本發(fā)明涉及酪酸梭菌在制備預(yù)防或治療慢性疲勞綜合征制劑中的應(yīng)用，具體是用酪酸梭菌預(yù)防或治療慢性疲勞綜合征。
背景技術(shù)：
：慢性疲勞綜合征(cfs)是機體軀體及精神上長期過度消耗不能緩解，以反復(fù)出現(xiàn)、不易消除的嚴重功能紊亂為特征的疾病。該病對患者的記憶力、注意力、工作、教育和個人活動帶來嚴重的影響。隨著現(xiàn)代生活節(jié)奏的加快，cfs的發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢。據(jù)美國疾病控制中心(cdc)預(yù)測：慢性疲勞已成為21世紀影響人類健康的主要疾病之一，我國該病的發(fā)病率也正逐年上升，涉及我國城市人口的10％—25％，且女性高于男性，高發(fā)年齡段為31-50歲，嚴重危害著國人的健康。由于cfs病因不明，目前尚無特效治療方法。目前，慢性疲勞綜合征的藥物治療以緩解臨床癥狀為主。由于患者對很多藥物都表現(xiàn)出高度敏感性，特別是影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥物，因此，一般治療策略是從小劑量開始，逐步加量，此外還需慎用可引起疲勞副反應(yīng)的藥物。藥物治療僅緩解癥狀，并不能有效的治療疾病，且所用藥物長期服用會產(chǎn)生多種毒副作用。本發(fā)明人經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，酪酸梭菌能夠有效預(yù)防或治療慢性疲勞綜合征，安全沒有任何毒副作用，效果優(yōu)于雙歧桿菌，且未見相關(guān)研究報道，特申請此發(fā)明專利。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種能預(yù)防或治療慢性疲勞綜合征的制劑，該制劑由酪酸梭菌制成。本發(fā)明的制劑的制備優(yōu)選是通過下述步驟實施的，但不局限于此制備工藝，公知的能實現(xiàn)的制備工藝均可以：采取可能含酪酸梭菌的樣品，然后將樣品置于滅菌厭氧瓶內(nèi)，吹入氮氣同時充分混合，迅速從中取2克樣品加入18ml滅菌的稀釋液中，吹入氮氣同時充分混勻，在無菌操作臺內(nèi)，進行10-1、10-2、10-3、10-4，10-5，10-6，10-7梯度稀釋，取10-5，10-6，10-7三個稀釋梯度，分別涂布于酪酸梭菌選擇性單菌落分離固體培養(yǎng)基上，置于厭氧罐內(nèi)，厭氧37℃下培養(yǎng)48小時，選擇長勢良好的單菌落分別接種于液體擴增培養(yǎng)基中，置于厭氧罐內(nèi)，厭氧37℃下擴增培養(yǎng)48小時。將所得培養(yǎng)液離心(12000rpm)分離出菌體后，將菌體冷凍真空干燥，調(diào)制出干燥菌粉，然后進行菌種鑒定和毒性試驗，將鑒定為酪酸梭菌的干燥菌粉按需要比例添加輔料制成片劑、膠囊、散劑、粉劑或液體制劑等各種劑型，也可加入其他活菌或低聚果糖等低聚糖起到協(xié)同作用。酪酸梭菌選擇性單菌落分離固體培養(yǎng)基優(yōu)選但不局限于：純化水1l，蛋白胨40.0g，na2hpo45.0g，k2hpo41.0g，nacl2.0g，mgso40.1g，葡萄糖2.0g，瓊脂25.0g，調(diào)ph7.6，116℃滅菌20分鐘，待其冷至50℃左右，加入卵黃液50.0ml，加入終濃度為200μg/ml的硫酸多粘菌素b，加入終濃度200μg/ml的新霉素，充分混勻后，分注于平皿中。