本發明屬于生態環境評估研究，尤其涉及一種基于斑馬魚的加替沙星水生態毒性與風險評估方法及應用。

背景技術：

0、技術背景

1、加替沙星(gatifloxacin，gtfx)是第四代氟喹諾酮類抗生素，因與嚴重不良反應(如低血糖和高血糖)相關，已于2006年在加拿大和美國市場被撤回。然而，gtfx因其卓越的抗菌性能，仍在一些發展中國家使用。研究表明，氟喹諾酮類藥物在廢水處理中未被完全去除，導致這些物質在地表水中積累。此外，即使經過光解處理，gtfx對大腸桿菌的抑制作用仍然顯著，表明其降解產物可能仍對水環境中的微生物群落產生影響。這種持續的環境存在增加了人們對其生態毒理學的關注，尤其是對水生生物的潛在危害。

2、斑馬魚因其與人類具有遺傳同源性、發育迅速以及透明胚胎易于觀察等特性，成為環境毒理學研究的理想模型。斑馬魚的肝臟在24hpf(hours?post?fertilization)開始發育，72h后具備功能，使其成為研究肝毒性的理想對象。因此，斑馬魚已被廣泛用于評估農藥、納米顆粒和藥品等物質的毒性。氟喹諾酮類抗生素在斑馬魚體內引起的神經毒性和生殖系統損傷也引起了科學家的關注。然而，先前的研究主要集中在gtfx對哺乳動物和藻類的毒性，對水生脊椎動物的影響信息仍然非常有限。

技術實現思路

1、針對上述問題，本發明提供一種基于斑馬魚的加替沙星水生態毒性與風險評估方法及應用，旨在通過對斑馬魚肝臟形態學、組織病理學變化、氧化應激反應和分子機制研究，揭示gtfx對水生動物誘導的肝毒性之間的關聯性，為制定gtfx的水環境質量標準和風險評估提供重要信息，為水環境中微量藥物的毒性監測提供了一種多尺度評價方法，有助于更好地保護水生態和公共衛生安全。

2、本發明是這樣實現的：

3、一種基于斑馬魚的加替沙星水生態毒性與風險評估方法，所述方法步驟如下：

4、s1，建立斑馬魚實驗模型，每組實驗使用30尾受精后3天(3dpf)的仔魚，自然成對交配繁殖方式；

5、s2，毒性濃度評估，采用加替沙星(gtfx)梯度濃度0.5-5.0mg/ml暴露斑馬魚，通過濃度-死亡率曲線計算最大非致死濃度mnlc和10％致死濃度lc10；

6、s3，肝毒性指標評估，對斑馬魚的肝臟面積、肝臟平均不透光度和卵黃囊吸收延遲面積進行分析統計，以評估gtfx暴露對斑馬魚肝臟的影響；

7、s4，對染色后的斑馬魚肝臟切片進行組織病理學分析；

8、s5，氧化應激檢測，熒光探針檢測活性氧(ros)水平，評估gtfx是否誘發斑馬魚的氧化應激反應；

9、s6，通過qpcr檢測ppar-γ、cyp1a1和cyp1b1基因的相對表達量；

10、s7，數據分析。

11、進一步的，所述s1的斑馬魚養殖用水質參數為：每1l反滲透水中加入200mg速溶海鹽，電導率為480～510μs/cm；ph為6.9-7.2；硬度為53.7-1.6mg/l?caco3，28℃恒溫。

12、進一步的，所述s2評估gtfx對斑馬魚肝臟的影響方法是：隨機選取210尾3dpf斑馬魚，分配至六孔板中，每孔放置30尾斑馬魚，分別給予0.5、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0mg/ml的gtfx溶液，每孔容量為3ml的gtfx溶液，同時設置正常對照組，給藥處理48h后觀察記錄各實驗組斑馬魚死亡情況，使用origin?8.0繪制濃度-死亡率效應曲線。

