本發明涉及血紅素加氧酶-1抑制劑鋅原卟啉(zincprotoporphyrin，znpp)在與抗腫瘤藥物阿霉素聯合使用時，能顯著減輕阿霉素造成的心臟毒性。

背景技術：

阿霉素(doxorubicin，dox)屬于蒽環類抗腫瘤抗生素，具有抗瘤譜廣，抗瘤作用強，療效確切等特點，廣泛地用于治療血液系統惡性腫瘤和實體腫瘤，如急性白血病、淋巴瘤、乳腺癌、胃癌、軟組織肉瘤和卵巢癌等。與其他抗腫瘤藥物類似，阿霉素一方面對癌變的細胞具有強烈的損傷作用，另一方面對正常的細胞和組織也具有毒害，可以引起脫發、骨髓抑制和心臟毒性等毒副反應。其中，阿霉素最大的毒副作用是不可逆的心臟毒性。臨床表現輕者為心律失常，重者為心肌炎或心力衰竭。這不僅極大地影響了患者的生存質量，也使阿霉素的臨床應用受到了極大的限制。

阿霉素對心臟的毒性是通過累積和劑量依賴的方式引起心肌損害，但其導致心肌損傷的機制仍未完全明了。目前研究認為與活性氧的過量產生、脂質的過氧化反應、dna的損傷和腫瘤抑制蛋白的累積等有關。近年來越來越多的證據表明，使用阿霉素導致的心臟鐵過載在其心臟毒性的發生發展中起著極其重要的作用。目前唯一批準應用于臨床的抗阿霉素心臟毒性保護劑右丙亞胺(dexrazoxane,dxz)就是一種鐵螯合劑。

然而，心臟鐵蓄積的原因卻一直不清楚。

技術實現要素：

本發明要解決的技術問題是提供血紅素加氧酶-1抑制劑鋅原卟啉在制備治療阿霉素心臟毒性藥物中的應用，為新藥研發和創新療法提供基礎。

為了解決上述技術問題，本發明提供一種血紅素加氧酶-1抑制劑在制備治療鐵過載疾病的藥物中的應用，該血紅素加氧酶-1抑制劑為鋅原卟啉(zincprotoporphyrin，znpp)。

在發明過程中，發明人發現阿霉素注射后小鼠心臟血紅素加氧酶-1表達顯著升高，導致組織血紅素含量下降和非血紅素鐵含量升高。進一步通過鋅原卟啉(10毫克/公斤體重)注射小鼠模型證實，鋅原卟啉能明顯抑制阿霉素導致的心臟鐵過載，從而改善心臟功能。該研究結果為鋅原卟啉改善阿霉素心肌病提供了理論依據，特別是對相關藥物研發提供了基礎。

本發明經過研究首次發現，阿霉素可以在心臟中激活血紅素加氧酶-1(hemeoxygenase-1，ho-1)，降解廣泛存在于心臟肌紅蛋白中的血紅素，將其中的鐵離子釋放出來。即，本發明首次發現ho-1激活-釋放機制。之前的研究只知道阿霉素使用后鐵在心臟蓄積，并不清楚這些鐵的來源。本發明發現了ho-1降解血紅素這條通路，從而獲得ho-1抑制劑的治療價值。

綜上所述，本發明發現了血紅素加氧酶-1抑制劑鋅原卟啉可用于制備治療阿霉素心臟毒性的藥物，擴大了阿霉素的臨床應用。

本發明的實際用法和用量為：稀釋后進行注射，用量約為5～6g/成人.天。

附圖說明

下面結合附圖對本發明的具體實施方式作進一步詳細說明。

圖1為鋅原卟啉逆轉dox導致的小鼠心臟(a)和脾臟(b)體積變化。

圖2為鋅原卟啉逆轉dox導致的小鼠系統性鐵蓄積，分別檢測了血清(a)、心臟(b)、肝臟(c)和脾臟(d)的鐵含量。

圖3為鋅原卟啉逆轉dox導致的小鼠心力衰竭，分別以心臟心房鈉尿肽(anp)mrna，腦鈉尿肽(bnp)mrna和肌球蛋白重鏈7(myh7)mrna為指標。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于此。

1.材料和方法

1.1實驗動物

6周齡spf級c57bl/6雄性小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司，spf環境飼養。標準飼料ain-76a(鐵含量50mg/kg，researchdiets,inc)適應喂養2周后，按體重隨機分組，每組6～8只。

1.2藥物及處理

化合物鋅原卟啉(znpp)和阿霉素(dox)均購自sigma-aldrich公司。阿霉素溶于生理鹽水，鋅原卟啉溶于二甲基亞砜(dmso)中。阿霉素以10毫克/公斤體重一次性腹腔注射；鋅原卟啉以10毫克/公斤體重的劑量于注射阿霉素前一天腹腔注射。

