本發(fā)明總體上屬于用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的dna疫苗的領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

1、水產(chǎn)養(yǎng)殖在生產(chǎn)力方面經(jīng)歷了巨大的增長，在1990年至2018年的時(shí)間范圍內(nèi)達(dá)到了>527％。在2018年，水產(chǎn)養(yǎng)殖的貢獻(xiàn)大約占全球水生生物總產(chǎn)量的46％(179m噸)和供人食用的海鮮(魚類、甲殼類動(dòng)物、軟體動(dòng)物和其他水生動(dòng)物，不包括水生哺乳動(dòng)物、爬行動(dòng)物、海藻和其他水生植物)的52％。

2、商業(yè)水產(chǎn)養(yǎng)殖受主要由細(xì)菌、病毒、寄生蟲和(在較小程度上)真菌引起的感染性疾病的影響。細(xì)菌性疾病可造成顯著生物損失，因此造成經(jīng)濟(jì)損失。盡管這些通常可使用抗生素控制，但因?yàn)榧?xì)菌物種(其中一些也為人類病原體)之間的抗性機(jī)制的發(fā)展和轉(zhuǎn)移，不加選擇地使用這些藥物最終會(huì)對(duì)人類健康造成威脅。另外，一些基于滅活病毒的傳統(tǒng)疫苗可能導(dǎo)致不可接受的副作用和/或一些病原體難以在培養(yǎng)物中生長。

3、胰臟疾病(pd)代表了在愛爾蘭、英國和挪威影響海水養(yǎng)殖的大西洋鮭魚(salmosalar)的經(jīng)濟(jì)上重要的病毒性疾病。發(fā)病原因(aetiological?agent)正式命名為鮭魚胰臟疾病病毒(spdv)，但通常被表示為鮭科甲病毒(sav)，部分是由于該病毒也感染其他鮭科物種。已使用含有滅活的spdv完整病毒顆粒的油佐劑疫苗超過十年，以減少pd對(duì)鮭科魚水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)的影響。然而，在一些情況下，使用這些疫苗導(dǎo)致相當(dāng)大的副作用，副作用形式有脊柱變形和周圍肌肉組織的纖維化，從而導(dǎo)致屠宰時(shí)的降級(jí)、生長減少和動(dòng)物福利問題。參見等人,nofima?report?35\2021；和holm等人,aquaculture,526,2020。

4、心肌病綜合癥(cms)為一種炎癥性心臟病，其主要影響?zhàn)B殖的大西洋鮭魚(salmosalar?l.)。該疾病在1985年首次在挪威檢測到并且從那時(shí)起已在養(yǎng)殖和野生大西洋鮭魚中診斷出。cms的致病因子已鑒別為魚心肌炎病毒(pmcv)并且該病毒的分離和表征描述于wo?2011/131600中。迫切地需要控制病毒的方法，但盡管進(jìn)行了充分研究，尚未能有效培養(yǎng)pmcv，或因此基于減毒或滅活病毒生產(chǎn)疫苗。

5、dna疫苗由于它們的穩(wěn)定性和遞送簡單性而成為用于產(chǎn)生抗原特異性免疫反應(yīng)的有吸引力的方法。dna疫苗可容易地以高純度大規(guī)模制備、反復(fù)施用并且相對(duì)于蛋白質(zhì)和其他生物聚合物為高度穩(wěn)定的。

6、在可構(gòu)建的核酸疫苗的多種形式中，環(huán)狀dna質(zhì)粒最簡單。dna疫苗接種涉及用含有編碼抗原的基因(或多個(gè)基因)的環(huán)狀dna質(zhì)粒來進(jìn)行免疫接種。實(shí)際上，注射游離dna(裸dna)刺激對(duì)由基因疫苗編碼的蛋白質(zhì)(抗原)的有效且長期的免疫反應(yīng)。當(dāng)將質(zhì)粒dna注射至個(gè)體中時(shí)，質(zhì)粒由細(xì)胞吸收并且其遺傳信息被翻譯成免疫接種蛋白質(zhì)。這使得宿主免疫系統(tǒng)能夠?qū)乖鸱磻?yīng)。

