本發明屬于生物分子醫藥
技術領域：
：，具體涉及一種可注射水凝膠及其制備和應用。
背景技術：
：：水凝膠是由高分子交聯的三維網絡結構，在生物醫藥領域如藥物釋放、組織工程和生物傳感等有著廣泛的應用。在微創醫療和可注射組織工程中，可注射原位凝膠體系受到了廣泛的關注。凝膠基體在注射前將生物分子或者細胞混合在溶液中，經注射可以將負載了生物分子或細胞的支架材料植入到需要部位，凝膠化后，便成為藥物制劑中的藥物釋放基點或組織再生的細胞生長基點，避免了手術植入的痛苦和繁瑣，且原位細胞固定也有利于填充一個不規則的組織缺陷。目前，制備原位凝膠體系的方法有化學交聯和物理交聯，化學交聯包括自由基聚合和邁克爾加成等，通常需要加入引發劑或生成小分子副產物，物理交聯通過物理變化包括ph值、溫度和離子強度等變化實現。使用動態共價鍵構筑的水凝膠(即動態鍵凝膠)具有較高機械強度和可注射性，且由于敏感基團是化學鍵，從而極大的拓寬了可選擇高分子材料的范圍，可構筑具有多重響應性的水凝膠。楊等使用苯甲酰亞胺鍵可構筑ph/溫度雙敏感的可注射殼聚糖基質水凝膠，苯甲酰亞胺鍵具有生理ph響應性，可通過調節ph值觸發凝膠的形成與破壞，不需要引發劑，且該反應的小分子產物為水，避免了凝膠過程中雜質的引入；形成的水凝膠具有較好的機械強度，在高分子含量較低(5.0wt％)時其彈性模量可達103-104pa，該水凝膠可用于抗腫瘤藥物的長效可控釋放，并取得了較好的腫瘤治療效果(duallyresponsiveinjectablehydrogelpreparedbyinsitucross-linkingofglycolchitosanandbenzaldehyde-cappedpeo-ppo-peo,biomacromolecules2010,11,1043-1051)。苯硼酸酯由苯硼酸衍生物和多羥基化合物反應形成，反應不需要引發劑，不產生除水以外的其它副產物，與葡萄糖氧化酶(gox)、凝集素是構筑葡萄糖響應體系的三大體系。葡萄糖氧化酶和凝集素為蛋白類化合物，對環境要求比較苛刻，外界環境的變化可能會導致其失活，限制了其應用。而亞胺鍵由于其設計的多樣性和更好的穩定性，在發展葡萄糖響應體系方面具有較大的優勢，引起了研究者們更為廣泛的關注。有文獻報道由苯硼酸和聚(n-異丙基丙烯酰胺)(pnipam)組成的凝膠和微凝膠，在葡萄糖存在時能夠溶脹并釋放出胰島素，但這些材料只有在高于苯硼酸pka值(ph9)和較高的葡萄糖濃度(20g/l)下才具有葡萄糖響應性，限制了其在生理條件下(ph7.4，葡萄糖濃度1-3g/l)的應用(synthesisandvolumephasetransitionsofglucose-sensitivemicrogels,biomacromolecules2006,7,3196-3201,phenylboronicacid-basedglucose-responsivepolymericnanoparticles:synthesisandapplicationsindrugdelivery,polym.chem.,2014,5,1503-1518)。技術實現要素：為了克服現有技術的不足，本發明提供了一種安全無毒可生物降解的可注射水凝膠，主要利用特定結構四臂端氨基修飾的聚乙二醇的氨基與丁醛-聚乙二醇-丁醛的醛基形成的亞胺動態鍵得到可注射性水凝膠。本發明還提供了所述可注射水凝膠的制備方法，具有制備過程簡便、快速，易于大規模生產的優勢。本發明采取的具體技術方案如下：一種可注射水凝膠，由原料a、原料b和成膠液構成；所述原料a和原料b的質量之和在水凝膠中的質量百分比為5％-50％，其中原料a為丁醛-聚乙二醇-丁醛，原料b為四臂端氨基修飾的聚乙二醇；所述丁醛-聚乙二醇-丁醛的結構式如式ⅰ所示：式ⅰ，式ⅰ中m為10-16000的整數；所述四臂端氨基修飾的聚乙二醇的結構式如式ⅱ所示：式ⅱ，式ⅱ中n為565-5700的整數。