本發(fā)明涉及一種醫(yī)用材料，具體涉及一種基于豬小腸粘膜下層的復(fù)合型生物補(bǔ)片及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

皮膚是人體最大的器官，具有重要的物理、化學(xué)及生物學(xué)屏障功能，全層皮膚缺損創(chuàng)面的修復(fù)是外科領(lǐng)域的一個(gè)基本問題，全層皮膚缺損不僅需要?jiǎng)?chuàng)面及時(shí)和永久的覆蓋而且要能最大限度地恢復(fù)功能和外觀，盡早修復(fù)缺損皮膚并最大可能恢復(fù)功能和外觀已成為治療重要目標(biāo)；皮膚組織的修復(fù)和功能恢復(fù)中，血管化成為瓶頸問題。豬小腸主要由4層組成，由里到外分別為粘膜層，粘膜下層、肌層和漿膜層。豬小腸粘膜下層由一層致密的結(jié)締組織構(gòu)成，主要成分為i、iii型膠原纖維，含有少量細(xì)胞及部分較大的血管、淋巴管和神經(jīng)。

近期研究顯示，sis材料對于消化道缺損的修復(fù)具有較好效果。delafuente等的實(shí)驗(yàn)中，12只大鼠40%的胃壁被全層切除，雙層sis材料被用于修復(fù)胃壁缺損，術(shù)后3周胃壁病理檢查結(jié)果顯示：所有大鼠的胃壁缺損均已被肉芽和纖維組織所修復(fù)，所有大鼠均存活，體重增加，且無腹膜炎表現(xiàn)。而且，badylak等的實(shí)驗(yàn)提示多層sis材料具有較高的結(jié)構(gòu)強(qiáng)度，完全可滿足食管缺損修復(fù)的力學(xué)強(qiáng)度要求。但是，單純的sis材料修復(fù)消化道后，易出現(xiàn)吻合部位的狹窄。究其原因?yàn)樵摬牧鲜且环N無細(xì)胞、富含膠原，并含有黏附生長因子的一種生物材料。單純的sis材料植入體內(nèi)后，非常容易接收宿主細(xì)胞，而植入手術(shù)引起的創(chuàng)傷反應(yīng)，往往導(dǎo)致成纖維細(xì)胞過度增值，最終以瘢痕修復(fù)形成狹窄。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種基于豬小腸粘膜下層的復(fù)合型生物補(bǔ)片及其制備方法，得到的新型生物補(bǔ)片是很好的生物支架材料，其結(jié)構(gòu)成分和空間三維結(jié)構(gòu)十分相似，在臨床的實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出了很好的生物相容性，促傷口愈合性，更重要的是對各種組織再生又重塑性，尤其是對皮膚的創(chuàng)傷愈合有修復(fù)效果，對皮膚的再生有重要意義。

本發(fā)明公開了一種基于豬小腸粘膜下層的復(fù)合型生物補(bǔ)片的制備方法，包括以下步驟，將脫細(xì)胞豬小腸粘膜下層與添加劑復(fù)合，得到基于豬小腸粘膜下層的復(fù)合型生物補(bǔ)片；所述添加劑包括生長因子、藥物中的一種或兩種。

上述技術(shù)方案中，所述生長因子包括血管內(nèi)皮生長因子、神經(jīng)生長因子、表皮生長因子，所述藥物包括抗生素、肝素；可以將分泌生長因子的細(xì)胞接種于脫細(xì)胞豬小腸粘膜下層表面，然后進(jìn)行體外培養(yǎng)，得到脫細(xì)胞豬小腸粘膜下層與細(xì)胞復(fù)合材料；然后將脫細(xì)胞豬小腸粘膜下層與細(xì)胞復(fù)合材料進(jìn)行反復(fù)凍融，最后去除細(xì)胞得到復(fù)合生長因子的脫細(xì)胞豬小腸粘膜下層，優(yōu)選將分泌生長因子的細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)；取生長狀況良好的第3代分泌生長因子的細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后離心制成細(xì)胞懸液，取細(xì)胞懸液接種于脫細(xì)胞豬小腸粘膜下層表面；所述體外培養(yǎng)的時(shí)間為3d；也可以將脫細(xì)胞豬小腸粘膜下層浸泡在含有添加劑的溶液中1～5h，得到復(fù)合添加劑的脫細(xì)胞豬小腸粘膜下層。

