本技術(shù)屬于裸質(zhì)粒基因治療藥物領(lǐng)域，具體涉及一種大腦外泌體靶向載藥系統(tǒng)及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、amkp即amp依賴的蛋白激酶，是生物能量代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵分子，是研究糖尿病及其他代謝相關(guān)疾病的核心。它表達(dá)于各種代謝相關(guān)的器官中，能被機(jī)體各種刺激激活，包括細(xì)胞壓力、運(yùn)動(dòng)和很多激素及能影響細(xì)胞代謝的物質(zhì)。最近的研究表明(milbank?e,draganonrv,gonzález-garcía?i,et?al.small?extracellular?vesicle-mediated?targeting?ofhypothalamic?ampkαcorrects?obesity?through?bat?activation.nat?metab.2021；3(10):1415-1431.doi:10.1038/s42255-021-00467-8)，下丘腦中ampk的調(diào)節(jié)是調(diào)節(jié)能量平衡的典型機(jī)制。ampkα是人類基因表達(dá)ampk的一種亞型，抑制了下丘腦中ampkα的表達(dá)后，會(huì)導(dǎo)致交感神經(jīng)系統(tǒng)(sns)活性的增加，從而刺激棕色脂肪組織(bat)產(chǎn)熱，增加能量消耗，隨后導(dǎo)致與進(jìn)食無關(guān)的體重減輕。

2、rna干擾(rnai)可以特異性靶向mrna并在其生物發(fā)生前調(diào)節(jié)其蛋白質(zhì)的表達(dá)，被認(rèn)為是一種很有前途的治療工具來操縱疾病相關(guān)基因的表達(dá)。rnai治療遇到了許多問題，在臨床轉(zhuǎn)化過程中遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于預(yù)期。rnai治療的發(fā)展經(jīng)歷了兩個(gè)主要階段。在第一階段，合成小干擾rna(sirnas)或化學(xué)修飾的穩(wěn)定sirnas，并直接注射進(jìn)行系統(tǒng)傳遞；然而，這些sirnas不能有效地通過生物屏障到達(dá)靶基因。第二階段，發(fā)明了各種傳遞載體(如，脂質(zhì)納米顆粒，陽離子聚合物和病毒)或偶聯(lián)配體(如，三觸角乙酰半乳糖胺)，以提高sirna在體內(nèi)的傳遞效率。在以往的研究中(fu?z,zhang?x,zhou?x,et?al.in?vivo?self-assembledsmall?rnas?as?a?new?generation?of?rnai?therapeutics.cell?res.2021；31(6):631-648.doi:10.1038/s41422-021-00491-z)，設(shè)計(jì)了可組合和可編程的質(zhì)粒，利用肝臟作為組織底盤，指導(dǎo)外源性sirnas的自組裝成分泌性外泌體，并促進(jìn)自組裝sirnas在體內(nèi)的系統(tǒng)可組合和可編程的遺傳電路，利用肝臟作為組織底盤，指導(dǎo)外源性sirnas的自組裝成分泌性外泌體，并促進(jìn)自組裝sirnas在體內(nèi)的傳遞。然而，在改造之前，由于血腦屏障，肝臟生產(chǎn)的外泌體在體循環(huán)中系統(tǒng)的傳遞，無法進(jìn)入大腦，且不含有ampkα-sirna，無法達(dá)到減肥的效果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過將質(zhì)粒cmv-lamp2b-gfp-sirna中的lamp2b-gfp-sirna基因序列替換為rvg-lamp2b-ampkα-sirna基因序列，rvg-lamp2b-ampkα-sirna中的rvg基因是狂犬病病毒肽基因，具體序列為tacaccatttggatgcccgagaatccgagaccagggacaccttgtgacatt?tttaccaatagcagagggaagagagcatccaacggg，狂犬病病毒肽(rvg)可以與外泌體膜蛋白(lamp2b)融合，使得肝臟生產(chǎn)的外泌體膜表面攜帶狂犬病病毒肽(rvg)，通過血腦屏障到達(dá)大腦，sirna呈遞的效率也隨之增高。