酪酸梭菌液體擴增培養(yǎng)基優(yōu)選但不局限于：純化水1l，胰蛋白胨10.0g，牛肉浸膏10.0g，酵母浸膏3.0g，葡萄糖5.0g，nacl5.0g，可溶性淀粉1.0g，半胱氨酸鹽酸鹽0.5g，醋酸鈉3.0g，瓊脂0.5g，調(diào)ph6.6-7.0，121℃，滅菌15分鐘。為進一步具體說明本發(fā)明，發(fā)明人利用上述方法通過酪酸梭菌選擇性單菌落分離固體培養(yǎng)基分離鑒定出了無毒性的酪酸梭菌，本發(fā)明所述酪酸梭菌并不局限于為說明本發(fā)明所述的菌，只要無毒性的酪酸梭菌均是本發(fā)明所述，均在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。本發(fā)明所述酪酸梭菌優(yōu)選但不限于酪酸梭菌df96101保藏編號cgmccno.0313.1或丁酸梭菌qa-08保藏編號cgmccno.2303。本發(fā)明實施說明中優(yōu)選使用的酪酸梭菌的細菌學(xué)性質(zhì)：1、為說明本發(fā)明，本發(fā)明利用上述方法分離的酪酸梭菌為酪酸梭菌df96101保藏編號cgmccno.0313.1或丁酸梭菌qa-08保藏編號cgmccno.2303。2、菌落形態(tài)顯微鏡觀察：長3.0-6.0微米，寬0.6-1.2微米，直桿或梭狀菌，革蘭氏染色陽性，產(chǎn)芽孢，孢子欠端生。平板形態(tài)：菌落圓形，邊緣不整齊，稍凸，不透明，顏色淡黃，表面無光澤。3、生理生化鑒定硫化氫:-；吲哚:-；明膠液化:-；氨:-；硝酸鹽還原:-；卵磷脂酶反應(yīng):-；脲酶:-；v-p試驗:-；接觸酶:-；是否需氧:厭氧性。4、糖酵解實驗鑒定阿拉伯糖:+；鼠李糖:+；纖維二糖:+；d-山梨醇:-；d-果糖:+；可溶性淀粉:+；d-半乳糖:+；蔗糖:+；葡萄糖:+；海藻糖:+；菊糖:+；木糖:+；乳糖:+；葡萄糖酸鹽(鈉):+；d(+)甘露糖:+；麥芽糖:+；d-甘露醇:+；甘油:+；d(+)棉籽糖:+；核糖:+；松三糖:+；蜜二糖:+。本發(fā)明所述的酪酸梭菌指活的生物個體。本發(fā)明是以有效劑量按上述方法分離的酪酸梭菌作為主要活性成份，按照一定的制劑工藝，加入常規(guī)的賦形劑、調(diào)味劑、崩解劑、防腐劑、潤滑劑、濕潤劑、黏合劑、溶劑、增稠劑、增溶劑等輔料，制成任何一種適合于使用的劑型，如片劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、液體制劑、粉劑等劑型。本發(fā)明所述酪酸梭菌作為主要藥物活性成份制成活菌制劑。本發(fā)明所指有效劑量是指按上述方法分離的酪酸梭菌根據(jù)上面所述單獨或組合作為主要藥物活性成份制成的固體活菌制劑包含的總活菌數(shù)不能低于1×106cfu/g，一般在1×107cfu/g以上，最高可達到1×1012cfu/g或1×1012cfu/g以上。本發(fā)明所指有效劑量是指按上述方法分離的酪酸梭菌根據(jù)上面所述單獨或組合作為主要藥物活性成份制成的液體活菌制劑包含的總活菌數(shù)不能低于1×106cfu/ml，一般在1×107cfu/ml以上，最高可達到1×1012cfu/ml或1×1012cfu/ml以上。本發(fā)明所述制劑包括酪酸梭菌單獨應(yīng)用或與其他藥物聯(lián)合應(yīng)用，尤其包括酪酸梭菌單獨應(yīng)用或與雙歧桿菌聯(lián)合應(yīng)用。本發(fā)明所述雙歧桿菌指活的生物個體。本發(fā)明所述雙歧桿菌聯(lián)合應(yīng)用的制劑中，固體制劑包含的雙歧桿菌總活菌數(shù)不低于1×106cfu/g，一般在1×107cfu/g以上，最高可達到1×1012cfu/g或1×1012cfu/g以上；或液體制劑包含的雙歧桿菌總活菌數(shù)不低于1×106cfu/ml，一般在1×107cfu/ml以上，最高可達到1×1012cfu/ml或1×1012cfu/ml以上。