本發明可注射水凝膠，采用式ⅰ所示丁醛-聚乙二醇-丁醛和式ⅱ所示四臂端氨基修飾的聚乙二醇，兩者的結構均為具有良好水溶性的大分子，四臂端氨基修飾的聚乙二醇中的四臂結構能夠為水凝膠提供具有親水性的柔性鏈段的網狀支架，丁醛-聚乙二醇-丁醛的直鏈結構也可充當柔性鏈段，這兩種特有的結構在水溶液中能夠保證形成的水凝膠具有多孔且致密的結構，得到的水凝膠具有優良的柔軟性和彈性，緩釋效果可控；同時，四臂端氨基修飾的聚乙二醇的氨基與丁醛-聚乙二醇-丁醛的醛基形成的亞胺動態鍵對ph具有響應性，能夠原位形成呈現均勻狀態的凝膠，可通過注射方式植入體內。考慮原料a和原料b特定的化學結構，為了達到更好的發明效果，優選：所述原料a和原料b的質量比為(0.5-25)：1，能夠增強水凝膠的穩定性和可注射性。所述原料a和原料b的質量之和在水凝膠中的質量百分比為5％-30％，進一步優選為5％-20％，最優選5％-15％。原料a和原料b的總質量百分濃度為5％-20％時，注射性更加優良；原料a和原料b的總質量百分濃度大于20％且小于等于50％時，凝膠的穩定性更好。原料a和原料b的總質量百分濃度為5％-15％時，不僅注射性優良，而且更適宜在人體正常體溫范圍(一般36.0℃-37.5℃)和正常生理ph7.4條件下快速凝膠化。本發明可根據水凝膠的應用領域不同，選擇合適的原料a和原料b的總質量百分濃度范圍。所述成膠液選用去離子水或者ph值在6-8的緩沖溶液，為水凝膠提供成膠環境。所述緩沖溶液可采用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、磷酸二氫鉀-氫氧化鈉緩沖液、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液、巴比妥鈉-鹽酸緩沖液、三(羥甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液(tris-hcl緩沖液)、硼酸-硼砂緩沖液、甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液、硼砂-氫氧化鈉緩沖液、碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液等緩沖溶液中的一種或者多種。根據其應用領域的要求，所述成膠液均可選用無菌成膠液。所述可注射水凝膠的制備方法，包括步驟：將原料a和原料b加成膠液混合均勻，得到可注射水凝膠。所述可注射水凝膠的形成溫度在20℃-38℃。本發明所用的原料均可采用市售產品或者采用現有制備方法制備得到。所述可注射水凝膠，具有ph響應性及可注射性，可作為藥物載體、栓塞材料或者組織工程材料等應用。所述可注射水凝膠采用特定結構和分子量范圍的原料a和原料b，尤其利于作為負載小分子藥物例如阿霉素(dox)的藥物載體，藥物釋放速率可調節。本發明具有以下有益效果：(1)本發明水凝膠的原料采用具有良好水溶性的大分子，原料本身安全無毒可生物降解，凝膠的形成過程無需使用有機溶劑，克服了水凝膠體內使用時的安全隱患。原料a和原料b均為現有高分子化合物，其來源為化學合成，相較于目前水凝膠大量采用的來自于植物和動物體內的高分子化合物，化學合成的原料具有結構可控制，更容易調節水凝膠的強度、降解速度、藥物釋放速度等優勢。(2)本發明水凝膠主要是特定結構大分子上的氨基和另一特定結構大分子上的醛基反應形成亞胺鍵，在人體正常體溫范圍和正常生理ph值下比較穩定，弱酸性條件下會逐漸水解形成溶液。由于亞胺鍵在正常生理條件下較穩定，在弱酸性條件下易發生水解，本發明可以通過調節兩種原料的比例，控制生成亞胺鍵的比例，從而智能的控制凝膠的形成時間、凝膠的致密程度、藥物的釋放以及凝膠的降解速率。