本發明屬于醫藥應用技術領域，具體涉及二肽基肽酶iv(dipeptidylpeptidase-4，dpp4)抑制劑在防治癲癇中的應用。

背景技術：

癲癇即俗稱的“羊角風”或“羊癲風”，是大腦神經元突發性異常放電導致大腦功能障礙的一種常見的神經系統疾病。中國約有900萬左右的癲癇患者，每年新增加癲癇患者約40萬，癲癇已經成為神經科僅次于頭痛的第二大常見病。

癲癇的發病機制非常復雜，迄今尚未完全闡明。癲癇反復發作對患者及其家庭乃至社會均造成很大危害，治療方式從傳統藥物治療逐漸拓展到手術治療、基因療法、細胞移植、神經刺激等多種治療方式，但仍未找到特別理想的治療方案。目前癲癇最常用、最重要的治療手段仍是藥物治療，抗癲癇藥物合理、規范、適時和正確的使用，近60％癲癇發作的患者可得到完全控制且停藥后無發作。雖然大部分癲癇患者接受抗癲癇藥物的治療后可有效緩解癲癇發作，但是仍有約25％的患者發展為藥物難治性癲癇。多次連用抗癲癇藥物應警惕蓄積中毒，長期用于治療癲癇時不可突然停藥，以免引起癲癇發作，甚至出現癲癇持續狀態。因此新型的抗癲癇藥物的開發和研究是必要的。

二肽基肽酶iv(dipeptidylpeptidase4，dpp4)抑制劑是近年來治療2型糖尿病的新型藥物，于2007年獲得歐盟批準用于治療2型糖尿病，已是世界多個國家口服治療糖尿病的藥物。目前研究深入并已應用于臨床的dpp4抑制劑有磷酸西他列汀(sitagliptin)、維格列汀(vildagliptin)、沙格列汀(saxagliptin)、阿格列汀(alogliptin)和利格列汀(linagliptin)。

dpp4的抑制劑降糖以外的靶器官保護作用，是目前臨床關注的重點之一。目前沒有dpp4的抑制劑應用于防治癲癇的相關報道。

技術實現要素：

為了克服現有技術中存在的不足，本發明提供了dpp4的抑制劑在制備防治癲癇的藥物中的新應用，該dpp4的抑制劑毒副作用極小，藥效持續時間長。

為了實現以上目的，本發明采取了以下技術方案：

第一方面，本發明提供二肽基肽酶iv的抑制劑在制備防治癲癇的藥物中的應用。

進一步地，所述的二肽基肽酶iv的抑制劑是磷酸西他列汀、維格列汀、沙格列汀、阿格列汀和利格列汀中的任意一種。

進一步地，所述的二肽基肽酶iv的抑制劑是磷酸西他列汀或維格列汀。

本發明采用以下具體實施例來支持以上技術方案：

1、行為學檢測癲癇發作的潛伏期、持續時間及發作等級。sd(spraguedawley，sd)大鼠經戊四氮(pentetrazole，ptz，35mg/kg，i.p.)誘導癲癇后，通過racine評分標準觀察大鼠行為學變化，研究給予dpp4抑制劑后對大鼠癲癇發作潛伏期、持續時間及發作等級的影響。

2、腦電圖檢測癲癇發作后神經元放電情況。sd大鼠經ptz誘導癲癇后，腦電圖觀測給予dpp4抑制劑后對癲癇大鼠神經元放電的影響。

3、尼氏染色檢測癲癇發作后皮層及海馬區域神經元生存率。sd大鼠經ptz誘導癲癇后，尼氏染色研究給予dpp4抑制劑后對大鼠皮層和海馬齒狀回神經元生存率的影響。

4、tunel染色檢測癲癇發作后皮層及海馬區域神經元凋亡情況。sd大鼠經ptz誘導癲癇后，tunel染色研究給予dpp4抑制劑后對大鼠皮層和海馬齒狀回神經元凋亡的影響。

5、he染色檢測癲癇發作后皮層及海馬區域神經元變性壞死情況。sd大鼠經ptz誘導癲癇后，he染色研究給予dpp4抑制劑后對大鼠皮層和海馬齒狀回神經元變性壞死的影響。

6、膜片鉗技術檢測原代培養海馬神經元的興奮性。原代海馬神經元培養成熟后無鎂外液誘導癲癇細胞模型，單細胞膜片鉗技術研究給予dpp4抑制劑后對神經元興奮性的影響。

本發明具有以下優點和效果：

目前臨床治療癲癇的方法效果雖明顯，但是可產生多種嚴重副作用，久用可產生耐受性及成癮性。本發明涉及的藥物，是經過批準已經在臨床上使用的藥品，毒副作用極小，藥效持續時間長，可以節省藥物研發的成本。

