本發明屬于生物醫藥，具體涉及一種共載產納米金益生菌和姜黃素白蛋白納米粒的海藻酸鈉微球及其制備和應用。

背景技術：

1、炎癥性腸病(inflammatorybowel?disease，ibd)包括克羅恩病及潰瘍性結腸炎，是一種慢性和復發性胃腸道炎癥性疾病。已有研究報道，ibd的病因及發病機制與腸道菌群高度失調及活性氧(reactive?oxygen?species,ros)的升高有關。目前臨床藥物治療面臨難以精準炎癥腸道靶向、藥效有限等問題，且長期用藥會給患者帶來嚴重副作用，因此通過靶向清除ros與調節腸道菌群平衡相結合的策略，恢復健康的腸道微環境，有望從根本上治療炎癥性腸病。

2、近年來，益生菌成為炎癥性腸病的一種新型治療方法。大腸桿菌nissle?1917是一種遺傳操作簡單的益生菌，具有良好的生物安全性，是構建工程菌的首選底盤。大腸桿菌nissle?1917具有益生菌的一般特征，能夠通過維持腸道黏膜屏障、分泌抗菌化合物、激活免疫系統等多種方式改善腸道功能，對腸道黏膜屏障具有保護和修護功能，被應用于炎癥性腸病的治療。然而，單一的益生菌治療因其無法抵抗胃腸道環境、定植能力差及滯留時間短等問題而限制其治療效果。

3、金納米顆粒(gold?nanoparticles，aunps)是指尺寸在納米級別，通常是指小于100nm的金粒子。由于其形狀和尺寸可調、易于合成和表面改性、優異的光學特性和良好的生物相容性，在生物醫學領域中得到了廣泛的應用。同時，研究表明aunps具有多種酶活性，包括過氧化物酶、超氧化物歧化酶和葡萄糖氧化酶等，因此具有良好的消除活性氧能力，可用于炎癥性腸病的治療。aunps傳統的制備方法主要有化學合成法、物理合成法等。相比于上述方法，金納米顆粒的生物合成法具有在室溫下易于還原、環保、低成本、無毒等優點，正受到廣泛關注。其中，利用大腸桿菌nissle?1917合成aunps具有制備流程簡單、環境友好和生物安全性好的特點。

4、姜黃素是一種從姜黃的根莖提取出來的一種天然多酚類物質，具有抗炎、抗氧化及抗癌等功能。研究證明姜黃素對于改善炎癥性腸病有明顯的效果，但其水溶性差、吸收率低及生物利用度差等缺點限制了其在臨床中的應用。人血清白蛋白因其具有良好的生物安全性、豐富的基團且較高的穩定性，被廣泛用作難溶性藥物的載體。近年來，研究表明白蛋白作為納米載體，能夠與疏水性藥物形成納米復合物，減少藥物毒性，增加藥物生物利用度及提高藥物靶向性。

5、海藻酸鈉微球是指以海藻酸鈉為基材制成的一種微球材料。海藻酸鈉又稱褐藻酸鈉，是一種天然的多糖，因其無毒、可生物降解，具有良好的生物相容性和ph敏感性，被廣泛用于生物醫藥領域。此外，海藻酸鈉微球具有高藥物載量的特點，還可以控制納米顆粒在腸道中的釋放，起到緩釋作用，并且因其表面帶有負電荷利于其在炎癥部位的富集，因此常作為口服藥物遞送系統用于炎癥性腸病治療。

6、本發明首先利用基因工程方法改造益生菌大腸桿菌nissle?1917合成納米金，同時利用自組裝的方式制備姜黃素白蛋白納米粒，最后利用高壓靜電的方法制備共載產納米金益生菌和姜黃素白蛋白納米粒的海藻酸鈉微球。該微球既能通過口服靶向腸道炎癥部位，又能通過納米金清除活性氧調節腸道氧化還原穩態，還可以通過納米藥物制劑提高姜黃素的生物利用度，以及補充益生菌調節腸道菌群平衡，有效治療炎癥性腸病。

技術實現思路

1、鑒于此，本發明提出一種共載產納米金益生菌和姜黃素白蛋白納米粒的海藻酸鈉微球及其制備和應用。

2、為實現上述目的，本發明采用以下技術方案：

3、本發明的第一方面提供了一種共載產納米金益生菌和姜黃素白蛋白納米粒的海藻酸鈉微球的制備方法，按以下步驟在無菌條件下進行：

4、s1：將人金屬硫蛋白1e基因連接至pet-28a質粒上，得重組質粒；將所得重組質粒通過熱激法轉化至大腸桿菌nissle?1917中，得工程化益生菌；將所得工程化益生菌的單菌落接種于含50mg/ml卡那霉素的lb液體培養基中，37℃、200rpm培養至od600＝0.6后，添加iptg，在18℃、200rpm誘導14h，得誘導產物；將所得誘導產物離心，棄上清，收集沉淀用無菌水洗滌，將洗滌后的沉淀重懸于50ml氯金酸水溶液中，37℃靜置培養3～5h，然后離心，棄上清，收集沉淀用無菌水洗滌，得產納米金益生菌；