(3)本發明水凝膠有一定的強度和韌性，由于在形成凝膠的過程中生成了亞胺鍵，具有自修復性，可通過原料的分子量和原料的比例調控凝膠性能，進一步提高了凝膠的生物相容性；本發明制備的凝膠具有生物降解性能，能被人體代謝；具有ph響應性及可注射性，可用作藥物載體、栓塞材料以及組織工程材料等。(4)本發明可注射水凝膠的制備方法，具有制備過程簡便、快速，易于大規模生產的優勢。附圖說明圖1為本發明實施例1中可注射水凝膠的電鏡掃描圖；圖2為本發明實施例3中可注射水凝膠的流變圖；其中g′表示儲能模量，g″表示損耗模量；圖3為本發明應用例3中載藥可注射水凝膠在兩種ph環境中下的藥物累積釋放曲線圖；圖4為本發明應用例1中載藥可注射水凝膠的在ph7.4環境中藥物累積釋放曲線圖。具體實施方式下面結合具體實施例對本發明進一步的描述。本具體實施方式并非對其保護范圍的限制。實施例1將0.5g丁醛-聚乙二醇-丁醛(m＝100)和1g四臂端氨基修飾的聚乙二醇(n＝1000，laysan)加28.5g無菌去離子水，37℃迅速震蕩混合均勻，35秒后得到30g呈透明、均勻狀態的可注射水凝膠。該可注射水凝膠的電鏡掃描圖見圖1，顯示水凝膠具有多孔且致密的結構，孔徑在0.1mm-0.4mm。實施例2將5g丁醛-聚乙二醇-丁醛(m＝16000)和1g四臂端氨基修飾的聚乙二醇(n＝5000，laysan)加34g磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(ph＝6.5)，37℃迅速震蕩混合均勻，30秒后得到40g呈透明、均勻狀態的可注射水凝膠。所得可注射水凝膠的電鏡掃描圖顯示水凝膠具有多孔且致密的結構，孔徑在0.1mm-0.3mm。實施例3將14g丁醛-聚乙二醇-丁醛(m＝10000)和1g四臂端氨基修飾的聚乙二醇(n＝5700，laysan)加85g磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液(ph＝7.4)，37℃迅速震蕩混合均勻，25秒后得到100g呈透明、均勻狀態的可注射水凝膠。所得可注射水凝膠的電鏡掃描圖顯示水凝膠具有多孔且致密的結構，孔徑在0.1mm-0.3mm。實施例4將25g丁醛-聚乙二醇-丁醛(m＝10)和1g四臂端氨基修飾的聚乙二醇(n＝565，laysan)加234g巴比妥鈉-鹽酸緩沖液(ph＝6)，38℃迅速震蕩混合均勻，32秒后得到260g呈透明、均勻狀態的可注射水凝膠。所得可注射水凝膠的電鏡掃描圖顯示水凝膠具有多孔且致密的結構，孔徑在0.1mm-0.3mm。實施例5將20g丁醛-聚乙二醇-丁醛(m＝5000)和1g四臂端氨基修飾的聚乙二醇(n＝2500，laysan)加84gtris-hcl緩沖液(ph＝6.4)，37℃迅速震蕩混合均勻，22秒后得到105g呈透明、均勻狀態的可注射水凝膠。所得可注射水凝膠的電鏡掃描圖顯示水凝膠具有多孔且致密的結構，孔徑在0.1mm-0.2mm。實施例6將25g丁醛-聚乙二醇-丁醛(m＝8000)和1g四臂端氨基修飾的聚乙二醇(n＝4000，laysan)加61g甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(ph＝7.6)，20℃迅速震蕩混合均勻，18秒后得到87g呈透明、均勻狀態的可注射水凝膠。所得可注射水凝膠的電鏡掃描圖顯示水凝膠具有多孔且致密的結構，孔徑在0.1mm-0.3mm。實施例7將10g丁醛-聚乙二醇-丁醛(m＝13000)和1g四臂端氨基修飾的聚乙二醇(n＝3200，laysan)加11g硼酸-硼砂緩沖液(ph＝8)，30℃迅速震蕩混合均勻，12秒后得到22g呈透明、均勻狀態的可注射水凝膠。所得可注射水凝膠的電鏡掃描圖顯示水凝膠具有多孔且致密的結構，孔徑在0.1mm-0.3mm。