上述技術(shù)方案中，以豬小腸粘膜下層為原料，采用高低滲透壓法和去污劑法結(jié)合制備脫細(xì)胞豬小腸粘膜下層；比如取豬小腸，清洗后通過機(jī)械刮除法去掉漿膜層和肌層，然后將剩下的小腸粘膜下層在含有0.05%～1%過氧乙酸、1%～10%乙醇的溶液中浸泡處理0.5～5h，再用去離子水清洗后在甲醇、氯仿混合液中浸泡1～6h，再依次使用高滲溶液浸泡1～3h、去污劑溶液浸泡1～3h、低滲溶液浸泡1～3h、去污劑溶液浸泡2h；然后置入0.1～1mol/lnaoh溶液中浸泡1～30min；再用去離子水沖洗后進(jìn)行冷凍干燥，γ射線消毒，得到脫細(xì)胞豬小腸粘膜下層。

本發(fā)明制備的基于豬小腸粘膜下層的復(fù)合型生物補(bǔ)片可以在制備皮膚缺損修復(fù)材料中的應(yīng)用；所述皮膚缺損包括糖尿病足潰瘍、燒傷、化學(xué)燒傷、外傷引起的皮膚缺損。

本發(fā)明制備的基于豬小腸粘膜下層的復(fù)合型生物補(bǔ)片應(yīng)用于臨床促進(jìn)皮膚修復(fù)可以通過以下兩種途徑實(shí)施：

基于豬小腸粘膜下層的復(fù)合型生物補(bǔ)片作為暫時(shí)貼附物覆蓋于皮膚缺損表面以促進(jìn)上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，對皮膚和毛細(xì)血管等組織進(jìn)行修復(fù)并在此修復(fù)過程中更強(qiáng)地抗炎、抗瘢痕及促進(jìn)杯狀細(xì)胞分化；

基于豬小腸粘膜下層的復(fù)合型生物補(bǔ)片作為永久性移植替代物移植于皮膚缺損表面以促進(jìn)上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，對皮膚和毛細(xì)血管等組織進(jìn)行修復(fù)并在此修復(fù)過程中更強(qiáng)地抗炎、抗瘢痕及促進(jìn)杯狀細(xì)胞分化。

本發(fā)明制備的基于豬小腸粘膜下層的復(fù)合型生物補(bǔ)片是很好的生物支架材料，結(jié)構(gòu)成分和空間三維結(jié)構(gòu)十分相似，在臨床的實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出了很好的生物相容性，促傷口愈合性，更重要的是對各種組織再生又重塑性；這種生物支架材料對皮膚的創(chuàng)傷愈合有有效的修復(fù)效果，對皮膚的再生有重要意義。

本發(fā)明制備的基于豬小腸粘膜下層的復(fù)合型生物補(bǔ)片支持表面上皮生長，其含有多種細(xì)胞因子等活性成分，是一種理想的支持上皮細(xì)胞生長的物質(zhì)，可延長其生命，維持其克?。欢覠o免疫原性，可作為異基因支架材料，用于移植不會(huì)導(dǎo)致免疫介導(dǎo)的炎性反應(yīng)。

