本發(fā)明涉及一種脫細(xì)胞組織膜的制備方法,它是一種以哺乳動(dòng)物組織膜為原料加工成醫(yī)用材料的方法，該材料可用于組織工程支架、組織膜修補(bǔ)材料和醫(yī)用敷料等的制備。
背景技術(shù)：
：脫細(xì)胞組織膜材料作為醫(yī)療器械在醫(yī)療領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，例如生物補(bǔ)片、創(chuàng)面敷料、創(chuàng)口修復(fù)材料、組織修復(fù)支架等。用于制備脫細(xì)胞組織的原材料來源廣泛，比如人體皮膚、動(dòng)物皮膚、腹腔膜、體腔膜、肌腱、小腸粘膜、羊膜、血管、心包膜等。脫細(xì)胞組織膜制備大致方法是將新鮮的組織通過物理、化學(xué)或者生物的方法脫除組織的細(xì)胞成分（如dna、蛋白質(zhì)、多糖），降低材料的免疫原性，保留下組織的胞外基質(zhì)，主要由膠原、氨基聚糖、蛋白聚糖、彈性蛋白等組成，對(duì)細(xì)胞組織起支持、保護(hù)、提供營(yíng)養(yǎng)、細(xì)胞分化、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)遷移、細(xì)胞識(shí)別、細(xì)胞黏著和通信聯(lián)絡(luò)等作用，甚至有報(bào)道稱其中可以保留一定含量的生長(zhǎng)因子，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、血小板源性生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，使其在組織的修復(fù)和重建過程中發(fā)揮重要作用。脫細(xì)胞組織制備方法有很多種。中國(guó)專利cn103191466b公開的脫細(xì)胞組織操作方法簡(jiǎn)單，但其中組織保存步驟所需時(shí)間長(zhǎng)達(dá)1～12個(gè)月，導(dǎo)致整個(gè)加工藝耗時(shí)太長(zhǎng)。cn103432627b采用堿泡、核糖核酸酶消化、α-半乳糖苷酶、病毒滅活、滅菌等步驟，能很好地去除細(xì)胞成分和α-gal抗原，但其中的核糖核酸酶和α-半乳糖苷酶等酶制劑價(jià)格昂貴，處理起來成本高。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種脫細(xì)胞組織膜的制備方法，采用常規(guī)的一些試劑材料，經(jīng)簡(jiǎn)單的加工步驟得到脫細(xì)胞組織。本加工工藝具有抗原去除徹底，加工周期短的特點(diǎn)，所用試劑價(jià)格便宜易獲得，組織結(jié)構(gòu)破壞小，具有有利于組織細(xì)胞生長(zhǎng)的孔隙，有助于提升細(xì)胞貼附生長(zhǎng)，在臨床上有利于組織再生。本發(fā)明提供的脫細(xì)胞組織膜的制備方法具體包括以下步驟：1)組織修剪：去除組織膜上脂肪組織，沖洗干凈血漬。2)堿液浸泡：將修剪后的組織放入堿液浸泡裂解細(xì)胞，然后取出用酸中和后清洗干凈。3)表面活性劑溶液浸泡：將中和清洗后的組織放入表面活性劑溶液中，以充分浸出雜蛋白。4)蛋白復(fù)性溶液浸泡：將組織膜放入蛋白復(fù)性溶液中浸泡進(jìn)一步去除雜蛋白，然后清洗干凈。5)有機(jī)溶劑浸泡：將組織膜放入有機(jī)溶劑中浸泡去除脂質(zhì)，然后通過水或親水性有機(jī)溶劑與水組合清洗掉有機(jī)溶劑。6)組織孔隙制備：將組織膜放入堿溶液中浸泡以產(chǎn)生空隙，然后進(jìn)行中和。7)交聯(lián)：利用交聯(lián)劑與抗原位點(diǎn)的氨基、羥基、羥基等發(fā)生反應(yīng)，進(jìn)一步降低脫細(xì)胞組織的抗原性，或提升脫細(xì)胞組織的降解周期，或提升脫細(xì)胞組織的拉伸強(qiáng)度。