以阿霉素作為模型藥物探索了本發明水凝膠控制藥物釋放的性質：應用例1將阿霉素500mg、0.5g丁醛-聚乙二醇-丁醛(m＝100)和1g四臂端氨基修飾的聚乙二醇(n＝1000，laysan)加28.4g無菌去離子水，37℃迅速震蕩混合均勻，35秒后得到30g呈透明、均勻狀態的可注射載藥水凝膠，包封率85％，載藥量1.42％。應用例2將阿霉素700mg、5g丁醛-聚乙二醇-丁醛(m＝16000)和1g四臂端氨基修飾的聚乙二醇(n＝5000，laysan)加33.9g磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(ph＝6.5)，37℃迅速震蕩混合均勻，30秒后得到40g呈透明、均勻狀態的可注射載藥水凝膠，包封率90％，載藥量1.58％。應用例3將阿霉素1.5g、14g丁醛-聚乙二醇-丁醛(m＝10000)和1g端四臂氨基修飾的聚乙二醇(n＝5700，laysan)加84.9g磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液(ph＝7.4)，37℃迅速震蕩混合均勻，25秒后得到100g呈透明、均勻狀態的可注射載藥水凝膠，包封率92％，載藥量1.38％。本發明水凝膠，隨著聚合物濃度的增加成膠時間縮短，水凝膠的成膠時間可以方便的控制在12秒-35秒。本發明水凝膠成膠時間較短，可以在原位注射時避免各原料和溶液混合后凝膠分子濃度瞬間被體液等稀釋而影響水凝膠的形成，具有可注射性，能夠原位成膠。將實施例1-6中的可注射水凝膠采用rs6000流變儀(thermo-fisher)在37℃的測試平臺上進行流變分析測試，以實施例3中可注射水凝膠的流變圖(如圖2所示)為例，流變結果顯示：隨著時間的增加儲能模量g′與損耗模量g″逐漸增強，相同時間條件儲能模量g′明顯大于損耗模量g″，表明本發明水凝膠為彈性網孔結構。應用例1-3中水凝膠負載藥物后，水凝膠的成膠時間沒有變化，表明本發明水凝膠負載藥物前后均可以快速形成凝膠狀，均具有良好的可注射性。將應用例1-3中的所得載藥水凝膠置于10ml的ph＝7.4的磷酸鹽緩沖溶液(pbs溶液)或者ph＝6.5的pbs溶液中，37℃，40rpm恒溫振蕩器中進行體外藥物釋放，分別于多個時間點(t)取1ml上清液，每次取上清液后及時補入1ml的新鮮pbs溶液，采用hplc法檢測各時段上清液(樣品)中阿霉素含量，計算藥物累積釋放率(％)。hplc檢測條件：用0.5ml流動相再次溶解，用反相高效液相色譜(rp-hplc，agilent1200，agilenttechnologiesinc.，usa)檢測其濃度。將20μl樣品注射到zorbaxeclipseplusc18色譜柱(150mm×4.6mm)，5.0μm，agilentcorp.，usa)中，以1ml/min的淋洗速度洗脫，流動相組成為乙腈/水/甲醇(48/41/11,v/v/v)，紫外檢測波長為227nm。釋放液中dox的含量用紫外-可見分光光度計檢測，檢測波長為485nm。釋放結果以三次重復測試的平均值繪圖。藥物累積釋放率＝(t時間藥物釋放總質量÷實際負載藥物質量)×100％。應用例3的載藥可注射水凝膠的藥物累積釋放曲線圖見圖3，不同ph值條件下，藥物釋放速度不同，表明本發明可注射水凝膠具有ph響應性，在ph7.4的時候，藥物釋放速度較慢，在弱酸性條件下(如ph6.5時)，由于亞胺鍵的不穩定，凝膠交聯點減少，藥物釋放速度加快。應用例1的載藥可注射水凝膠的藥物累積釋放曲線圖見圖4，應用例2的載藥可注射水凝膠的藥物累積釋放結果與應用例1的藥物累積釋放結果基本相同，其藥物釋放曲線圖中顯示，本發明水凝膠中的阿霉素能夠緩釋，并且其能夠有效緩釋長達12小時。本發明載藥可注射水凝膠的藥物累積釋放結果表明此凝膠釋放體系在作為化療藥物緩釋載體中有應用價值。另外由于本發明水凝膠具有降解性，在植入體內的材料，如栓塞材料或者組織工程材料等領域有應用價值。當前第1頁12當前第1頁12