本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域，具體涉及一種含有多核苷酸的藥物制劑，所述藥物制劑含有編碼結合ctla4和pd-1的雙功能抗體的多核苷酸和遞送系統(tǒng)，所述多核苷酸是mrna或sarna。

背景技術：

1、在過去的十多年中，免疫療法已成為治療多種癌癥的重要組成部分[1]。程序性細胞死亡-1(pd-1)受體主要表達在活化的t淋巴細胞表面，pd-1與其配體pd-l1和pd-l2結合可抑制t細胞增殖和細胞因子的產(chǎn)生。細胞毒性t淋巴細胞抗原-4(ctla-4)在活化的cd4+和cd8+t細胞表面表達，與配體b7.1和b7.2結合可抑制t細胞活性，因此ctla-4是t細胞活性的負調節(jié)因子[2]。pd-l1和pd-l2在一些腫瘤細胞中上調，通過這一途徑的信號傳導可以抑制激活t細胞對腫瘤的免疫監(jiān)視。pd-1和ctla-4在腫瘤浸潤淋巴細胞中共表達，但在正常外周組織淋巴細胞中不表達[3]。

2、靶向免疫檢查點pd-1的單克隆抗體已被接受為許多腫瘤類型的治療標準。許多與抗pd-1抗體聯(lián)合治療以提高pd-1單藥治療的療效已被廣泛研究。目前的臨床研究表明，抗ctla-4和抗pd-1抗體聯(lián)合治療可產(chǎn)生顯著的免疫應答提高了對一些難以治療的癌癥類型的療效，如腎細胞癌、胃癌和小細胞肺癌，但由于嚴重的毒性，應用受到限制[4]。雙特異性抗體是新一代的治療性抗體提高癌癥患者的療效和安全性。目前國內已批準康方生物的pd-1&ctla4雙抗用于宮頸癌的治療[2]。

3、然而雙特異性抗體在治療中花費高，血清中的半衰期短，同時大多數(shù)雙特異性抗體都面臨著制造上的挑戰(zhàn)，包括在長期存儲中穩(wěn)定性差，隨著時間的推移容易聚集，以及各種雜質的存在[5]。

4、mrna已經(jīng)被證明是一種有前景的持續(xù)表達抗體的方式，由于它簡單的生產(chǎn)、快速地制備過程，對于蛋白純化不需要復雜和昂貴的實驗設施[6],可以加快新型雙特異性抗體的臨床開發(fā)。此外，與mrna技術相比，自復制mrna(sarna)技術被認為具有更多優(yōu)點，使用劑量低，副作用少，可以長期表達[7]，在體內產(chǎn)生更多的蛋白質。

5、為了促進雙特異性抗體在體內的表達，發(fā)明人現(xiàn)提供一系列具有高表達量的多核苷酸，以加速核酸形式的免疫療法在癌癥治療領域的應用。

6、參考文獻：

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10、[4]larkin?j,chiarion-sileni?v,gonzalez?r,grob?jj,cowey?cl,lao?cd,schadendorf?d,dummer?r,smylie?m,rutkowski?p,et?al.combined?nivolumab?andipilimumab?or?monotherapy?in?mabs?9untreated?melanoma.n?engl?j?med.2015；373:23–34.

11、[5]vasilenko?e?a,mokhonov?v?v,gorshkova?e?n,et?al.bispecificantibodies:formats?and?areas?of?application[j].molekuliarnaia?biologiia,2018,52(3):380-393.

12、[6]stadler?c?r,bahr-mahmud?h,celik?l,et?al.elimination?of?largetumors?in?mice?by?mrna-encoded?bispecific?antibodies(vol?23,pg?815,2017)[j].nature?medicine,2017(10):23.

13、[7]huang?c,duan?x,wang?j,et?al.lipid?nanoparticle?delivery?system?formrna?encoding?b7h3-redirected?bispecific?antibody?displays?potent?antitumoreffects?on?malignant?tumors.adv?sci(weinh).2023jan；10(3):e2205532.

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供編碼結合ctla4和pd-1的雙功能抗體的多核苷酸。

2、具體技術方案如下：

3、一種含有多核苷酸的藥物制劑，所述藥物制劑含有編碼結合ctla4和pd-1的雙功能抗體的多核苷酸和遞送系統(tǒng)，所述雙功能抗體含有：靶向pd-1的第一功能區(qū)，和靶向ctla-4的第二功能區(qū)，其中，所述第一功能區(qū)是抗pd-1重鏈抗體或其抗原結合片段，所述第二功能區(qū)是抗ctla-4重鏈抗體或其抗原結合片段，所述抗pd-1重鏈抗體的互補決定區(qū)包含p-cdr1、p-cdr2和p-cdr3，其中p-cdr1包括與seq?id?no:1或4所示的序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列、p-cdr2包括與seq?id?no:2或5所示的序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列、和p-cdr3包括與seq?id?no:3或6所示的序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列，并且，所述抗ctla-4重鏈抗體的互補決定區(qū)包含c-cdr1、c-cdr2和c-cdr3，其中c-cdr1包括與seq?id?no:7所示的序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列、c-cdr2包括與seq?id?no:8所示的序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列、和c-cdr3包括與seq?id?no:9所示的序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。