7、然而，dna疫苗相對(duì)較新穎，并且需要提高這些疫苗的有效性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、在一個(gè)方面，本公開提供了一種包含核酸序列的疫苗，該核酸序列編碼來源于影響魚類的病原體的抗原，該疫苗用于積極地保護(hù)魚類免受所述病原體影響的方法中，所述方法包括以多次注射向所述魚類肌內(nèi)地施用所述疫苗，其中

2、a.將多次中的成員遞送至不同注射部位中；

3、b.所述多次中的每個(gè)成員含有小于有效劑量的所述疫苗；以及

4、c.所述疫苗的總劑量不大于有效劑量；以及

5、d.該多次中的所有成員基本上同時(shí)遞送至所述魚類。

6、還公開了如上所述的疫苗，其中多次中的成員協(xié)同地起作用。

7、根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的疫苗，其中當(dāng)向保持在相同條件下的魚類施用時(shí)，該總劑量提供比以單次注射施用的該有效劑量更快的免疫起始。

8、在根據(jù)本文所述的方法實(shí)施的疫苗的某些方面，所述疫苗的總劑量小于有效劑量。

9、在另一方面，本公開提供了一種包含編碼來源于影響魚類的病原體的抗原的核酸序列的疫苗，該疫苗用于積極地保護(hù)魚類免受該病原體影響的方法中，所述方法包括以多次注射向所述魚類肌內(nèi)施用所述疫苗，其中

10、a.將多次中的成員遞送至不同注射部位中；

11、b.多次中的所有成員基本上同時(shí)遞送至所述魚類，以及其中多次中的成員協(xié)同地起作用，或者其中當(dāng)向保持在相同條件下的魚類施用時(shí)，以該多次注射施用的總劑量提供比以相同配制物的單次注射施用的相同劑量更快的免疫起始。優(yōu)選地，多次中的成員協(xié)同地起作用，或者其中當(dāng)向保持在相同條件下的魚類施用時(shí)，以該多次注射施用的總劑量提供比以相同配制物的單次注射施用的相同劑量更快的免疫起始。

12、優(yōu)選地，該多次具有2、3或4個(gè)成員。可在60秒內(nèi)、或更優(yōu)選地在30秒內(nèi)、或甚至更優(yōu)選地在15秒內(nèi)遞送該多次。

13、還公開了如上文所述的疫苗，其中魚類為鮭科并且病原體選自由以下各項(xiàng)組成的組：鮭科甲病毒(salmonid?alphavirus，sav)、病毒性出血性敗血癥病毒(viralhemorrhagic?septicemia?virus，vhsv)、感染性造血壞死病毒(infectioushematopoietic?necrosis?virus，inhv)、感染性胰臟壞死病毒(infectious?pancreaticnecrosis?virus，ipnv)、感染性鮭魚貧血(infectious?salmon?anaemia，isa)病毒(isav)、魚心肌炎病毒(piscine?myocarditis?virus，pmcv)和魚正呼腸孤病毒(prv)。

14、在上文所述的疫苗的某些實(shí)施例中，病原體為鮭科甲病毒并且抗原包含seq?idno:1或seq?id?no:2。在某些實(shí)施例中，病原體為pmcv并且抗原包含seq?id?no:3或seq?idno:4。在某些實(shí)施例中，疫苗包含針對(duì)鮭科甲病毒和針對(duì)pmcv的抗原。

15、還公開了如上文所述的疫苗，其中魚類為羅非魚并且病原體選自由以下各項(xiàng)組成的組：病毒性神經(jīng)壞死病毒(nnv)、感染性脾臟和腎臟壞死病毒(isknv)和羅非魚湖病毒。

16、還公開了如上文所述的疫苗，其中編碼所述抗原的核酸序列是通過異源載體，諸如質(zhì)粒載體或病毒載體遞送。

17、還公開了如上文所述的疫苗，其中異源載體進(jìn)一步包含編碼分子免疫調(diào)節(jié)劑的核酸序列。在某些實(shí)施例中，分子免疫調(diào)節(jié)劑為干擾素。

18、還公開了如上文所述的疫苗，其進(jìn)一步包含佐劑。

19、還公開了如上文所述的疫苗，其中所述疫苗包含用于將所述基于核酸的疫苗轉(zhuǎn)運(yùn)穿過細(xì)胞膜的裝置。在某些實(shí)施例中，該裝置包含脂質(zhì)包衣。