8)滅菌：將上述步驟的得到的組織膜片，以（通常的方法）濕性狀態(tài)進(jìn)行輻射滅菌；或者以凍干的形式（通常的方法）進(jìn)行輻射滅菌或eo滅菌。本方法沒有使用一些價(jià)格昂貴的酶去除細(xì)胞和α-gal抗原，大大降低成本，也可達(dá)到很好的去除效果。步驟1)中所采用的組織包括來人類、哺乳動(dòng)物（豬、牛、羊等）的真皮組織、血管、消化腔道、臟器膜、體腔膜等。步驟2)中所用堿包括但不限于氫氧化鈉，氫氧化鉀，氫氧化鈣等，所用的濃度為0.001m～5m，優(yōu)選0.01m～1m，浸泡時(shí)間5min～5h，優(yōu)選10min～2h。步驟2)中所用的酸包括但不限于磷酸、醋酸、檸檬酸、鹽酸、硫酸、硫酸氫鹽、草酸、苯甲酸、苯乙酸，甲酸等。步驟3)中所用表面活性劑溶液成分包括表面活性劑、緩沖鹽、無機(jī)鹽、巰基化合物等中一種或多種成分。其中表面活性劑包括但不限于十二烷基硫酸鈉、十二烷基磺酸鈉、吐溫-20、吐溫-40、吐溫-60、吐溫-80、tritonx-100等中的一種或多種，濃度為0.1%～5%，優(yōu)選為0.5%～4%。緩沖鹽包括tris-hcl、氨鹽、磷酸鹽、醋酸鹽等中的一種或多種，濃度為1mm～1m，優(yōu)先5mm～500mm。無機(jī)鹽包括但不限于氯化物、硫酸鹽、硝酸鹽等一種或多種，濃度為1mm～100mm，優(yōu)選2mm～50mm。巰基化合物包括但不限于β-巰基乙醇、二硫蘇糖醇等，濃度為0.5mm～20mm，優(yōu)選1mm～5mm。表面活性劑溶液的ph值在5～9之間，優(yōu)選為6～8。浸泡時(shí)間為0.5d～7d，優(yōu)選1d～5d。浸泡溫度為10℃～40℃，優(yōu)選為18℃～30℃。步驟4）中蛋白復(fù)性溶液成分包括但不限于尿素、鹽酸胍中至少一種。所用尿素濃度為4m～10m，優(yōu)選濃度為6m～8m；浸泡時(shí)長(zhǎng)為1h～5h，優(yōu)選2h～4h；浸泡溫度為4℃～40℃，優(yōu)選為20℃～30℃。所用鹽酸胍濃度為1m～5m，優(yōu)選濃度為2m～4m；浸泡時(shí)長(zhǎng)為1h～5h，優(yōu)選2h～4h；浸泡溫度為4℃～40℃，優(yōu)選為20℃～30℃。步驟5）中所用的有機(jī)溶劑包括但不限于親水性和親油性有機(jī)溶劑中一種或多種。親水性有機(jī)溶劑包括但不限于甲醇，乙醇，乙二醇，丙酮，正丙醇，異丙醇，丙二醇，丙三醇，丁醇等，親油性有機(jī)溶劑包括但不限于乙酸乙酯，甲苯，石油醚，丁酸乙酯、醋酸戊酯、丁酸戊脂、乳酸乙酯等。步驟6）中所用的堿為氫氧化鈉，氫氧化鉀，氫氧化鈣等，所用堿的濃度為0.01m～5m，優(yōu)選為0.5m～2m，浸泡時(shí)間為5min～10h，優(yōu)選為10min～5h。不同堿濃度和浸泡時(shí)間調(diào)節(jié)孔隙大小，孔隙大小范圍為10μm～400μm，優(yōu)選為50μm～200μm。步驟7）中所用交聯(lián)劑包括但不限于環(huán)氧類化合物，醛類，二酰二胺，二異氰酸酯，碳化二亞胺，酸酐等。所用濃度為0.1%～10%，優(yōu)選為1%～5%。交聯(lián)時(shí)長(zhǎng)2h～48h，優(yōu)選12h～30h。步驟2），3），6）和8）可以單獨(dú)或組合作為病毒滅活步驟。上述的方法得到的脫細(xì)胞組織膜；其拉伸強(qiáng)度大于0.1mpa。該脫細(xì)胞組織膜的孔隙大小范圍為10μm～400μm，優(yōu)選為50μm～200μm。本發(fā)明提供了一種脫細(xì)胞組織膜的制備方法，采用常規(guī)的一些試劑材料，經(jīng)簡(jiǎn)單的加工步驟得到脫細(xì)胞組織。該方法可以將人源或動(dòng)物源組織膜中細(xì)胞、脂質(zhì)、雜蛋白等抗原物質(zhì)去除干凈，同時(shí)又保留細(xì)胞外基質(zhì)并產(chǎn)生合適的孔隙。