2、本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

3、本發(fā)明第一方面，提供一種大腦外泌體靶向載藥系統(tǒng)，所述載藥系統(tǒng)包括質(zhì)粒cmv-rvg-sira；

4、其中，質(zhì)粒cmv-rvg-sira包括rvg-lamp2b-ampkα-sirna。

5、質(zhì)粒(cmv-rvg-sira)在小鼠肝臟產(chǎn)生的外泌體膜表面的lamp2b蛋白與rvg多肽融合；該外泌體通過血液循環(huán)可以穿過血腦屏障到達(dá)大腦。本質(zhì)粒在外泌體中的表達(dá)產(chǎn)物是ampkα-sirna，可以與小鼠下丘腦神經(jīng)細(xì)胞中的ampkα-mrna互補(bǔ)配對(duì)，使ampkα-mrna失效。

6、根據(jù)本技術(shù)的具體實(shí)施方式，所述質(zhì)粒cmv-rvg-sira的制備方法，包括以下步驟：

7、將質(zhì)粒cmv-lamp2b-gfp-sirna上的lamp2b-gfp-sirna基因序列替換為rvg-lamp2b-ampkα-sirna基因序列；即得到質(zhì)粒cmv-rvg-sira；

8、其中，lamp2b-gfp-sirna基因的堿基序列如seq?id?no.1所示，具體為：5’-tccggaggtgcagaatgggagatgaatttcacaataacatatgaaacta?caaaccaaaccaataaaactataaccattgcagtacctgacaaggcgacacacgatggaagcagttgtggggatgaccggaatagtgccaaaataatgatacaatttggattcgctgtctcttgggctgtgaattttaccaaggaagcatctcattattcaattcatgacatcgtgctttcctacaacactagtgatagcacagtatttcctggtgctgtagctaaaggagttcatactgttaaaaatcctgagaatttcaaagttccattggatgtcatctttaagtgcaatagtgttttaacttacaacctgactcctgtcgttcagaaatattggggtattcacctgcaagcttttgtccaaaatggtacagtgagtaaaaatgaacaagtgtgtgaagaagaccaaactcccaccactgtggcacccatcattcacaccactgccccgtcgactacaactacactcactccaacttcaacacccactccaactccaactccaactccaaccgttggaaactacagcattagaaatggcaatactacctgtctgctggctaccatggggctgcagctgaacatcactgaggagaaggtgcctttcatttttaacatcaaccctgccacaaccaacttcaccggcagctgtcaacctcaaagtgctcaacttaggctgaacaacagccaaattaagtatcttgactttatctttgctgtgaaaaatgaaaaacggttctatctgaaggaagtgaatgtctacatgtatttggctaatggctcagctttcaacatttccaacaagaaccttagcttctgggatgcccctctgggaagttcttatatgtgcaacaaagagcaggtgctttctgtgtctagagcgtttcagatcaacacctttaacctaaaggtgcaaccttttaatgtgacaaaaggacagtattctacagcccaggagtgttcgctggatgatgacaccattctaataccaattatagttggtgctggtctttcaggcttgattatcgttatagtgattgcttacctaattggcagaagaaagacctatgctggatatcagactctgtaacactaagctaagcacttcgtggccgtcgatcgtttaaagggaggtagtgagtcgaccagtggatcctggaggcttgctgaaggctgtatgctgaattctgttgcttctcttaattcctgttttggccactgactgacaggaattaagaagcaacacaccggtcaggacacaaggcctgttactagcactcacatggaacaaatggccc-3’。