附圖說明

圖1磷酸西他列汀延長癲癇發作潛伏期，降低癲癇發作持續時間和發作等級。

a圖為癲癇發作潛伏期統計結果，***p<0.001，b圖為癲癇發作持續時間統計結果，***p<0.001，c圖為癲癇發作等級統計結果，***p<0.001。

圖2磷酸西他列汀降低癲癇大鼠腦內神經元異常放電幅度和頻率。

a、b、c圖分別為對照組、癲癇組以及磷酸西他列汀治療組神經元放電結果。

圖3磷酸西他列汀增加癲癇大鼠皮層和海馬齒狀回神經元生存率。

a、d圖為對照組尼氏染色，b、e圖為癲癇組尼氏染色，c、f圖為磷酸西他列汀治療組尼氏染色，scalebar:50μm。

圖4磷酸西他列汀降低癲癇大鼠皮層和海馬齒狀回神經元凋亡。

a、d圖為對照組tunel染色，b、e圖為癲癇組tunel染色，c、f圖為磷酸西他列汀治療組tunel染色，scalebar:50μm。

圖5磷酸西他列汀降低癲癇大鼠皮層和海馬齒狀回神經元變性壞死。

a、d圖為對照組he染色，b、e圖為癲癇組he染色，c、f圖為磷酸西他列汀治療組he染色，scalebar:50μm。

圖6維格列汀降低無鎂溶液處理后原代培養海馬神經元放電頻率。

a圖分別為對照組、癲癇組以及維格列汀治療組神經元放電記錄結果，b圖為放電頻率統計圖，*p<0.05。

具體實施方式

通過以下詳細說明結合附圖可以進一步理解本發明的特點和優點。所提供的實施例僅是對本發明方法的說明，而不以任何方式限制本發明揭示的其余內容。

【實施例1】研究dpp4抑制劑對癲癇大鼠行為學影響

選取30只(220±20g)雄性sd大鼠隨機分為3組即對照組、癲癇組以及磷酸西他列汀治療組。對照組：按35mg/kg腹腔注射生理鹽水；癲癇組：按35mg/kg腹腔注射ptz構建癲癇模型；治療組：提前20分鐘按10mg/kg腹腔注射磷酸西他列汀，20分鐘后按35mg/kg腹腔注射ptz構建癲癇模型。根據racine分級標準(1972年)癲癇發作等級分級為0～v級，其主要表現為：0級正常(無抽搐發作)；i級呆立不動、面肌痙攣、眨眼、動須等面部自動癥或抖動；ii級節律性點頭、咀嚼；iii級單側前肢痙攣；iv級全身性強直陣攣抽搐，伴站立、跌倒和后退；v級反復出現全身性強直陣攣發作，或呈癲癇持續狀態或抽搐致死。實驗連續觀察7天，記錄每天每組大鼠癲癇發作的潛伏期、持續時間以及發作等級。

實驗結果顯示，與癲癇模型組大鼠相比，磷酸西他列汀治療組癲癇發作的潛伏期明顯延長，癲癇發作持續時間以及發作等級明顯降低，說明磷酸西他列汀可以降低癲癇的嚴重性(圖1)。

【實施例2】研究dpp4抑制劑對癲癇大鼠神經元放電的影響

室溫安靜環境下，sd大鼠腹腔注射10％水合氯醛(0.3ml/100g)處于全麻狀態后，使用直徑為0.5mm的小手鉆，分別在大鼠前囟門后4mm，中線兩側旁4mm處的顱骨鉆出兩個記錄電極孔，在大鼠的鼻竇上方鉆出一個參考電極孔。將兩個絕緣的不銹鋼電極分別置于參考電極孔和右側的記錄電極孔內，然后用牙科水泥將所有的電極固定在大鼠顱骨上(以上操作過程中注意無菌操作)。將電極引線連接到數字化腦電圖機上，調整好腦電圖參數后記錄各組大鼠神經元放電情況。

實驗結果顯示，與癲癇模型組大鼠相比，磷酸西他列汀治療組大鼠神經元異常放電的幅度和頻率降低，說明磷酸西他列汀可以在一定程度上抑制癲癇異常放電(圖2)。

【實施例3】研究dpp4抑制劑對癲癇大鼠神經元存活率的影響

主要步驟如下：

(1)組織切片：sd大鼠癲癇行為學觀測結束24h后，腹腔注射10％水合氯醛(0.3ml/100g)使大鼠處于全麻狀態，用4％多聚甲醛左心室灌注固定。在灌注過程中，可以觀察到大鼠全身肌肉顫動，逐漸僵硬、強直，此時斷頭取腦，隨后將組織石蠟包埋切片備用。