4、在一個或多個實施方案中，抗ctla-4重鏈抗體具有seq?id?no:12所示的序列，或與其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列，并且其中各cdr序列與seq?id?no:12保持相同的序列。

5、在一個或多個實施方案中，所述第一功能區(qū)和第二功能區(qū)獨立地為1個、2個或者2個以上。

6、在一個或多個實施方案中，所述第一功能區(qū)和所述第二功能區(qū)通過接頭融合。優(yōu)選地，所述接頭為(ggsgg)p或(g4s)mgn，m、n和p各自獨立為1-10的正整數(shù)。優(yōu)選地，m、n和p各自獨立為1-6或1-4的正整數(shù)。

7、在一個或多個實施方案中，所述接頭具有seq?id?no:13-17所示的序列。

8、在一個或多個實施方案中，抗pd-1重鏈抗體是嵌合抗體，優(yōu)選人源化抗體。

9、在一個或多個實施方案中，抗ctla-4重鏈抗體是嵌合抗體，優(yōu)選人源化抗體。

10、在一個或多個實施方案中，所述雙特異性抗體，還含有：fc區(qū)；優(yōu)選地，fc區(qū)為igg1、igg2、igg3或igg4的fc區(qū)。

11、在一個或多個實施方案中，所述fc區(qū)還包括突變，并且突變后，雙特異性抗體與fcγriiia和/或c1q的親和力常數(shù)相比突變前降低。

12、在一個或多個實施方案中，所述fc區(qū)為igg1的fc區(qū)，且按照eu編號系統(tǒng)，所述fc區(qū)具有選自如下一種或多種突變：l234a、l235a、g237a；或fc區(qū)為igg4的fc區(qū)，且按照eu編號系統(tǒng)，所述fc區(qū)具有選自如下一種或多種突變：

13、s228p、e233p、f234v、l235a、d254a、l309v、r409k。

14、編碼結合ctla4和pd-1的雙功能抗體的多核苷酸，所述雙功能抗體含有seq?idno:46第21-284位所示的氨基酸序列或seq?id?no:47第19-282位所示的氨基酸序列。

15、在具體的實施例中，所述多核苷酸可以是mrna，sarna中的任一種。

16、所述mrna即信使rna，中文譯名“信使核糖核酸”，是由dna的一條鏈作為模板轉錄而來的、攜帶遺傳信息能指導蛋白質合成的一類單鏈核糖核酸。

17、所述sarna即自復制mrna，是在傳統(tǒng)mrna編碼蛋白基因的基礎上，增加了來源于甲病毒(alphavirus)的編碼復制酶基因，sarna在導入細胞后，即可啟動rna復制。

18、應理解，本發(fā)明中多核苷酸中的核苷的種類可為常規(guī)的核苷，例如腺嘌呤核苷、尿嘧啶核苷、胞嘧啶核苷以及鳥嘌呤核苷；也可為其相應的修飾核苷酸或者氧化后核苷酸以及其他常見的非常規(guī)核苷。修飾核苷酸例如可選自7-甲基-鳥嘌呤核苷、2’-氧甲基-鳥嘌呤核苷、假尿嘧啶核苷、1-甲基-假尿嘧啶核苷、5-甲基-胞嘧啶核苷、4-乙酰基-胞嘧啶核苷以及6-甲基-腺嘌呤核苷中的一種或多種。

19、一些實施方式中，所述多核苷酸可通過體外轉錄(ivt)的方式制備。

20、在具體的實施方式中，所述藥物制劑的遞送系統(tǒng)包含類脂質、脂質體(liposome)、陽離子脂質體、脂質納米顆粒(lipid?nanoparticles，lnp)、聚合化合物、肽、蛋白質、細胞、納米顆粒模擬物、納米管或綴合物中任一項，優(yōu)選為脂質體、陽離子脂質體、脂質納米顆粒。

21、脂質納米粒(lipid?nanoparticle，lnp)是一種將核酸物質遞送至細胞的納米載體，含有可電離脂質，輔助脂質分子，膽固醇或膽固醇衍生物，聚合物綴合的脂質分子。例如如pct/cn2022/118198所述。在此將pct/cn2022/118198的全文以引用形式納入本文。