由于本發(fā)明首次公開了酪酸梭菌作為主要活性成份制成制劑在預(yù)防或治療慢性疲勞綜合征中的應(yīng)用，因此含上述酪酸梭菌的制劑在預(yù)防或治療慢性疲勞綜合征制劑中的應(yīng)用均屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明所述的酪酸梭菌在制成任何一種劑型時，均具有預(yù)防或治療慢性疲勞綜合征的作用。如果其組份中含有酪酸梭菌成份制備成制劑，在其包裝或說明書等標識上或者在其他任何宣傳品上只要注明或提示具有預(yù)防或治療慢性疲勞綜合征的作用，則落入本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。本發(fā)明所述的酪酸梭菌可以制成藥品、保健食品、食品或飲品等。具體實施方式制備例說明：上述已經(jīng)對酪酸梭菌制劑的制備進行說明，這里通過酪酸梭菌df96101保藏編號cgmccno.0313.1或丁酸梭菌qa-08保藏編號cgmccno.2303為例進行具體說明，其他酪酸梭菌菌種制劑的制備方法本領(lǐng)域技術(shù)人員通過本實施例很容易掌握，其他劑型的制備方法本領(lǐng)域技術(shù)人員通過本實施很容易掌握，在此不再一一敘述說明。制備方法并不局限于本發(fā)明實施例所述，公知的能夠達到制備目的的方法均可以，實施例的制備說明只是對本發(fā)明的說明，并不是對本發(fā)明保護范圍的限制。制備實施例1酪酸梭菌粉劑的制備1菌粉的制備和菌種的鑒定采取人的糞便樣品，然后將樣品置于滅菌厭氧瓶內(nèi)，吹入氮氣同時充分混合，迅速從中取2克樣品加入18ml滅菌的稀釋液中，吹入氮氣同時充分混勻，在無菌操作臺內(nèi)，進行10-1、10-2、10-3、10-4，10-5，10-6，10-7梯度稀釋，取10-5，10-6，10-7三個稀釋梯度，分別涂布于酪酸梭菌選擇性單菌落分離固體培養(yǎng)基上，置于厭氧罐內(nèi)，厭氧37℃下培養(yǎng)48小時，選擇長勢良好的單菌落分別接種于液體擴增培養(yǎng)基中，置于厭氧罐內(nèi)，厭氧37℃下擴增培養(yǎng)48小時。將所得培養(yǎng)液離心(12000rpm)分離出菌體后，將菌體冷凍真空干燥，調(diào)制出干燥菌粉，然后進行菌種鑒定，經(jīng)生理生化鑒定為酪酸梭菌，為酪酸梭菌df96101保藏編號cgmccno.0313.1或丁酸梭菌qa-08保藏編號cgmccno.2303。酪酸梭菌df96101保藏編號cgmccno.0313.1或丁酸梭菌qa-08保藏編號cgmccno.2303菌粉制備，將酪酸梭菌df96101保藏編號cgmccno.0313.1或丁酸梭菌qa-08保藏編號cgmccno.2303接種到酪酸梭菌液體擴增培養(yǎng)基中，厭氧37℃下擴增培養(yǎng)48小時。將所得培養(yǎng)液離心(12000rpm)分離出菌體后，將菌體冷凍真空干燥，調(diào)制出干燥菌粉，活菌數(shù)均為1×109cfu/g以上。2毒性試驗2.1動物及分組取30只spf級別小鼠，6-8周齡，體重14-18g，隨機分入酪酸梭菌cgmccno.0313.1組、丁酸梭菌cgmccno.2303組和未給藥組，每組10只。2.2制備菌液將上述不同的酪酸梭菌菌粉分別用純化水調(diào)制為含菌數(shù)均為1×109cfu/ml的菌液。2.3方法各酪酸梭菌組和未給藥組均給予相同的基礎(chǔ)飼料，且飼養(yǎng)條件均一致，各酪酸梭菌組每天灌服酪酸梭菌菌液0.5ml，未給藥組每天灌服純化水0.5ml，飼喂14天，觀察體重及毒性反應(yīng)。