本發(fā)明制備的基于豬小腸粘膜下層的復(fù)合型生物補(bǔ)片在多種跨種交叉移植實(shí)驗(yàn)中均表現(xiàn)為無免疫原性，直接誘發(fā)實(shí)驗(yàn)無應(yīng)答反應(yīng)，含有的多種因子可抑制輔助t細(xì)胞的活化并參與t細(xì)胞的凋亡，可部分抑制輔助t細(xì)胞的擴(kuò)增，并以轉(zhuǎn)移生長因子β依賴方式抑制白介素-12、γ干擾素的分泌，這種抑制可通過加入外源重組il-12而解除，在體外，可完全抑制輔助th2的增值；其存在α-1、α-gal抗原決定簇，但不激活人血清的補(bǔ)體；有良好的細(xì)胞相容性，可促進(jìn)多種細(xì)胞在材料上黏附，生長和分化，是可提供細(xì)胞生長、遷移并有空間定位的三維材料。

本發(fā)明將生長因子、藥物等與脫細(xì)胞豬小腸粘膜下層通過特殊工藝結(jié)合，使皮膚修復(fù)速度加快，減少傷口感染幾率；采用本發(fā)明的基于豬小腸粘膜下層的復(fù)合型生物補(bǔ)片，豬小腸粘膜下層移植手術(shù)操作簡單易行，實(shí)施過程安全可靠，易于實(shí)施，原料來源廣泛，脫細(xì)胞豬小腸粘膜下層作為支架材料應(yīng)用廣泛，制備方便。

本發(fā)明的基于豬小腸粘膜下層的復(fù)合型生物補(bǔ)片的脫細(xì)胞豬小腸粘膜下層作為支架材料，為細(xì)胞增殖提供了良好的細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)，vegf、egf、ngf等生長因子可以促進(jìn)血管生成，神經(jīng)組織修復(fù)和表皮組織的修復(fù)，加快結(jié)膜上皮的修復(fù)以及杯狀細(xì)胞的分化。加入抗生素等藥物可有效防止細(xì)菌感染，減少傷口感染幾率，減輕皮膚修復(fù)過程中炎癥細(xì)胞浸潤，減少結(jié)膜組織再塑性過程中的瘢痕形成；此復(fù)合生物材料可以作為新的組織工程材料用于皮膚表面重建治療。

本發(fā)明的基于豬小腸粘膜下層的復(fù)合型生物補(bǔ)片的主要應(yīng)用形式為暫時(shí)性貼敷或移植復(fù)合生物材料于皮膚缺損組織表面以促進(jìn)皮膚組織重建，并在此過程中達(dá)到更好的促進(jìn)毛細(xì)血管、神經(jīng)組織、表皮組織的生成以及抑制炎癥和抗瘢痕的效果；尤其是涉及糖尿病足潰瘍糖尿病足潰瘍、燒傷、化學(xué)燒傷（堿燒傷）與各種外傷引起的皮膚損傷。

附圖說明

圖1為實(shí)施例一中空白對照組小鼠創(chuàng)緣照片圖；

圖2為實(shí)施例一實(shí)驗(yàn)1周后小鼠創(chuàng)緣照片圖；

圖3為實(shí)施例二中空白對照組小鼠創(chuàng)緣照片圖；

圖4為實(shí)施例二實(shí)驗(yàn)1周后小鼠創(chuàng)緣照片圖；

圖5為實(shí)施例三中空白對照組小鼠創(chuàng)緣照片圖；

圖6為實(shí)施例三實(shí)驗(yàn)1周后小鼠創(chuàng)緣照片圖。

具體實(shí)施方式

下面通過實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)闡述本發(fā)明，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員了解，本發(fā)明的實(shí)施例并非對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，任何在本發(fā)明基礎(chǔ)上做出的改進(jìn)和變化，都在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

實(shí)施例一

將新鮮豬小腸清洗干凈，通過機(jī)械刮除的方法去掉漿膜層和肌層，然后將剩下的小腸粘膜下層在含有0.1%過氧乙酸、10%乙醇的溶液中浸泡處理1h，用去離子水清洗后在甲醇、氯仿混合液中浸泡2h，再依次使用高滲溶液浸泡2h，去污劑溶液浸泡2h，低滲溶液浸泡2h，去污劑溶液浸泡2h。將制得的脫細(xì)胞豬小腸粘膜下層放1mol/lnaoh溶液中浸泡1min；仔細(xì)用去離子水沖洗后進(jìn)行冷凍干燥，γ射線消毒。