本加工工藝具有抗原去除徹底，加工周期短的特點(diǎn)，所用試劑價(jià)格便宜易獲得，組織結(jié)構(gòu)破壞小，具有有利于組織細(xì)胞生長(zhǎng)的孔隙，有助于提升細(xì)胞貼附生長(zhǎng)，在臨床上有利于組織再生。該方法制備的脫細(xì)胞組織膜可以作為組織工程支架、組織膜破損的修補(bǔ)材料以及創(chuàng)面敷料。附圖說明圖1表面結(jié)構(gòu)的電鏡掃描圖。圖2h&e染色和免疫組化檢測(cè)結(jié)果。圖3組織孔隙對(duì)細(xì)胞粘附生長(zhǎng)的影響。具體實(shí)施方式以下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，這并不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件以及手冊(cè)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件；所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可由商業(yè)途徑獲得。實(shí)施例1一種脫細(xì)胞組織膜的制備方法：(1)取出6個(gè)月齡牛的腹腔膜，進(jìn)行清洗；(2)組織修剪：以腹腔膜為原材料，用剪刀剪除脂肪組織等殘留組織碎片，用純化水沖洗干凈血漬。(3)堿液浸泡：取上述清洗后的膜組織稱取10g，加入100ml濃度為0.1mol/l的氫氧化鈉溶液中浸泡20min；取上述步驟浸泡后的膜組織加入質(zhì)量濃度為4%的醋酸溶液中浸泡10min，然后將膜取放入純化水清洗3次，每次5min。(4)表面活性劑溶液浸泡：表面活性劑溶液的配方為1%十二烷基硫酸鈉、50mm醋酸鈉、20mm氯化鉀、10mm氯化鎂、10mm氯化鈉、5mm的β-巰基乙醇，用醋酸調(diào)節(jié)ph值至7.0；將上一步的膜放入100ml表面活性劑溶液中，浸泡2d，浸泡溫度為26℃；然后更換浸泡液，再浸泡2d，浸泡溫度為26℃。將膜取放入純化水清洗3次，每次5min。(5)鹽酸胍溶液浸泡：配制2m的鹽酸胍水溶液100ml，將上一步驟的膜放入鹽酸胍溶液中，于25℃條件下浸泡2h。取出膜，放入純化水清洗3次，每次5min。(6)脫脂處理:將上述步驟膜放入50%乙醇中浸泡1h；放入60%乙醇中浸泡1h；放入70%乙醇中浸泡1h；放入80%乙醇中浸泡1h；放入90%乙醇中浸泡1h；放入100%乙醇中浸泡1h；然后放入石油醚中浸泡2h；再更換100%乙醇浸泡1h；更換90%乙醇浸泡1h；更換80%乙醇浸泡1h；更換70%乙醇浸泡1h；將膜取放入純化水清洗3次，每次5min。(7)交聯(lián)：取上一步浸泡后的膜組織加入體積濃度為1％丁二醇縮水甘油醚的0.1m碳酸鈉溶液中浸泡24h，溫度控制為25℃。將膜取放入純化水清洗3次，每次5min。(8)滅菌：將膜放入復(fù)合塑料袋中，加入30ml生理鹽水進(jìn)行封裝，用15kgy的劑量進(jìn)行鈷-60輻射滅菌。實(shí)施例2(1)取膜：取出6個(gè)月齡牛的腹腔膜，進(jìn)行清洗；(2)組織修剪：以腹腔膜為原材料，用剪刀剪除脂肪組織等殘留組織碎片，用純化水沖洗干凈血漬。(3)堿液浸泡：取上述清洗后的膜組織稱取10g，加入100ml濃度為1mol/l的氫氧化鈉溶液中浸泡1h；取上述步驟浸泡后的膜組織加入質(zhì)量濃度為4%的醋酸溶液中浸泡10min，然后將膜取放入純化水清洗3次，每次5min。(4)表面活性劑溶液浸泡：表面活性劑溶液的配方為1%十二烷基硫酸鈉、50mm醋酸鈉、20mm氯化鉀、10mm氯化鎂、10mm氯化鈉、5mm的β-巰基乙醇，用醋酸調(diào)節(jié)ph值至7.0；將上一步的膜放入100ml表面活性劑溶液中，浸泡2d，浸泡溫度為26℃；然后更換浸泡液，再浸泡2d，浸泡溫度為26℃。