2.4結(jié)果各組小鼠均未出現(xiàn)異常情況，未發(fā)生振顫、痙攣、運動失調(diào)、姿態(tài)異常，無眼球突出，排尿正常，皮膚、呼吸正常，無死亡情況，未見中毒反應(yīng)。3制備成粉劑等劑型根據(jù)上述步驟和方法分離鑒定后，經(jīng)實驗檢驗無毒性，就可將酪酸梭菌菌種制成菌粉，然后按照需要添加相關(guān)輔料制成各種劑型，優(yōu)選據(jù)酪酸梭菌菌粉的活菌數(shù)，按比例添加淀粉制成粉劑，使活菌數(shù)不低于1×107cfu/g，然后裝袋。應(yīng)用效果實施例說明：本發(fā)明以酪酸梭菌df96101保藏編號cgmccno.0313.1或丁酸梭菌qa-08保藏編號cgmccno.2303為代表說明酪酸梭菌的應(yīng)用效果，菌粉由青島東海藥業(yè)有限公司提供。本發(fā)明中使用的雙歧桿菌來自于市場銷售產(chǎn)品，公眾能夠購買到的雙歧桿菌活菌均可。應(yīng)用效果實施例1：酪酸梭菌在治療慢性疲勞綜合征中的應(yīng)用1模型組制備：1.1實驗動物健康雄性wistar大鼠，體重(180±20)g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司。實驗前適應(yīng)飼養(yǎng)一周：按晝夜節(jié)律采光12h，控制溫度、濕度，自由攝取食物和水，每日定時更換飼料，通風良好，排除其它應(yīng)激因素干擾。1.2制備方式采用強制冷水游泳法(1d)+慢性束縛法(2d)的方式建立大鼠慢性疲勞綜合征模型，共計造模21d。游泳水溫為(10±1)℃，每次游泳持續(xù)時間為6～8min，慢性束縛持續(xù)時間為3h，每次造模時間隨機。1.3模型組制備結(jié)果造模成功。2藥物治療實驗：2.1實驗方法選取體重(180±20)g的健康雄性wistar大鼠50只，隨機分為正常對照組(n＝10)、酪酸梭菌(df96101)治療組(n＝10)、酪酸梭菌(qa-08)治療組(n＝10)、雙歧桿菌治療組(n＝10)、模型對照組(n＝10)。所有對象均給予相同的基礎(chǔ)飼料，且飼養(yǎng)條件均一致。正常對照組不做任何處理，各治療組和模型對照組按1.2所述方式建立大鼠慢性疲勞綜合征模型，并于模型建立的第1天起，酪酸梭菌(df96101、qa-08)和雙歧桿菌治療組使用含菌數(shù)為1×106cfu/ml(用0.9％生理鹽水調(diào)制菌粉)的菌液灌服0.5ml，模型對照組和正常對照組灌服0.9％生理鹽水0.5ml，直至第21天結(jié)束。觀察酪酸梭菌對慢性疲勞綜合征大鼠行為學(xué)的影響，并與雙歧桿菌進行比較。2.2行為學(xué)評估對實驗鼠進行行為學(xué)評估，包括體力和精神疲勞檢測(鼠尾懸掛實驗)和學(xué)習(xí)記憶測試(moirrs水迷宮測試)。數(shù)據(jù)使用spss21.0進行統(tǒng)計學(xué)分析。3結(jié)果3.1體力和精神疲勞評估與對照組相比較，慢性疲勞綜合征模型大鼠鼠尾懸掛不動時間增加(p＜0.01)，差別有統(tǒng)計學(xué)意義。與慢性疲勞綜合征模型大鼠相比，酪酸梭菌df96101和qa-08治療后，大鼠鼠尾懸掛不動時間降低(p＜0.01)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。與雙歧桿菌治療組大鼠相比，酪酸梭菌df96101和qa-08治療組鼠尾懸掛不動時間降低(p＜0.05)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。