9、rvg-lamp2b-ampkα-sirna基因的堿基序列如seq?id?no.2所示，具體為5’-tacaccatttggatgcccgagaatccgagaccagggacaccttgtgac?atttttaccaatagcagagggaagagagcatccaacgggtccggaggtgcagaatgggagatgaatttcacaataacatatgaaactacaaaccaaaccaataaaactataaccattgcagtacctgacaaggcgacacacgatggaagcagttgtggggatgaccggaatagtgccaaaataatgatacaatttggattcgctgtctcttgggctgtgaattttaccaaggaagcatctcattattcaattcatgacatcgtgctttcctacaacactagtgatagcacagtatttcctggtgctgtagctaaaggagttcatactgttaaaaatcctgagaatttcaaagttccattggatgtcatctttaagtgcaatagtgttttaacttacaacctgactcctgtcgttcagaaatattggggtattcacctgcaagcttttgtccaaaatggtacagtgagtaaaaatgaacaagtgtgtgaagaagaccaaactcccaccactgtggcacccatcattcacaccactgccccgtcgactacaactacactcactccaacttcaacacccactccaactccaactccaactccaaccgttggaaactacagcattagaaatggcaatactacctgtctgctggctaccatggggctgcagctgaacatcactgaggagaaggtgcctttcatttttaacatcaaccctgccacaaccaacttcaccggcagctgtcaacctcaaagtgctcaacttaggctgaacaacagccaaattaagtatcttgactttatctttgctgtgaaaaatgaaaaacggttctatctgaaggaagtgaatgtctacatgtatttggctaatggctcagctttcaacatttccaacaagaaccttagcttctgggatgcccctctgggaagttcttatatgtgcaacaaagagcaggtgctttctgtgtctagagcgtttcagatcaacacctttaacctaaaggtgcaaccttttaatgtgacaaaaggacagtattctacagcccaggagtgttcgctggatgatgacaccattctaataccaattatagttggtgctggtctttcaggcttgattatcgttatagtgattgcttacctaattggcagaagaaagacctatgctggatatcagactctgtaacactaagctaagcacttcgtggccgtcgatcgtttaaagggaggtagtgagtcgaccagtggatcctggaggcttgctgaaggctgtatgctgaattcaattcgcaagatcgatagttgctgatggttttggccactgactgaccatcagcctatcgatcttgcaaccggtcaggacacaaggcctgttactagcactcacatggaacaaatggccc-3’。

10、本技術(shù)的第二方面，提供一種靶向大腦外泌體的藥物，采用上述大腦外泌體靶向載藥系統(tǒng)。

11、根據(jù)本技術(shù)的具體實(shí)施方式，通過尾靜脈注射給藥。

12、根據(jù)本技術(shù)的具體實(shí)施方式，按照小鼠體重，注射量為1-5mg/kg，1-3天注射一次。

13、本技術(shù)的第三方面，提供一種治療肥胖的藥物，其特征在于，采用權(quán)利要求1-3所述的大腦外泌體靶向載藥系統(tǒng)。

14、根據(jù)本技術(shù)的具體實(shí)施方式，通過尾靜脈注射給藥。

15、根據(jù)本技術(shù)的具體實(shí)施方式，按照小鼠體重，注射量為1.5-2.5mg/kg，1-3天注射一次。

16、本技術(shù)的第四方面，保護(hù)質(zhì)粒cmv-rvg-sira在制備靶向大腦外泌體的藥物上的應(yīng)用。

17、本技術(shù)的第五方面，保護(hù)質(zhì)粒cmv-rvg-sira在制備治療肥胖的藥物上的應(yīng)用。

18、本發(fā)明的有益效果：

19、(1)本發(fā)明在原質(zhì)粒產(chǎn)生的外泌體膜上添加了可以靶向大腦的狂犬病病毒肽。

20、(2)本發(fā)明改變了以往有創(chuàng)的外泌體給藥方式，僅通過尾靜脈注射給藥。

21、(3)本發(fā)明可以有效的減少肥胖小鼠的體重，改善其體脂率和糖尿病情況。