專利名稱：脫乙酰基硝噻醋柳胺和硝噻醋柳胺的藥用組合物的制作方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種含有至少一個(gè)選自于通式(I)
和通式(II)
的化合物作活性劑的藥用組合物。
該活性劑優(yōu)選為小于200μm的粒度和大于10μm的平均粒度的顆粒狀。
本發(fā)明也涉及用至少一種藥學(xué)上可接受的酸穩(wěn)定化的藥用組合物。
該藥用組合物尤其用于治療免疫系統(tǒng)已受危害或抑制的患者的機(jī)會(huì)致病菌感染和吸蟲感染。相關(guān)技術(shù)的描述目前，對(duì)開發(fā)治療免疫系統(tǒng)已遭致?lián)p害(AIDS、癌癥患者、老年人、衰老者、對(duì)免疫抑制藥物依賴的器官移植患者)的人的多種寄生蟲和細(xì)菌感染的方法有一種迫切的需求。其他地區(qū)尤其是熱帶氣候關(guān)注的是吸蟲感染。這樣對(duì)一種甚至是免疫損傷的人也能夠耐受的并且甚至在熱帶環(huán)境儲(chǔ)存穩(wěn)定的藥用組合物有一種需求。
更具體地說，鼠弓形體(Toxoplasma gondii)是一種原生動(dòng)物并且是全球中樞神經(jīng)系統(tǒng)的潛伏感染中最普遍的原因。該寄生蟲可以感染許多健康人，但通常免疫系統(tǒng)能夠控制這些生物體。鼠弓形體是AIDS患者大腦的最普遍的機(jī)會(huì)致病性病原體。目前，弓形體病在逐漸成為一個(gè)嚴(yán)重的問題，這不僅因?yàn)锳IDS，而且還因?yàn)槊庖咭种扑幬锏膹V泛使用(如給器官移植患者給藥)。弓形體病一般用乙胺嘧啶和磺胺嘧啶結(jié)合治療。盡管這些藥物有效，但它們卻不能殺死寄生蟲的胞囊，所以這種治療必須以一定的劑量連續(xù)治療。但常常因?yàn)槎拘云仁顾幬镏袛啵绕湓诿庖咭种频幕颊咧校⒃斐闪藦?fù)發(fā)的結(jié)果。據(jù)報(bào)導(dǎo)在免疫缺陷患者中大約70％的死亡率和中間存活4個(gè)月方面，這種統(tǒng)計(jì)是不良的。
隱孢子蟲病是由用顯微鏡可見的原生動(dòng)物寄生蟲小隱孢子蟲(Cryptosporidium parvum)所引起的。在具有正常免疫功能的患者中，由隱孢子引起的腹瀉是強(qiáng)烈的和時(shí)間較長(zhǎng)的，但是可自身限制的。在AIDS患者中，小隱孢子蟲腹瀉通常威脅到生命。據(jù)估計(jì)15-20％的AIDS患者患有這種病。到目前為止，現(xiàn)在沒有對(duì)隱孢子蟲病療效穩(wěn)定或被認(rèn)可的療法。
在AIDS患者中最常鑒別出的病原體是Enterocytozoonbieneusi，一種微孢子蟲寄生蟲，已發(fā)現(xiàn)有將近四份之一的患者。現(xiàn)在似乎這種微小寄生蟲可以解釋清楚大部分在HIV患者所見到的吸收障礙、腹瀉和消瘦許多不能解釋的癥狀的原因。但到目前為止，仍沒有有效的治療方法。
微孢子目的幾個(gè)其他種也能夠感染HIV-陽(yáng)性的患者，它們包括Encephalitozoon hellem和cuniculi，以及一種被命名為Septataintestinalis的新種。最近報(bào)導(dǎo)表明散播的微孢子目感染開始顯著增加。
人等孢蟲(Isospora belli)的感染在臨床上不能從隱孢子蟲病中區(qū)分出來。盡管在熱帶氣候中較普遍的人等孢蟲的實(shí)際發(fā)病率可能是較高的，但據(jù)報(bào)導(dǎo)在美國(guó)只有1％以下的患者。
一般把卡氏肺囊蟲(Pneumocystis carinii)歸類為一種病原體寄生蟲；一些研究表明它可能是一種真菌，具有特定的基因序列。卡氏肺囊蟲通常感染肺部(卡氏肺囊蟲肺炎(PCP))。據(jù)報(bào)導(dǎo)在大約40-60％的患者中治療是成功的，伴隨的問題包括尤其是在免疫已受危害的患者中藥物的毒性。在感染人免疫缺陷病毒(HIV)的兒童的許多嚴(yán)重表現(xiàn)中，PCP突出是因?yàn)樗母甙l(fā)病率、獨(dú)特年齡分布和經(jīng)常性致死率的緣故。PCP是HIV感染的兒童最普遍的嚴(yán)重機(jī)會(huì)致病性感染；據(jù)估計(jì)在沒有接受預(yù)防感染有HIV的嬰兒中在生命的第一年中PCP的發(fā)病率至少12％。許多死于短暫的PCP的發(fā)展變化。
鳥型結(jié)核分支桿菌綜合征(MAC)涉及到非常相似的分支桿菌生物，鳥型結(jié)核分支桿菌(Mycobacterium avium)和胞內(nèi)分枝桿菌(Mycobacterium intracellulare)的感染。當(dāng)MAC出現(xiàn)在沒有受損傷免疫系統(tǒng)患者中時(shí)，通常感染方式在呼吸道。在患有AIDS的患者中，經(jīng)常散布有MAC(散布的MAC或DMAC)，并且?guī)缀醢ㄈ魏纹鞴傧到y(tǒng)。在最近的研究中，在AIDS診斷后2年存活的患者中有43％發(fā)現(xiàn)有MAC細(xì)菌。對(duì)散布的MAC建立標(biāo)準(zhǔn)的治療方法。處方通常開藥物的組合，并且如果成功的話，需要為生命而持續(xù)治療。急需一種更有效的療法。