酪酸梭菌df96101治療組和qa-08治療組之間，大鼠鼠尾懸掛不動時間無統(tǒng)計學(xué)差異(p＞0.05)。酪酸梭菌對慢性疲勞綜合征大鼠的體力和精神疲勞有顯著改善作用，并顯著高于雙歧桿菌治療組。見表1。表1不同組別大鼠鼠尾懸掛行為變化統(tǒng)計分析組別例數(shù)鼠尾懸掛不動時間(s)正常對照組10140.66±10.52模型對照組10189.25±13.60雙歧桿菌治療組10170.14±13.28酪酸梭菌(df96101)治療組10155.20±10.80酪酸梭菌(qa-08)治療組10152.02±11.233.2學(xué)習(xí)記憶能力評估與對照組相比較，慢性疲勞綜合征模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力差(p＜0.01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；與慢性疲勞綜合征模型大鼠相比，酪酸梭菌df96101和qa-08治療后，大鼠學(xué)習(xí)記憶能力提高(p＜0.01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；與雙歧桿菌治療組大鼠相比，酪酸梭菌df96101和qa-08治療組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力提高(p＜0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；酪酸梭菌df96101治療組和qa-08治療組之間，大鼠學(xué)習(xí)記憶能力無統(tǒng)計學(xué)差異(p＞0.05)。酪酸梭菌能顯著提高慢性疲勞綜合征大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，其效果顯著高于雙歧桿菌。見表2。表2不同組別大鼠學(xué)習(xí)記憶能力統(tǒng)計分析組別例數(shù)學(xué)習(xí)記憶能力(s)正常對照組1021.68±10.21模型對照組1051.52±13.58雙歧桿菌治療組1040.38±10.09酪酸梭菌(df96101)治療組1030.55±11.80酪酸梭菌(qa-08)治療組1028.61±11.234討論慢性疲勞綜合征模型組和正常對照組相比大鼠體力和精神疲勞顯著增加，學(xué)習(xí)記憶能力顯著變差，而經(jīng)酪酸梭菌治療后，體力和精神疲勞降低(p＜0.01)，學(xué)習(xí)記憶能力提高(p＜0.01)，且療效顯著好于雙歧桿菌治療組。表明酪酸梭菌干預(yù)能顯著減少慢性疲勞綜合征大鼠的慢性疲勞綜合征癥狀。酪酸梭菌制劑能夠有效預(yù)防或治療慢性疲勞綜合征，明顯減少慢性疲勞綜合征癥狀，且無任何毒副作用，應(yīng)用依從性好，是預(yù)防或治療慢性疲勞綜合征的新方法、新突破。本發(fā)明在實施過程中所使用的酪酸梭菌菌種已分別于1997年7月28日和2007年12月26日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼100101)保藏，共兩個下述菌種，但本發(fā)明所述的酪酸梭菌并不局限于這兩種微生物菌種。(1)分類命名：酪酸梭菌clostridiumbutyricum，保藏編號cgmccno.0313.1。(2)分類命名：丁酸梭菌clostridiumbutyricum，保藏編號cgmccno.2303。上述兩個菌種經(jīng)該微生物中心檢測，檢測結(jié)果均為存活。當前第1頁12