上述操作中所述的高滲溶液各物質(zhì)成分為：1l高滲溶液含58.44g氯化鈉、6.06gtris、2.92gedta、1l純化水；低滲溶液各物質(zhì)成分：1l低滲溶液含1.21gtris、1.46gedta、1l純化水；去污劑溶液各物質(zhì)成分：1l去污劑溶液含15g十二烷基磺酸鈉、1l純化水。

將內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取生長狀況良好的第3代內(nèi)皮細(xì)胞和雪旺細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后離心制成細(xì)胞懸液，取細(xì)胞懸液接種于脫細(xì)胞豬小腸粘膜下層表面，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d，取培養(yǎng)結(jié)束的脫細(xì)胞豬小腸粘膜下層與細(xì)胞復(fù)合材料進(jìn)行反復(fù)凍融處理，脫去細(xì)胞，得到復(fù)合生長因子vegf的脫細(xì)胞豬小腸粘膜下層，即基于豬小腸粘膜下層的復(fù)合型生物補(bǔ)片。具體凍融方法：將脫細(xì)胞豬小腸粘膜下層與細(xì)胞復(fù)合材料置于液氮中10min，37℃復(fù)溫10min，重復(fù)操作3次。脫細(xì)胞處理后，用生理鹽水清洗至無渾濁后，凍干備用，使用前生理鹽水復(fù)水15min。

使用上述復(fù)合生長因子vegf的脫細(xì)胞豬小腸粘膜下層在zdf糖尿病鼠身上進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)1周后，創(chuàng)緣均未出現(xiàn)明顯壞死及發(fā)黑，缺損片邊緣周圍出現(xiàn)輪廓光整的組織增生，缺損周圍皮膚開始出現(xiàn)收縮，缺損部位均無膿液形成及出血，炎癥反應(yīng)輕，滲出少，效果圖見圖2，附圖1為空白對照，肉芽組織不多，炎細(xì)胞浸潤明顯，少量上皮長入。

實(shí)施例二

將新鮮豬小腸清洗干凈，通過機(jī)械刮除的方法去掉漿膜層和肌層，然后將剩下的小腸粘膜下層在含有0.5%過氧乙酸、10%乙醇的溶液中浸泡處理2h，用去離子水清洗后在甲醇、氯仿混合液中浸泡2h，再依次使用高滲溶液浸泡2h，去污劑溶液浸泡2h，低滲溶液浸泡2h，去污劑溶液浸泡2h。將制得的脫細(xì)胞豬小腸粘膜下層放0.5mol/lnaoh溶液中浸泡5min；仔細(xì)用去離子水沖洗后進(jìn)行冷凍干燥，γ射線消毒。

上述操作中所述的高滲溶液各物質(zhì)成分為：1l高滲溶液含58.44g、氯化鈉、6.06gtris、2.92gedta、1l純化水；低滲溶液各物質(zhì)成分：1l低滲溶液含1.21gtris、1.46gedta、1l純化水；去污劑溶液各物質(zhì)成分：1l去污劑溶液含15g十二烷基磺酸鈉、1l純化水。

將雪旺細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取生長狀況良好的第3代內(nèi)皮細(xì)胞和雪旺細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后離心制成細(xì)胞懸液，取細(xì)胞懸液接種于脫細(xì)胞豬小腸粘膜下層表面，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d，取培養(yǎng)結(jié)束的脫細(xì)胞豬小腸粘膜下層與細(xì)胞復(fù)合材料進(jìn)行反復(fù)凍融處理，脫去細(xì)胞，得到復(fù)合生長因子ngf的脫細(xì)胞豬小腸粘膜下層，即基于豬小腸粘膜下層的復(fù)合型生物補(bǔ)片。具體凍融方法：將脫細(xì)胞豬小腸粘膜下層與細(xì)胞復(fù)合材料置于液氮中10min，37℃復(fù)溫10min，重復(fù)操作3次。脫細(xì)胞處理后，用生理鹽水清洗至無渾濁后，凍干備用，使用前生理鹽水復(fù)水15min。