20、在另一方面，本公開提供了一種制品，其包含：

21、a)容納根據(jù)權(quán)利要求1至20中任一項(xiàng)所述的疫苗的儲(chǔ)集器，所述儲(chǔ)集器可操作地連接至多個(gè)針，所述多個(gè)針被配置成將多次注射中的成員遞送至不同注射部位中；以及

22、b)用于向所述儲(chǔ)集器施加壓力從而推動(dòng)疫苗通過該多個(gè)針的裝置。

23、在又另一方面，本公開提供了制品，其包含：

24、a.多個(gè)儲(chǔ)集器，每個(gè)儲(chǔ)集器容納根據(jù)權(quán)利要求1至21中任一項(xiàng)所述的疫苗的多次注射中的成員，其中每個(gè)儲(chǔ)集器可操作地連接至針，其中連接至不同儲(chǔ)集器的針被配置成將該多次注射中的成員遞送至不同注射部位中；

25、b.一個(gè)或多個(gè)裝置，其用于向所述儲(chǔ)集器施加壓力從而推動(dòng)疫苗通過多個(gè)針。

26、在本發(fā)明的該方面和前述方面中，裝置可源自多個(gè)來源，包括但不限于氣動(dòng)源、液壓源、電源或機(jī)械源。

27、在又另一方面，本公開提供了一種向魚類施用有效劑量的基于核酸的疫苗的方法，該方法包括將所述有效劑量的多個(gè)部分遞送至所述魚類的不同注射部位中，其中所述多個(gè)部分基本上同時(shí)注射。

28、在某些實(shí)施例中，在本文公開的方法中，該多個(gè)具有2、3或4個(gè)成員并且可在60秒、或30秒、或15秒內(nèi)遞送。在某一實(shí)施例中，該多個(gè)具有2個(gè)成員并且在15秒或更短的時(shí)間內(nèi)遞送。在其他實(shí)施例中，該多個(gè)具有三個(gè)成員并且在15秒或更短的時(shí)間內(nèi)遞送。

29、在該方面中所述的方法的某些實(shí)施例中，魚類為鮭科并且病原體選自由以下各項(xiàng)組成的組：鮭科甲病毒(sav)、病毒性出血性敗血癥病毒(vhsv)、感染性造血壞死病毒(inhv)、感染性胰臟壞死病毒(ipnv)、感染性鮭魚貧血(isa)病毒(isav)、魚心肌炎病毒(pmcv)和魚正呼腸孤病毒(prv)。

30、在本發(fā)明的該方面的方法的某些實(shí)施例中，病原體為鮭科甲病毒并且抗原包含seq?id?no:1或seq?id?no:2。在某些實(shí)施例中，病原體為pmcv并且抗原包含seq?id?no:3或seq?id?no:4。

31、還公開了根據(jù)本發(fā)明的該方面的方法，其中魚類為羅非魚并且病原體選自由以下各項(xiàng)組成的組：病毒性神經(jīng)壞死病毒(nnv)、感染性脾臟和腎臟壞死病毒(isknv)和羅非魚湖病毒。

32、在根據(jù)本發(fā)明的該方面的方法的某些實(shí)施例中，編碼所述抗原的所述核酸序列是通過異源載體遞送。在某些實(shí)施例中，異源載體為質(zhì)粒載體。在其他實(shí)施例中，異源載體為病毒載體。

33、還公開了根據(jù)本發(fā)明的該方面的方法，其中異源載體進(jìn)一步包含編碼分子免疫調(diào)節(jié)劑的核酸序列。在某些實(shí)施例中，分子免疫調(diào)節(jié)劑為干擾素。

34、還公開了根據(jù)本發(fā)明的該方面的方法，其中疫苗進(jìn)一步包含佐劑。

35、還公開了根據(jù)本發(fā)明的該方面的方法，其中所述疫苗包含用于將所述基于核酸的疫苗轉(zhuǎn)運(yùn)穿過細(xì)胞膜的裝置。在某些實(shí)施例中，該裝置包含脂質(zhì)包衣。

36、還公開了根據(jù)本發(fā)明的該方面的方法，其中多個(gè)部分的成員協(xié)同地起作用。

37、還公開了根據(jù)本發(fā)明的該方面的方法，其中總劑量提供比以單次注射施用的有效劑量更快的免疫起始。