本發明涉及生物制藥技術領域，涉及一種內源性非編碼小rnas的新藥及其用途，尤其是涉及mir-142-3p用于預防和/或治療心臟疾病的組合物及應用。

背景技術：

心血管疾病主要包括高血壓、冠心病和充血性心力衰竭等，心血管疾病是人類健康的頭號殺手，全世界范圍內每年有一千七百萬人死于心血管疾病，其死亡率已接近所有癌癥死亡率的總和。隨著人民生活水平日益提高和飲食結構的改變，心血管疾病死亡率呈明顯上升趨勢，已超過癌癥成為第一大致死原因，預防和治療心血管疾病仍然是醫學與生物學的重大任務。

心肌肥大是指組織水平上心肌組織的增厚和細胞水平上心肌細胞體積的增大的總稱，是由于心肌細胞體積增大而導致心臟體積增大所發生的一種疾病。該病是由一些生理和病理因素的共同刺激而發生的，是許多心血管疾病的綜合性表現；心肌肥大是心肌病的一種，是心肌細胞針對于血液動力學增加的一種應答反應，多種情況可引起人體內血液動力的增加，如高血壓，心臟瓣膜疾病。長期的超負荷血液動力刺激會引起以心肌細胞體積增大為特征的心肌細胞重塑過程，就是心肌肥大?，F在一般認為存在兩種情況的心肌肥大，一種是正常的生理性肥大，比如出生后伴隨著發育發生的心肌肥大，還有體育鍛煉引起的心肌肥大；另外一種是病理性心肌肥大，其早期特征是室壁和室間隔增厚，心肌收縮功能增強，因此被視為代償性肥大，如果病情一直未得到緩解，心肌肥大后期會發生心室壁間質纖維化、心肌細胞收縮功能失調以及能量代謝，基因表達和電生理特征的異常，最終導致心臟功能衰竭。鑒于心肌肥大的發生是一個進行性不可逆過程，而且最終會引起心力衰竭，現代醫學已經把它作為心臟發生臨床病變的一個里程碑式的心肌形態變化，認為它是導致心臟疾病和心臟猝死的一個危險因素。

隨著近來mirna研究應用的熱潮，內源性非編碼小rnas已經作為一個基因表達調節的中心因子顯露，參加許多重要的生理過程，對于mirna來說，調控方式的特點決定其靶基因不會只有一個，是一對多的方式，使得mirna的功能究內容豐富；mirna對于維持心臟正常生理功能具有重要作用，心臟中的mirna異常表達與許多心臟疾病的發生相關。因此，將mirna作為心臟疾病治療的靶點，開發相關藥物具有潛在的臨床應用價值。

盡管越來越多的mirna作為人類疾病的生物標志物及治療靶點被發現，但在心臟肥厚和心肌纖維化心臟疾病中的關鍵mirna仍沒有確定。

針對現有技術中存在的上述問題，特提出本發明。

技術實現要素：

本發明的目的是確定或發現調控心肌細胞肥大的在心臟中表達的mirna，確定其在心肌肥大、冠心病、心肌纖維化等心臟疾病中的關鍵作用，將其應用到這些心臟疾病的診斷、防治中。所以本發明提供了一種mir-142-3p在制備用于預防和/或治療心臟疾病方面的應用。