上述復(fù)合生長因子ngf的脫細(xì)胞豬小腸粘膜下層移植用于治療糖尿病足潰瘍，使用上述復(fù)合生長因子ngf的脫細(xì)胞豬小腸粘膜下層在zdf糖尿病鼠身上進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)1周后，創(chuàng)緣均未出現(xiàn)明顯壞死及發(fā)黑，缺損片邊緣周圍出現(xiàn)輪廓光整的組織增生，缺損周圍皮膚開始出現(xiàn)收縮，缺損部位均無膿液形成及出血，炎癥反應(yīng)輕，滲出少，效果圖見圖4，附圖3為空白對照組，見真皮淺層仍可見血痂附著炎反應(yīng)明顯，真皮淺層炎反應(yīng)下方明顯肉芽組織形成，膠原纖維增生明顯，上皮覆蓋未完整。

實(shí)施例三

將新鮮豬小腸清洗干凈，通過機(jī)械刮除的方法去掉漿膜層和肌層，然后將剩下的小腸粘膜下層在含有0.5%過氧乙酸、5%乙醇的溶液中浸泡處理1h，用去離子水清洗后在甲醇、氯仿混合液中浸泡4h，再依次使用高滲溶液浸泡2h，去污劑溶液浸泡2h，低滲溶液浸泡2h，去污劑溶液浸泡2h。將制得的脫細(xì)胞豬小腸粘膜下層放0.5mol/lnaoh溶液中浸泡5min；仔細(xì)用去離子水沖洗后進(jìn)行冷凍干燥，γ射線消毒。

上述操作中所述的高滲溶液各物質(zhì)成分為：1l高滲溶液含58.44g氯化鈉、6.06gtris、2.92gedta、1l純化水；低滲溶液各物質(zhì)成分：1l低滲溶液含1.21gtris、1.46gedta、1l純化水；去污劑溶液各物質(zhì)成分：1l去污劑溶液含15g十二烷基磺酸鈉、1l純化水。

將內(nèi)皮細(xì)胞和雪旺細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取生長狀況良好的第3代內(nèi)皮細(xì)胞和雪旺細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后離心制成細(xì)胞懸液，取細(xì)胞懸液接種于脫細(xì)胞豬小腸粘膜下層表面，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d，取培養(yǎng)結(jié)束的脫細(xì)胞豬小腸粘膜下層與細(xì)胞復(fù)合材料進(jìn)行反復(fù)凍融處理，脫去細(xì)胞，得到復(fù)合生長因子vegf和ngf的脫細(xì)胞豬小腸粘膜下層，即基于豬小腸粘膜下層的復(fù)合型生物補(bǔ)片。具體凍融方法：將脫細(xì)胞豬小腸粘膜下層與細(xì)胞復(fù)合材料置于液氮中10min，37℃復(fù)溫10min，重復(fù)操作3次。脫細(xì)胞處理后，用生理鹽水清洗至無渾濁后，凍干備用，使用前生理鹽水復(fù)水15min。

上述復(fù)合生長因子vegf和ngf的脫細(xì)胞豬小腸粘膜下層移植用于治療糖尿病足潰瘍，使用上述復(fù)合生長因子ngf和ngf的脫細(xì)胞豬小腸粘膜下層在zdf糖尿病鼠身上進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)1周后，創(chuàng)緣均未出現(xiàn)明顯壞死及發(fā)黑，缺損片邊緣周圍出現(xiàn)輪廓光整的組織增生，缺損周圍皮膚開始出現(xiàn)收縮，缺損部位均無膿液形成及出血，炎癥反應(yīng)輕，滲出少，效果圖見圖6，附圖5為空白對照組，血痂厚，部分剝離，創(chuàng)面充血明顯，毛細(xì)血管少，周圍表皮細(xì)胞增殖移行不明顯，上皮層較薄，細(xì)胞排列致密凌亂，未見皮膚附屬結(jié)構(gòu)。