22、陽離子脂質體通常包含(1)陽離子脂質、以及(2)輔助脂質和膽固醇中的一者或兩者。可選地，陽離子脂質體還可包括聚合物綴合的脂質分子。

23、在一些實施方案中，陽離子脂質體含有dotma、dope和膽固醇，例如如cn109331176b所述。陽離子(帶正電的)脂質體和陰離子(帶負電的)核酸形成“脂質體復合物(lipoplex，lpx)”，lpx可將核酸遞送至細胞內。

24、在具體的實施方案中，所述可電離脂質化合物選自如下中的任一種，

25、

26、

27、各式中，a、b、c、d、e和f各自獨立為0至20的整數(shù)，優(yōu)選為8至16的整數(shù)，優(yōu)選地，a、b、c、d、e和f均為0至20的同一整數(shù)，優(yōu)選為8至16的同一整數(shù)，更優(yōu)選為9到15的同一整數(shù)；優(yōu)選地，所述可電離脂質化合物選自如下中的任一種，

28、

29、此外，所述可電離脂質化合物還可選自1，2-二-o-十八烯基-3-三甲基銨丙烷(dotma)、((4-羥基丁基)氮雜二烷基)雙(己烷-6,1-二基)雙(2-己基癸酸酯)(alc-0315)、8-[(2-羥乙基)[6-氧代-6-(十一烷基氧基)己基]氨基]辛酸1-辛基壬基酯(sm-102)、4-(n,n-二甲基氨基)丁酸(二亞油基)甲酯(dlin-mc3-dma)、2,2-二亞油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧雜環(huán)戊烷(dlin-kc2-dma)、二((z)-壬-2-烯-1-基)9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸酯(lipid?l319)、十七烷-9-基-8-((2-羥乙基)(8-壬氧基)-8-氧代辛基氨基)辛酸酯(lipid?5)、1，2-二油酰基-3-三甲基銨-丙烷(dotap)、1,2-二油醇-3-二甲基氨基-丙烷(dodma)、lipid?a9、lipid?c24、93-o17s、dbamea-o61b、dlin-mc2-mpz中的任一種。

30、在一些實施方案中，所述輔助脂質分子選自二油酰磷脂酰乙醇胺(dope)、棕櫚酰油酰磷脂酰膽堿(popc)、卵磷脂酰膽堿(epc)、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿(dmpc)、二棕櫚酰磷脂酰膽堿(dppc)、二硬脂酰磷脂酰膽堿(dspc)、二花生酰磷脂酰膽堿(dapc)、二山崳酰磷脂酰膽堿(dbpc)、二(二十四酰)磷脂酰膽堿(dlpc)、二油酰磷脂酰膽堿(dopc)、鞘磷脂、神經(jīng)酰胺、二油酰磷脂酰甘油(dopg)、二棕櫚酰磷脂酰甘油(dppg)、磷脂酰乙醇胺(pope)、二油酰-磷脂酰乙醇胺4-(n-馬來酰亞胺甲基)-環(huán)己烷-1-羧酸酯(dope-mal)中的任一種，優(yōu)選為dope或dspc。

31、在一些實施方案中，所述聚合物綴合的脂質分子選自peg2000-dmg(peg2000-二肉豆蔻基甘油、peg2000-dspe(peg2000-磷酸乙醇胺磷脂)、peg2000-dpg(peg2000-二棕櫚酰甘油)、peg2000-dsg(peg2000-二硬脂酰甘油)、peg5000-dmg(peg5000-二肉豆蔻基甘油)、peg5000-dpg(peg5000-二棕櫚酰甘油)、peg5000-dsg(peg5000-二硬脂酰甘油)、peg-cdma(n-[(甲氧基聚(乙二醇)2000)氨基甲酰基]-1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-胺)、peg-c-domg(r-3-[(ω-甲氧基-聚(乙二醇)2000)氨基甲酰基]-1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-胺)、聚乙二醇(peg)-二酰甘油(dag)、peg-二烷氧基丙基(daa)、peg-磷脂質、peg-神經(jīng)酰胺(cer)中的任一種，優(yōu)選為peg2000-dspe或peg2000-dmg。

32、上述脂質體納米顆粒中，所述可電離脂質、輔助脂質分子、膽固醇或膽固醇衍生物、聚合物綴合的脂質分子的摩爾比為60～5：60～5：50～5：10～1，優(yōu)選為40～10：30～10：50～20：8～1。

33、發(fā)明同時提供如上含有多核苷酸的藥物制劑在制備預防和/或治療癌癥的藥物中的應用。

34、優(yōu)選地，所述癌癥是pd-1和/或ctla-4相關癌癥，

35、更優(yōu)選地，所述癌癥選自：黑色素瘤、肺癌、頭頸部癌、腎細胞癌、泌尿道上皮癌、非霍奇金淋巴瘤等、腎腫瘤、前列腺癌、膀胱癌、結腸直腸癌、胃腸道癌、肝癌、非小細胞性肺癌和卵巢癌。