阿霉素處理1天后，5％水合氯醛腹腔麻醉小鼠，稱重，心臟采血，分離血清，并收集心臟、肝臟和脾臟等組織稱重后液氮保存。小鼠心臟重量比上體重得到心臟體重比；脾臟重量比上體重得到脾臟體重比，這部分結果如圖1所述。根據圖1，可得知znpp的使用顯著地逆轉了阿霉素導致的心臟和脾臟形態變化。

1.3組織非血紅素鐵水平測定

將小鼠組織塊(包括心臟、肝臟、脾臟)稱重后加入1毫升組織消化液(3m鹽酸300ml/l，和0.61m(10％)99.735g/l三氯醋酸，溶解后超純水定容到1升)，65℃消化不少于50小時，中間用震蕩器震動三次，每次不少于10分鐘，確保組織消化完全，之后用組織消化液定容至1.5毫升。在96孔板中每孔加入200微升鐵顯色液工作液(鐵顯色液儲液：飽和醋酸鈉溶液：超純水＝1:5:5)，加入10毫升樣品，充分混勻，室溫顯色10分鐘。在535nm波長讀吸光度值(酶標儀)，將組織消化液設為空白，根據鐵標準液的吸光度計算組織非血紅素鐵含量。血清與三個主要器官的鐵含量如圖2所示。根據圖2，可得知：使用znpp抑制ho-1活性后，顯著抑制了阿霉素所致的系統性鐵過載，有力地證明了阿霉素心肌病中鐵過載的發生是源自于ho-1誘導的血紅素降解。

1.4rna提取和熒光定量實時pcr

trizol(lifetechnologies)法提取細胞和組織的rna，具體操作按說明書進行。nanodrop1000spectrophotometer上檢測rna純度(od260/od280≈1.9-2.1)及rna濃度(ng/μl)，調整rna濃度到1μg/μl。

2.0μgrna經dnase(promega)處理后，m-mlv反轉錄酶(promega)和oligo(dt)18primer(takarabioinc.)進行反轉錄。cfx96real-timesystem(bio-rad)中進行熒光定量實時(real-timepcr)檢測mrna水平各相關基因表達，檢測體積為10ul，試劑采用iqsybrgreensupermix(bio-rad)，引物序列如下：

mousegapdh:

forwardatcatccctgcatccact

reverseatccacgacggacacatt

mouseanp:

forwardtcgtcttggccttttggct

reversetccaggtggtctagcaggttct

mousebnp:

forwardaagtcctagccagtctccaga

reversegagctgtctctgggccatttc

mousemyh7:

forwardgctgaaagcagaaagagattatc

reversetggagttcttctcttctggag

熒光定量實時pcr體系為：

熒光定量實時pcr程序為：

step1：95℃3min

step2：95℃15s

step3：60℃30s

step4：72℃30s

step5：goto2for39cycles

溶解曲線對應的步驟如下：

step6：95℃10s

step7：65℃-95℃5s(increment:0.5℃)

step8：end。

檢測結果如圖2所示。根據圖2，可得知：znpp的使用極大地改善了阿霉素心肌病小鼠的心臟功能。

1.5統計方法

全部數據采用均數±標準誤(mean±sem)表示，使用graphpadprism(version6.0,graphpadsoftware；sandiego,ca,usa)統計學軟件進行統計學分析。p＜0.05代表差異有顯著性，具有統計學意義。

2.結果

6周齡的c57bl/6雄性小鼠標準膳食均衡2周后隨機分成3組，第一組為對照組，腹腔注射生理鹽水，二、三組均腹腔注射阿霉素(10毫克/公斤體重)。阿霉素注射前一天，第三組腹腔注射鋅原卟啉(10毫克/公斤體重)。阿霉素注射24小時后解剖小鼠，稱重，檢測心臟組織損傷標記物(心房鈉尿肽，腦鈉尿肽和肌球蛋白重鏈7mrna水平)以及血清和組織鐵含量。

結果顯示，阿霉素聯用鋅原卟啉能明顯挽救阿霉素導致的心臟等臟器體積變化，并抑制被阿霉素顯著上調的心臟組織損傷標記物，提示其對心臟毒性的保護作用。

最后，阿霉素與鋅原卟啉聯合處理組(第三組)同阿霉素單獨處理組(第二組)相比，血清及心臟等組織的鐵含量顯著回落，說明作為血紅素加氧酶-1抑制劑的鋅原卟啉可能通過影響機體的鐵代謝水平來抵抗阿霉素導致的心臟毒性。

基于上述實驗，鋅原卟啉抑制血紅素加氧酶-1介導的鐵過載是治療阿霉素心臟毒性的治療方法。

最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的若干個具體實施例。顯然，本發明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護范圍。

<110>浙江大學

<120>血紅素加氧酶-1抑制劑在制備抑制阿霉素心臟毒性藥物中的應用

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