(2)尼氏染色：依次將切片放入二甲苯i15min-二甲苯ii15min無水乙醇i5min-無水乙醇ii5min-85％酒精5min-75％酒精5min-蒸餾水洗。將石蠟切片放入緩沖亞甲藍染色液內染10min。在0.2mol/l醋酸鹽緩沖液(ph＝4.6)中分化1～3秒，并在顯微鏡下觀察，尼氏體清晰時進行下一步試驗。用4％的鉬酸銨水溶液處理切片3～5min。蒸餾水洗脫后常規脫水透明、中性樹膠封片。光學顯微鏡觀察皮層和海馬齒狀回區尼氏體的變化。

實驗結果顯示：與癲癇模型組大鼠相比，磷酸西他列汀治療組大鼠皮層和海馬齒狀回區神經元尼氏體明顯減少，尼氏體層次致密整齊，說明磷酸西他列汀可以緩解癲癇大鼠神經元損傷(圖3)。

【實施例4】研究dpp4抑制劑對癲癇大鼠神經元凋亡的影響

主要步驟如下：

(1)組織切片方法同前。

(2)tunel染色：按片子數量和組織大小取tunel試劑盒內適量試劑1(tdt)和試劑2(dutp)按2:29混合覆蓋組織，37℃恒溫孵育2小時。切片放入用甲醇配制的3％過氧化氫溶液室溫避光孵育15min，搖床上晃動洗滌脫色。切片稍甩干后，每張切片加適量試劑3覆蓋組織，切片平放于濕盒內，37℃溫箱孵育30min。切片稍甩干后在圈內滴加新鮮配制的dab顯色液，顯微鏡下控制顯色時間，陽性為細胞核呈棕黑色，沖洗切片終止顯色。harris蘇木素復染3min左右，1％的鹽酸酒精分化數秒，氨水返藍，流水沖洗，最后脫水封片。

實驗結果顯示，與癲癇模型組大鼠相比，磷酸西他列汀治療組大鼠皮層和海馬齒狀回區神經元凋亡細胞數量明顯減少，說明磷酸西他列汀可以改善癲癇大鼠神經元凋亡(圖4)。

【實施例5】研究dpp4抑制劑對癲癇大鼠神經元變性壞死的影響

主要步驟如下：

(1)組織切片方法同前。

(2)he染色：切片入蘇木素染3～5min，1％的鹽酸水溶液分化數秒；0.6％～0.7％氨水返藍，流水沖洗；切片梯度酒精脫水，入伊紅染液中染色5min。切片依次放入無水乙醇i5min-無水乙醇ii5min-無水乙醇iii5min-正丁醇5min-二甲苯i5min-二甲苯ii5min透明，將切片從二甲苯拿出來稍晾干，中性樹膠封片。顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

實驗結果顯示，與癲癇模型組大鼠相比，磷酸西他列汀治療組大鼠皮層和海馬齒狀回區神經元變性細胞指數有明顯的下降，說明磷酸西他列汀可以減少癲癇大鼠神經元變性壞死(圖5)。

【實施例6】研究dpp4抑制劑對無鎂外液處理原代培養神經元興奮性的影響

(1)原代海馬神經元培養和癲癇細胞模型建立：提前將手術器械、圓形玻片和50ml去離子水高壓蒸汽滅菌，滅完后將去離子水放到4度冰箱預冷。取sd大鼠新生鼠嬰(1日齡)將剝離的海馬放入離心管中，然后加入0.25％胰酶，放入37度培養箱中消化8～10min。消化結束30s時取出5％培養基，加入1ml5％培養基終止消化。用1ml槍輕微吹打均勻8～10次，用200目細胞濾網過濾細胞，待組織塊沉淀下來，吸出30μl到每個孔的玻璃片上放入37度培養箱。培養第7天采用神經元標志物map2鑒定神經元純度。培養的海馬神經元隨機分成3組：對照組：去除維持培養液，正常細胞外液處理3小時恢復繼續維持培養液培養；癲癇細胞模型組：去除維持培養液，無鎂細胞外液處理3小時，恢復維持培養液繼續培養；維格列汀治療組：去除維持培養液，無鎂細胞外液(含維格列汀100μm)處理3小時，恢復維持培養液繼續培養。

(2)原代海馬神經元興奮性記錄：將目的細胞置于視野中央，灌有電極內液的玻璃微電極裝入電極夾持器。通過三維微細操縱器調節電極尖端至視野中央。形成全細胞記錄模式后用自帶軟件進行快慢電容和串聯電阻補償，數據采樣頻率為10khz，低頻濾波頻率為5khz。在電流鉗記錄模式(c-cmodel)，記錄膜電位和神經元放電情況。

實驗結果顯示，與模型組神經元相比，維格列汀治療組神經元動作電位放電頻率顯著降低，說明維格列汀可以抑制神經元異常放電(圖6)。