本發明的另一個目的在于提供一種用于預防和/或治療心臟疾病的組合物。

本發明的第三個目的是提供一種用于預防和/或治療心臟疾病的產品。

為解決上述技術問題，本發明采用如下技術方案：

一種用于預防和/或治療心臟疾病的組合物，所述組合物含有如下任一種物質：

ⅰ、mir-142-3p；

ⅱ、含有mir-142-3p的編碼基因的重組載體；

ⅲ、含有mir-142-3p的編碼基因的重組病毒；

ⅳ、含有mir-142-3p的編碼基因的重組病毒載體。

優選地，所述mir-142-3p的核苷酸序列如seqidno.1所示。

所述seqidno.1的序列如下：

uguaguguuuccuacuuuaugga。

上述的組合物在制備用于預防和/或治療心臟疾病的藥物中的應用。

優選地，所述組合物還包括藥學上可接受的載體或輔料。

優選地，所述藥學上可接受的載體或輔料選自殼聚糖、膽固醇、脂質體和納米顆粒中的一種或幾種。

優選地，所述藥物的劑型包括口服制劑、注射制劑、片劑和干粉劑中的一種或幾種。

優選地，所述心臟疾病包括心機肥厚、心機纖維化、冠心病或心衰。

優選地，所述診斷和/或預防和/或治療心臟疾病是通過mir-142-3p過表達能抑制心肌細胞肥大的發生實現的。

一種用于預防和/或治療心臟疾病的產品，所述產品含有如下任一種物質：

ⅰ、mir-142-3p；

ⅱ、含有mir-142-3p的編碼基因的重組載體；

ⅲ、含有mir-142-3p的編碼基因的重組病毒；

ⅳ、含有mir-142-3p的編碼基因的重組病毒載體；

其中，所述mir-142-3p的核苷酸序列如seqidno.1所示，所述產品包括藥物。

本發明的有益效果如下：

本發明在大量實驗的基礎上，證明mir-142-3p通過抑制心肌細胞肥大對心臟具有保護作用，它對許多心臟疾病具有潛在的預防和治療價值，可成為一種治療心肌肥大，預防心肌纖維化的藥物。具體的，可以合成mir-142-3p的核苷酸并與適當載體如膽固醇，納米顆粒，脂質體等連接形成藥物，通過口服，靜脈或肌肉注射的方式，心肌肥大和心肌纖維化等心臟疾病進行治療。

附圖說明

為了更清楚地說明本發明具體實施方式或現有技術中的技術方案，下面將對具體實施方式或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發明的一些實施方式，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為心臟肥大刺激因子angⅱ(血管緊張素)誘導的心肌細胞肥大過程中mir-142-3p表達水平的變化情況；

圖2a為原代心肌細胞轉染angⅱmimics后對心肌細胞表面積的抑制情況；

圖2b為原代心肌細胞轉染angⅱmimics后其蛋白/dna比率的變化情況；

圖2c為原代心肌細胞轉染angⅱmimics后肥大標志基因anf表達的變化情況；

圖3表明原代心肌細胞轉染angⅱmimics其肌小節重排的情況。

具體實施方式

下面將結合附圖對本發明的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。

本發明的發明人發現，mir-142-3p在肥大的心肌細胞中表達顯著下調。通過脂質體轉染mir-142-3p模擬物(mimics)發現，mir-142-3p過表達在細胞水平能抑制心肌細胞肥大的發生，大鼠乳鼠心肌原代細胞過表達mir-142-3p后在用肥大刺激因子處理后與對照組相比有了明顯的肥大表型及纖維化程度的降低，同時一些肥大基因的表達也與對照組相比有了明顯的降低。

具體的，本發明發現mir-142-3p在肥大的心肌細胞中與對照組相比有了明顯的下降，對其進行肥大指標的檢測發現，心肌肥大的指標如細胞表面積，蛋白/dna的比值及肌小節的重組也與對照組相比都有了明顯的下降。以上實驗說明mir-142-3p能夠抑制心肌肥大的發生，這意味著mir-142-3p可作為一種早期診斷和早期預防心肌肥大，心肌纖維化等心臟疾病的生物標志物。

