續期。
實施例5復方免疫增強劑伴侶疫苗對商品化多肽疫苗的免疫效力評價
1、疫苗制備：
復方免疫增強劑伴侶疫苗采用實施例3中制備的三種伴侶疫苗。
多肽疫苗批號：(2014)090297522
2、分組、免疫和抗體檢測
實驗分組及免疫：將健康易感仔豬隨機分組，每組10頭，共4組。
每組疫苗各免疫一組健康易感仔豬。
表6疫苗免疫及分組
免疫后采血：
對免疫后的抗體產生情況進行監測：免疫后第7天、14天、21天和第28天，對各組健康易感仔豬采血分離血清，蘭獸研液相阻斷elisa抗體檢測試劑盒及豬口蹄疫病毒vp1結構蛋白抗體酶聯免疫吸附試驗診斷試劑盒(多肽抗體檢測試劑盒，購自上海申聯公司)，分別檢測疫苗免疫后的抗體產生情況；
對免疫后免疫增強效果較好的復方免疫增強劑組進行抗體持續期監測：分別在免疫后28天、60天、90天、120天、150天、180天和210天分別采血，蘭獸研液相阻斷elisa抗體檢測試劑盒檢測疫苗免疫后的血清抗體產生情況；
(當液相阻斷elisa抗體滴度大于等于26為抗體合格，多肽抗體檢測采用試劑盒判定標準判定陰陽性。)
免疫后兩種試劑盒檢測的抗體合格率如表7，表8所示。
表7各組仔豬免疫后抗體合格率
從表7可以看出，免疫多肽苗的仔豬，在免疫后7天后多肽抗體合格率為4/10，但液相阻斷elisa抗體合格率為0；而免疫了復方免疫增強劑伴侶疫苗9/10/11+多肽苗的仔豬，在免疫后7天多肽苗的抗體合格率為8/10或者9/10，液相阻斷elisa抗體抗體的合格率也可以提高至5/10或6/10左右；在蘭獸研的液相阻斷elisa抗體檢測試劑盒中可見，液相阻斷elisa抗體水平與攻毒保護具有一定的相關性，特別是抗體水平越高，保護效力越好。復方免疫增強劑伴侶疫苗可以明顯縮短多肽苗抗體產生的窗口期，提高液相阻斷elisa抗體的合格率。
表8各組仔豬免疫后抗體持續期內的抗體合格率
從表8可以看出，免疫多肽苗的仔豬的抗體從免疫后90日齡開始出現緩慢下降；而免疫了復方免增強劑伴侶疫苗9/10/11+多肽疫苗的仔豬，在免疫后21天后抗體水平基本穩定，可維持至7個月無明顯的下降趨勢；添加了復方免疫增強劑伴侶疫苗的免疫組，明顯延長了疫苗的抗體持續期。
綜上，復方免疫增強劑伴侶疫苗對口蹄疫多肽疫苗的免疫效力有明顯的提高作用。且明顯可以提高液相阻斷elisa抗體的合格率，且明顯縮短疫苗抗體產生的窗口期，提高疫苗的抗體持續期。
以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出：對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。