將膜取放入純化水清洗3次，每次5min。(5)鹽酸胍溶液浸泡：配制2m的鹽酸胍水溶液100ml，將上一步驟的膜放鹽酸胍溶液中，于25℃條件下浸泡2h。取出膜，放入純化水清洗3次，每次5min。(6)脫脂處理:將上述步驟膜放入50%乙醇中浸泡1h；放入60%乙醇中浸泡1h；放入70%乙醇中浸泡1h；放入80%乙醇中浸泡1h；放入90%乙醇中浸泡1h；放入100%乙醇中浸泡1h；然后放入石油醚中浸泡2h；再更換100%乙醇浸泡1h；更換90%乙醇浸泡1h；更換80%乙醇浸泡1h；更換70%乙醇浸泡1h；將膜取放入純化水清洗3次，每次5min。(7)組織孔隙處理：將制備的膜放入1m的氫氧化鈉，浸泡時(shí)間為1h。(8)交聯(lián)：取上面浸泡后的膜組織加入體積濃度為1％乙醛的磷酸鹽緩沖溶液（ph=7.0）中進(jìn)行，反應(yīng)溫度為25℃，交聯(lián)24h。將膜取出放入純化水清洗3次，每次5min。(9)凍干與滅菌：將上述得到的組織膜在-40℃～-5℃范圍內(nèi)冷凍真空干燥，凍干結(jié)束后將膜放入透析紙袋進(jìn)行eo滅菌。對(duì)照例1:本實(shí)施例與實(shí)施例1的制備方法相比，其區(qū)別僅在于沒有經(jīng)過鹽酸胍溶液浸泡的步驟。對(duì)照例2:本實(shí)施例與實(shí)施例1的制備方法相比，其區(qū)別在于沒有經(jīng)過脫脂處理的步驟。對(duì)照例3:本實(shí)施例與實(shí)施例2相比，其區(qū)別僅在于沒有組織孔隙處理的步驟。對(duì)照例4:本實(shí)施例與實(shí)施例2相比，其區(qū)別僅在于組織孔隙處理步驟中浸泡時(shí)間為4h。效果例：通過實(shí)驗(yàn)例來考察本發(fā)明下述相關(guān)實(shí)施例及對(duì)照例制備的脫細(xì)胞組織膜各項(xiàng)性能：1.降解性能將實(shí)施例2，對(duì)照例3和對(duì)照例4制備的樣品，放入于1m氫氧化鈉溶液，在37℃條件下觀察其降解情況，每隔1h觀察其是否完全降解。降解情況見表1。表1體外降解情況組別降解時(shí)間實(shí)施例25h對(duì)照例38h對(duì)照例41h結(jié)論：組織孔隙制備處理過程所用時(shí)間越久，其體外降解的時(shí)間就越短。2.拉伸強(qiáng)度將實(shí)施例2、對(duì)照例3和對(duì)照例4的制備的樣品裁剪為用啞鈴型模具制成待檢測(cè)的樣品條，中間窄處寬度為5mm(w)，兩端寬處寬度為10mm。將啞鈴型樣品的兩端分別固定于拉力機(jī)的兩個(gè)夾具上，測(cè)量補(bǔ)片的中間窄處的厚度(t)，然后開動(dòng)拉力試驗(yàn)機(jī)，以500mm/min的速度拉伸直至待測(cè)樣品斷裂。記錄斷裂力（f）。拉伸強(qiáng)度=f/(wt)。表2拉伸強(qiáng)度測(cè)量結(jié)果組別拉伸強(qiáng)度mpa實(shí)施例22.3±0.3對(duì)照例34.8±0.4對(duì)照例40.4±0.2結(jié)果分析：組織孔隙處理過程所用堿時(shí)間越長(zhǎng)，樣品的拉伸強(qiáng)度，這一結(jié)果與降解性能具有相關(guān)性。3.材料孔徑大小及對(duì)細(xì)胞粘附效果的影響。將實(shí)施例2和對(duì)照例3制得的樣品孔徑用掃描電鏡進(jìn)行表面掃描，測(cè)量表面孔徑大小。結(jié)果見表3。實(shí)施例2和對(duì)照例3的電鏡結(jié)果見圖1。表3孔徑測(cè)量結(jié)果組別孔徑（μm）孔徑范圍（μm）實(shí)施例286.2±23.631-184對(duì)照例3未觀察到明顯孔徑/結(jié)果分析：從結(jié)果上看，組織孔隙處理步驟有助于組織孔隙的生成。4.脂肪含量將實(shí)施例1和對(duì)照例2制備得到的樣品進(jìn)行脂肪含量檢測(cè)。