發明人提出了一種用于預防和/或治療心臟疾病的組合物，該組合物含有如下任一種物質：

ⅰ、mir-142-3p；

ⅱ、含有mir-142-3p的編碼基因的重組載體；

ⅲ、含有mir-142-3p的編碼基因的重組病毒；

ⅳ、含有mir-142-3p的編碼基因的重組病毒載體；

其中，所述mir-142-3p的核苷酸序列如seqidno.1所示。

發明人將上述的組合物用于制備預防和/或治療心臟疾病的藥物；所述組合物還包括藥學上可接受的載體或輔料；所述心臟疾病包括心機肥厚、心機纖維化、冠心病或心衰。

在一個優選的實施例中，藥學上可接受的載體或輔料選自殼聚糖、膽固醇、脂質體和納米顆粒中的一種或幾種。

在另一個優選的實施例中，藥物的劑型可以為口服制劑、注射制劑、片劑和干粉劑中的一種或幾種。

上述的預防和/或治療心臟疾病是通過mir-142-3p過表達能抑制心肌細胞肥大的發生實現的。

或者還可以將下述任一種物質用于預防和/或治療心臟疾病的產品，

ⅰ、mir-142-3p；

ⅱ、含有mir-142-3p的編碼基因的重組載體；

ⅲ、含有mir-142-3p的編碼基因的重組病毒；

ⅳ、含有mir-142-3p的編碼基因的重組病毒載體；

其中，所述mir-142-3p的核苷酸序列如seqidno.1所示。

實施例1

在angⅱ(血管緊張素)刺激下mir-142-3p表達水平的變化

1.制備大鼠乳鼠原代心肌細胞

1)高壓滅菌實驗用的器材，包括剪刀、鑷子、刀片、玻璃平皿、260目過濾網、50ml錐形瓶、小轉子、槍頭、移液管，準備好實驗用所有試劑；準備好冰盒、37℃氣浴搖床；

2)用poly-l-lysin處理最終要培養心肌細胞的培養皿，37℃，1小時然后用無菌三蒸水洗2-3次，晾干；poly-l-lysin的作用是使培養皿利于心肌細胞貼壁；

3)在超凈臺中準備好一個冰盒，將4個盛有1×adsbuffer的培養皿放在冰盒上預冷；

4)將1-2天的sd大鼠乳鼠，不分雌雄，放進75％酒精中清洗消毒2次；

5)左手將小鼠抓住，暴露前胸，右手用剪刀在小鼠左胸剪一刀，左手輕輕一捏，將小鼠心臟擠出胸腔，拿無菌鑷子將心臟心尖大部分夾下來，在1×adsbuffer中清洗3次，鑷子輕輕擠壓心臟，將血擠盡；最后放在干凈預冷的5ml1×adsbuffer中。按照這個方法，取出所有小鼠的心臟；

6)用刀片將切碎所有心臟組織，大約切15min，最終心臟組織塊約1mm*3mm大小，注意心臟組織塊不宜太大或太小，否則會影響后面的消化效果；

7)用移液器將組織塊和ads緩沖液轉移至50ml錐形瓶，加入8ml消化液，37℃氣浴搖床中搖晃消化5min；取出錐形瓶，靜止1min，將上清全部棄掉，此時上清中大部分為殘留的血細胞和雜質；

8)加入10ml消化液，吸打混勻，37℃氣浴搖床,搖晃消化15min，取出錐形瓶，靜止1min，吸取上清轉移至盛有3ml馬血清的50ml離心管中，終止消化，終止消化的細胞放在冰上；

9)組織塊中繼續加入8ml消化液，吸打混勻，37℃氣浴搖床中搖晃消化10min；取出錐形瓶，靜止1min，吸出上清轉移至盛有馬血清的離心管中，終止消化；

10)重復以上步驟，每次的消化液體積和消化時間分別為：8ml/10min；8ml/10min；8ml/10min；8ml/10min；8ml/10min；5ml/5min至結束，結束標志為心臟組織幾乎完全消失；

11)將收集的細胞離心，800rpm，5min，棄上清；

12)加入含5％馬血清的dmem/f12，吸打混勻細胞進行清洗，800rpm離心5min；棄上清；

13)重復上述步驟一次；

14)加入10ml含5％馬血清的dmem/f12重懸細胞，然后用260目細胞篩過濾到10cm培養皿中，37℃培養箱中培養1小時；

15)根據心肌細胞貼壁慢，非心肌細胞貼壁快的原理，差速貼壁1小時后，將上清吸出轉移至50ml離心管中；

16)在上清細胞中，加入10-4m的brdu，混勻，分裝到poly-l-lysin處理過的培養皿中，細胞濃度約為1×105/ml，37℃培養箱中培養過夜，brdu的作用是抑制非心肌細胞生長，進一步去除非心肌細胞；