5、s2：將人血清白蛋白溶解于無菌水中得人血清白蛋白溶液，將姜黃素溶解于無水乙醇中得姜黃素溶液；將所得人血清白蛋白溶液的ph調節至8.0，然后在攪拌狀態下將所得姜黃素溶液以一定的滴加速度滴入到其中，繼續攪拌4h，然后添加戊二醛水溶液，繼續攪拌20h，離心，棄上清，收集沉淀，得姜黃素白蛋白納米粒；

6、s3：將產納米金益生菌和姜黃素白蛋白納米粒在無菌水中混合，得混合水溶液1；將所得混合水溶液1和海藻酸鈉水溶液攪拌混合均勻，得混合水溶液2；將所得混合水溶液2加入一次性注射器，使用醫用21g平頭針頭，在注射器針頭上面接上電極，針頭為正極，加載電壓，通過微量注射泵將混合水溶液2以一定的速率滴加到cacl2水溶液中以進行交聯反應，針頭與cacl2水溶液液面保持一定距離，得共載產納米金益生菌和姜黃素白蛋白納米粒的海藻酸鈉微球。

7、優選的，上述步驟s1中，iptg的終濃度為0.1～0.3mm；氯金酸水溶液的濃度為1～3mm。

8、優選的，上述步驟s1中，離心的參數為：溫度4℃，轉速4500～6000rpm，時間4～10min。

9、優選的，上述步驟s2中，人血清白蛋白溶液的濃度為1～2mg/ml；姜黃素溶液的濃度為1～2mg/ml；戊二醛水溶液的濃度為4wt％～8wt％；人血清白蛋白溶液：姜黃素溶液：戊二醛水溶液的體積比為1：4：0.02。

10、優選的，上述步驟s2中，攪拌的轉速為1200～1500rpm；姜黃素溶液的滴加速度為0.5～1ml/min；離心的參數為：溫度20℃，轉速12000～13000rpm，時間15～20min。

11、優選的，上述步驟s3中，產納米金益生菌在混合水溶液1中的濃度為1×109cfu/ml；姜黃素白蛋白納米粒在混合水溶液1中的濃度為600μg/ml；海藻酸鈉水溶液的濃度為2wt％～4wt％；cacl2水溶液的濃度為0.1wt％；混合水溶液1：海藻酸鈉水溶液的體積比為1：1；混合水溶液2：cacl2水溶液的體積比為1：20。

12、優選的，上述步驟s3中，電壓為10～13kv；混合水溶液2的滴加速率為0.1～0.3ml/min；針頭與cacl2水溶液液面的距離為9cm。

13、本發明的第二方面提供了一種共載產納米金益生菌和姜黃素白蛋白納米粒的海藻酸鈉微球，其由上述的制備方法制得。

14、本發明的第三方面提供了上述一種海藻酸鈉微球在制備治療炎癥性腸病的藥物中的應用。

15、本發明的顯著優點在于：

16、本發明提供了一種共載產納米金益生菌和姜黃素白蛋白納米粒的海藻酸鈉微球及其制備和應用，所述制備方法均需要無菌操作，包括：將含有人金屬硫蛋白1e基因的質粒導入大腸桿菌nissle?1917中構建工程化益生菌，將工程化益生菌接種于lb培養基(含卡那霉素)于搖床中培養至od600＝0.6時添加iptg誘導金屬硫蛋白的產生。金屬硫蛋白充當還原劑，在氯金酸溶液中還原得到金納米顆粒；再利用自組裝的方式，制備姜黃素白蛋白納米粒。最后將產納米金益生菌及姜黃素白蛋白的混合水溶液和海藻酸鈉水溶液混合，利用高壓靜電的方法得到共載產納米金益生菌和姜黃素白蛋白納米粒的海藻酸鈉微球。本發明提出了一種新的利用基因工程改造的益生菌大腸桿菌nissle?1917合成納米金的方法，具有制備條件溫和、綠色友好和生物安全性好等優點，保持益生菌活性的同時，賦予益生菌清除活性氧的能力。利用白蛋白制備納米制劑，提高了姜黃素的水溶性和生物利用度。最后利用高壓靜電法制備共載產納米金益生菌和姜黃素白蛋白納米粒的海藻酸鈉微球，口服給藥可以抵抗胃腸道環境，靶向腸道炎癥部位，清除炎癥部位的活性氧并調節腸道菌群平衡，有效治療炎癥性腸病。

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