脂肪含量的按下列步驟進(jìn)行：準(zhǔn)確稱取兩組樣品1.00g并置具塞錐形瓶中，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組加乙醚10ml密塞，不定時(shí)振蕩，放置約2小時(shí)后，將乙醚液傾倒至用乙醚潤(rùn)濕的濾紙上，濾過,殘?jiān)靡颐?0ml照上法處理，再用乙醚5ml洗滌殘?jiān)?，合并濾液及洗液至已恒重的蒸發(fā)皿中，使乙醚自然揮散后，在105°c干燥2小時(shí)，精密稱定遺留脂肪量。脂肪含量計(jì)算方法如下：表4脂肪含量測(cè)量結(jié)果組別脂肪含量實(shí)施例10.04%對(duì)照例20.52%結(jié)果分析：從結(jié)果來看，通過脫脂處理步驟，脂肪含量有了很大的降低。5.體外細(xì)胞毒檢測(cè)結(jié)果將實(shí)施例1、實(shí)施例2制備的樣品加入細(xì)胞培養(yǎng)基，按6cm2/ml于37℃條件下浸提24h，制備浸提液；將l929細(xì)胞消化后，分散在96孔板中，2000個(gè)/孔。置于37℃，5%二氧化碳條件下培養(yǎng)過夜（14-16）小時(shí)。第二天，棄掉96孔板中的培養(yǎng)基，加入浸提液或?qū)φ諛悠?。置?7℃，5%二氧化碳條件下培養(yǎng)48h。待細(xì)胞匯合率為80%時(shí)，每孔加mtt20μl，置37℃孵育3小時(shí)，棄上清后加dmso150μl/孔。避光震蕩10min后，酶標(biāo)儀測(cè)量570nm和630nm的吸光度，計(jì)算各組細(xì)胞的相對(duì)增殖率，相對(duì)增殖率=實(shí)驗(yàn)組吸光度均值（od570-od630）/陰性對(duì)照組吸光度均值（od570-od630）×100%。結(jié)果見表5。表5體外細(xì)胞毒測(cè)量結(jié)果組別細(xì)胞增殖情況實(shí)施例1106%實(shí)施例294%結(jié)果分析：經(jīng)過實(shí)施例1和實(shí)施例2制備得到的樣品對(duì)細(xì)胞增殖沒有明顯的影響，沒有明顯的細(xì)胞毒性。6.抗原去除效果將未經(jīng)過處理的牛腹腔膜、實(shí)施例1和對(duì)照例1制備的樣品，制備出石蠟切片，然后進(jìn)行he染色和免疫組化染色，其中免疫組化染色觀察了兩種常見抗原mch-ⅰ和α-gal的殘留情況。結(jié)果見圖2。結(jié)果分析：從h&e染色結(jié)果來看，經(jīng)過加工工藝的處理，膜內(nèi)組織結(jié)構(gòu)條理整齊清晰，結(jié)構(gòu)未受到破壞，未見到細(xì)胞結(jié)構(gòu)。實(shí)施例1和對(duì)照例1相比，在抗原去除效果上更佳。實(shí)施例1工藝中雖然沒有用到α-半乳糖苷酶，但α-gal去除效果良好。7.組織孔隙對(duì)細(xì)胞粘生長(zhǎng)的作用將實(shí)施例2和對(duì)照例3中的樣品用細(xì)胞培養(yǎng)基浸漬后，種入l929成纖維細(xì)胞，培養(yǎng)72h小時(shí)。取出膜組織用4%多聚甲醛固定1天后凍干，用掃描電鏡觀察l929細(xì)胞在表面微孔內(nèi)的生長(zhǎng)情況，結(jié)果見圖3。結(jié)果分析：通過組織孔隙制備工藝后得到樣品中的空隙有大量的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)，沒有孔隙的樣品中細(xì)胞生長(zhǎng)較少。而成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)有助創(chuàng)面?zhèn)诘男迯?fù)，因此具有合適孔徑的脫細(xì)胞組織膜更適合臨床應(yīng)用。當(dāng)前第1頁12