17)次日，在心肌細胞培養約20小時后，給細胞換液，用1×adsbuffer清洗一次，換液后便可以進行實驗了。

2.對心肌細胞用angⅱ進行處理

在培養的不同時間，提取細胞的總rna，實時熒光定量pcr技術檢測mir-142-3p的表達水平，如圖1所示，為大鼠乳鼠原代心肌細胞經angⅱ處理后mir-142-3p隨時間的表達水平，縱坐標以未處理的大鼠原代心肌細胞中mir-142-3p的表達水平為基準，表示在angⅱ處理過程中大鼠原代心肌細胞中mir-142-3p的表達水平。圖1說明mir-142-3p表達水平在angⅱ處理12小時后顯著降低。

實施例2

mir-142-3p能夠在細胞水平上抑制angⅱ所誘導的肥大

1.制備大鼠乳鼠原代心肌細胞，操作步驟與實施例1相同，

2.對原代心肌細胞轉染mir-142-3pmimics。

對原代心肌細胞轉染mir-142-3pmimics后，能有效的增加mir-142-3p的表達，同時細胞用angⅱ對心肌細胞進行處理，及同時用mir-142-3p的陰性對照(mir-nc)處理，經過48小時之后，對心肌細胞進行心肌肥大指標的檢測，如圖2所示，實驗結果證明mir-142-3p能夠有效的抑制angⅱ所誘導的心肌細胞肥大。

圖2a至2c表明mir-142-3p能夠在細胞水平上抑制angⅱ所誘導的肥大，其中圖2a表明原代心肌細胞轉染angⅱmimics能夠抑制心肌細胞的表面積，其中縱坐標表示在誘導心肌細胞肥大的過程中，每個樣品與對照(不存在任何物質的情況下心肌細胞面積)的百分比，圖2b表明原代心肌細胞轉染angⅱmimics后其蛋白/dna比率的變化，圖2c表明原代心肌細胞轉染angⅱmimics后肥大標志基因anf表達的變化情況。其中a-d分別表示如下：

a為在angⅱ、mir-nc和mir-142-3p不存在的情況下處理心肌細胞的結果；

b為在angⅱ存在、mir-nc和mir-142-3p不存在的情況下處理心肌細胞的結果；

c為angⅱ和mir-142-3p存在，mir-nc不存在的情況下處理心肌細胞的結果；

d為angⅱ和mir-nc存在，mir-142-3p不存在的情況下處理心肌細胞的結果；

實施例3

mir-142-3p能夠在細胞水平上抑制angⅱ所誘導的心肌細胞肌小節的重組

1.制備大鼠乳鼠原代心肌細胞，操作步驟與實施例1相同，

2.對原代心肌細胞轉染mir-142-3pmimics。

對原代心肌細胞轉染mir-142-3pmimics和陰性對照(mir-nc)后，用angⅱ對心肌細胞進行處理，經過處理48小時之后，對心肌細胞進行肌小節的重組檢測，如圖3所示，圖3表明原代心肌細胞轉染angⅱmimics其肌小節重排的情況，其中，對照為不存在任何物質的情況下心肌細胞小節排列的情況。實驗結果證明mir-142-3p能夠有效的抑制angⅱ所誘導的心肌細胞的肌小節的重組。

最后應說明的是：以上各實施例僅用以說明本發明的技術方案，而非對其限制；盡管參照前述各實施例對本發明進行了詳細的說明，本領域的普通技術人員應當理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分或者全部技術特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應技術方案的本質脫離本發明各實施例技術方案的范圍。

sequencelisting

<110>青島大學

<120>用于預防和/或治療心臟疾病的組合物及應用

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<213>人工序列

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