實(shí)施例四

將新鮮豬小腸清洗干凈，通過機(jī)械刮除的方法去掉漿膜層和肌層，然后將剩下的小腸粘膜下層在含有0.5%過氧乙酸、5%乙醇的溶液中浸泡處理1h，用去離子水清洗后在甲醇、氯仿混合液中浸泡4h，再依次使用高滲溶液浸泡2h，去污劑溶液浸泡2h，低滲溶液浸泡2h，去污劑溶液浸泡2h。將制得的脫細(xì)胞豬小腸粘膜下層放0.8mol/lnaoh溶液中浸泡5min；仔細(xì)用去離子水沖洗后進(jìn)行冷凍干燥，γ射線消毒。

上述操作中所述的高滲溶液各物質(zhì)成分為：1l高滲溶液含58.44g氯化鈉、6.06gtris、2.92gedta、1l純化水；低滲溶液各物質(zhì)成分：1l低滲溶液含1.21gtris、1.46gedta、1l純化水；去污劑溶液各物質(zhì)成分：1l去污劑溶液含15g十二烷基磺酸鈉、1l純化水。

將脫細(xì)胞豬小腸粘膜下層浸泡在含有肝素的溶液中2h，得到復(fù)合添加劑的脫細(xì)胞豬小腸粘膜下層；移植用于治療糖尿病足潰瘍，實(shí)驗(yàn)1周后，創(chuàng)緣均未出現(xiàn)明顯壞死及發(fā)黑，缺損片邊緣周圍出現(xiàn)輪廓光整的組織增生，缺損周圍皮膚開始出現(xiàn)收縮，缺損部位均無膿液形成及出血，炎癥反應(yīng)輕，滲出少；空白對照組，血痂厚，部分剝離，創(chuàng)面充血明顯。

實(shí)施例五

將新鮮豬小腸清洗干凈，通過機(jī)械刮除的方法去掉漿膜層和肌層，然后將剩下的小腸粘膜下層在含有0.5%過氧乙酸、5%乙醇的溶液中浸泡處理1h，用去離子水清洗后在甲醇、氯仿混合液中浸泡4h，再依次使用高滲溶液浸泡2h，去污劑溶液浸泡2h，低滲溶液浸泡2h，去污劑溶液浸泡2h。將制得的脫細(xì)胞豬小腸粘膜下層放0.2mol/lnaoh溶液中浸泡5min；仔細(xì)用去離子水沖洗后進(jìn)行冷凍干燥，γ射線消毒。

上述操作中所述的高滲溶液各物質(zhì)成分為：1l高滲溶液含58.44g氯化鈉、6.06gtris、2.92gedta、1l純化水；低滲溶液各物質(zhì)成分：1l低滲溶液含1.21gtris、1.46gedta、1l純化水；去污劑溶液各物質(zhì)成分：1l去污劑溶液含15g十二烷基磺酸鈉、1l純化水。

將脫細(xì)胞豬小腸粘膜下層浸泡在含有肝素的溶液中2h，得到復(fù)合添加劑的脫細(xì)胞豬小腸粘膜下層；移植抗生素治療小鼠燒傷，實(shí)驗(yàn)1周后，創(chuàng)緣均未出現(xiàn)明顯壞死及發(fā)黑，缺損片邊緣周圍出現(xiàn)輪廓光整的組織增生，缺損周圍皮膚開始出現(xiàn)收縮，缺損部位均無膿液形成及出血，炎癥反應(yīng)輕，滲出少；空白對照組，血痂厚，部分剝離，周圍表皮細(xì)胞增殖移行不明顯，上皮層較薄，細(xì)胞排列致密凌亂，未見皮膚附屬結(jié)構(gòu)。