13、進一步的，所述步驟s3是隨機選取150尾3dpf斑馬魚，分配至六孔板中，每孔放置30尾斑馬魚，分別給予1/9mnlc、1/3mnlc、mnlc和lc10濃度的gtfx水溶液，同時設置正常對照組，每孔容量為3ml，經過48h的gtfx處理后，從每個實驗組隨機選取10尾斑馬魚，在解剖顯微鏡下拍照并采集數據。

14、進一步的，所述s4對染色后的斑馬魚肝臟切片進行組織病理學分析方法是：隨機選取60尾3dpf斑馬魚分配至六孔板中，每孔放置30尾斑馬魚，給予lc10濃度的gtfx水溶液處理，同時設置正常對照組，每孔容量為3ml，經過48h的gtfx處理后，將斑馬魚用4％多聚甲醛固定后，將斑馬魚轉移至70％乙醇中，依次進行脫水、包埋、切片、染色和封片處理，對染色后的斑馬魚切片進行組織病理學分析。

15、進一步的，所述s5具體是：隨機選取150尾3dpf斑馬魚，分配至六孔板中，每孔處理30尾斑馬魚，分別給予1/9mnlc、1/3mnlc、mnlc和lc10濃度的gtfx水溶液，同時設置正常對照組，每孔容量為3ml，經過48h的處理后，加入活性氧ros檢測試劑cm-h2dcfda，將斑馬魚置于28℃的培養箱中繼續孵育1h后，對各實驗組進行熒光(f)分析，每個實驗組隨機選取10尾斑馬魚的熒光值進行統計學處理，同時計算ros水平相對變化率：

16、

17、式中，fsample表示實驗組相對熒光值(a.u)，fcontrol表示對照組相對熒光值(a.u)，ros(％)表示活性氧的相對變化率。

18、進一步的，所述s5用于測試的斑馬魚為隨機選取450尾3dpf的斑馬魚，分配至六孔板中，每孔30尾，分別給予1/9mnlc、1/3mnlc、mnlc和lc10濃度的gtfx水溶液，同時設置正常對照組，每孔容量為3ml，28℃孵育48h后，提取2μg的斑馬魚總rna，合成20μl的cdna，并置于-20℃保存備用。

19、本發明另一方面是采用上述一項所述的基于斑馬魚的加替沙星水生態毒性與風險評估方法，用于判斷和評價藥物殘留對水生態的影響。

20、本發明的有益效果是：本發明方法以斑馬魚為實驗對象，綜合了形態學、組織學、氧化應激反應和分子機制研究，評估加替沙星在水生環境中的生態毒性影響，為水環境中微量藥物的毒性監測提供了一種多尺度評價方法體系，為未來水體污染治理和生態保護策略制定提供了實用參考，有助于更好地保護水生態環境和公共衛生安全。同時，為未來探究gtfx在更低、與環境相關的濃度下的長期效應奠定了基礎，可為水環境中常見藥物暴露相關的更廣泛生態風險提供借鑒。

21、以下結合附圖說明和具體實施方式對本發明做進一步闡釋。

技術特征：

1.一種基于斑馬魚的加替沙星水生態毒性與風險評估方法，其特征在于，所述方法步驟如下：

2.根據權利要求1所述的基于斑馬魚的加替沙星水生態毒性與風險評估方法，其特征在于，所述s1的斑馬魚養殖用水質參數為：每1l反滲透水中加入200mg速溶海鹽，電導率為480～510μs/cm；ph為6.9-7.2；硬度為53.7-1.6mg/lcaco3，28℃恒溫。

3.根據權利要求1所述的基于斑馬魚的加替沙星水生態毒性與風險評估方法，其特征在于，所述s2評估gtfx對斑馬魚肝臟的影響方法是：隨機選取210尾3dpf斑馬魚，分配至六孔板中，每孔放置30尾斑馬魚，分別給予0.5、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0mg/ml的gtfx溶液，每孔容量為3ml的gtfx溶液，同時設置正常對照組，給藥處理48h后觀察記錄各實驗組斑馬魚死亡情況，使用origin?8.0繪制濃度-死亡率效應曲線。

4.根據權利要求1所述的基于斑馬魚的加替沙星水生態毒性與風險評估方法，其特征在于，所述步驟s3是隨機選取150尾3dpf斑馬魚，分配至六孔板中，每孔放置30尾斑馬魚，分別給予1/9mnlc、1/3mnlc、mnlc和lc10濃度的gtfx水溶液，同時設置正常對照組，每孔容量為3ml，經過48h的gtfx處理后，從每個實驗組隨機選取10尾斑馬魚，在解剖顯微鏡下拍照并采集數據。

5.根據權利要求1所述的基于斑馬魚的加替沙星水生態毒性與風險評估方法，其特征在于，所述s4對染色后的斑馬魚肝臟切片進行組織病理學分析方法是：隨機選取60尾3dpf斑馬魚分配至六孔板中，每孔放置30尾斑馬魚，給予lc10濃度的gtfx水溶液處理，同時設置正常對照組，每孔容量為3ml，經過48h的gtfx處理后，將斑馬魚用4％多聚甲醛固定后，將斑馬魚轉移至70％乙醇中，依次進行脫水、包埋、切片、染色和封片處理，對染色后的斑馬魚切片進行組織病理學分析。

6.根據權利要求1所述的基于斑馬魚的加替沙星水生態毒性與風險評估方法，其特征在于，所述s5具體是：隨機選取150尾3dpf斑馬魚，分配至六孔板中，每孔處理30尾斑馬魚，分別給予1/9mnlc、1/3mnlc、mnlc和lc10濃度的gtfx水溶液，同時設置正常對照組，每孔容量為3ml，經過48h的處理后，加入活性氧ros檢測試劑cm-h2dcfda，將斑馬魚置于28℃的培養箱中繼續孵育1h后，對各實驗組進行熒光(f)分析，每個實驗組隨機選取10尾斑馬魚的熒光值進行統計學處理，同時計算ros水平相對變化率：

7.根據權利要求1所述的基于斑馬魚的加替沙星水生態毒性與風險評估方法，其特征在于，所述s5用于測試的斑馬魚為隨機選取450尾3dpf的斑馬魚，分配至六孔板中，每孔30尾，分別給予1/9mnlc、1/3mnlc、mnlc和lc10濃度的gtfx水溶液，同時設置正常對照組，每孔容量為3ml，28℃孵育48h后，提取2μg的斑馬魚總rna，合成20μl的cdna，并置于-20℃保存備用。

8.采用權利要求1-7任一項所述的基于斑馬魚的加替沙星水生態毒性與風險評估方法，用于判斷和評價藥物殘留對水生態的影響。

技術總結
本發明公開了一種基于斑馬魚的加替沙星水生態毒性與風險評估方法及應用，所述方法步驟包括：S1建立斑馬魚實驗模型，選擇受精后3天的斑馬魚仔魚，依據標準化的養殖程序；S2，毒性評估，計算GTFX的最大非致死濃度（MNLC）和10%致死濃度（LC<subgt;10</subgt;）；S3，肝毒性指標評估；S4，組織病理學分析；S5，氧化應激反應狀態檢測；S6，通過qPCR檢測PPAR?γ、CYP1A1和CYP1B1基因的相對表達量進行分子機制探索；S7，數據分析。本發明方法綜合了形態學、組織學、氧化應激反應和分子機制研究，為水環境中微量藥物的毒性監測提供了一種多尺度評價體系，有助于更好地保護水生態環境和公共衛生安全。

技術研發人員：沈榮,蘭蓉,王瑞麗
受保護的技術使用者：北京電子科技職業學院
技術研發日：
技術公布日：2025/4/24