感染有HIV的患者特別容易受到結(jié)核分支桿菌的感染，并加速疾病的病程。當(dāng)肺外結(jié)核在非HIV感染的患者中不普遍時(shí)，它卻頻繁出現(xiàn)在HIV-陽(yáng)性的患者中。CDC已經(jīng)公布了治療TB的準(zhǔn)則，即強(qiáng)調(diào)了抗多種藥物的TB(MDR-TB)的逐漸流行。在患有MDR-TB的AIDS患者中致死率是非常高的(大約80％)并且疾病的進(jìn)程極其快速。
所以，迫切需要開發(fā)一種治療這些流行于并危害人和動(dòng)物的感染的療法。
目前也需要一種廣泛起作用的藥物，使得治療吸蟲感染簡(jiǎn)單化。當(dāng)前，必需診斷出特殊的吸蟲病原體，然后開出對(duì)這些吸蟲具有特異療效的藥物。許多發(fā)展中國(guó)家沒有診斷特殊吸蟲的設(shè)備。開發(fā)一種廣泛起作用的藥物將取消對(duì)診斷的需求。
曼氏血吸蟲(schistosoma mansoni)，一種血吸蟲是血吸蟲病的成因劑，血吸蟲病是人類第二大重要的熱帶寄生蟲疾病(排在瘧疾之后)，并且是人類最重要的吸蟲感染。埃及血吸蟲(schistosomahaematobium)是另外一個(gè)感染人類的重要菌種。全世界范圍內(nèi)200百億個(gè)體患有血吸蟲病，其中包括在美國(guó)的幾十萬人。
肝片吸蟲(Fasciola hepatica)通常為肝吸蟲，是羊的主要疾病，但人是一個(gè)偶然的宿主。寄生蟲在健壯宿主的免疫反映中設(shè)法生存。有人建議使用硫雙二氯酚治療，但在美國(guó)沒有被批準(zhǔn)。
這樣需求一種藥用組合物，它甚至在熱帶環(huán)境中存放穩(wěn)定并具有廣泛的抗吸蟲作用。發(fā)明概述現(xiàn)已在動(dòng)物試驗(yàn)和人臨床試驗(yàn)中觀察到使用通式(I)和(II)的化合物的療法功效取決于該活性物質(zhì)的粒度和該化合物的穩(wěn)定性。
所述的藥用組合物適合于治療由下列吸蟲引起的人和動(dòng)物的吸蟲感染血吸蟲屬如曼氏血吸蟲、埃及血吸蟲、湄公血吸蟲(Schistosoma mekongi)、日本血吸蟲(Schistosoma japantcum)、居間血吸蟲(Schistosma infercalatum)；片吸蟲屬如肝片吸蟲和大片吸蟲(Fasciola giganticu)、比氏姜片蟲(Fasciolopsisbiski)；以及支雙腔吸蟲、異形異形吸蟲(Heterophytesheterophyes)和橫川后殖吸蟲(Metagonimus yokogawa)。
該藥用組合物也對(duì)治療免疫妥協(xié)的機(jī)會(huì)致病菌感染有效，這些機(jī)會(huì)致病菌包括小隱孢子蟲、人等孢子蟲、Encephalitozoonintestinalis、結(jié)核分支桿菌、鳥型結(jié)核分支桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、卡氏肺囊蟲和岡氏弓形蟲。
該藥用組合物可以是適合口服的劑型如固體劑型、液體懸浮液或糊劑。附圖的簡(jiǎn)要說明為了更完全地理解本發(fā)的特性和目的，應(yīng)當(dāng)把下列結(jié)合附圖所進(jìn)行的詳細(xì)描述作為參考

圖1顯示了硝噻醋柳胺抗E.intestinalis的抑制率百分?jǐn)?shù)和宿主細(xì)胞生存力。
圖2顯示了硝噻醋柳胺抗V.corneae的抑制率百分?jǐn)?shù)和宿主細(xì)胞生存力。
圖3顯示了阿苯達(dá)唑抗E.intestinalis的抑制率百分?jǐn)?shù)和宿主細(xì)胞生存力。
圖4顯示了阿苯達(dá)唑抗V.corneae的抑制率百分?jǐn)?shù)和宿主細(xì)胞生存力。
圖5和6顯示了對(duì)各岡氏弓形蟲培養(yǎng)孔所得到的OD值對(duì)培養(yǎng)基中藥物濃度的曲線圖。
圖7是一幅以測(cè)定硝噻醋柳胺抗生長(zhǎng)在液體肉湯中的分支桿菌功效為主的曲線圖。
圖8顯示了小于μm大小的活性顆粒的百分率。發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明治療感染的方法包括把含有至少一種選自于通式(I)的脫乙酰基硝噻醋柳胺
和通式(II)的硝噻醋柳胺
組中的化合物作活性劑的藥用組合物給藥。
通式(II)的化合物硝噻醋柳胺(NTZ)是2-(乙酰氧基)-N-(5-硝基-2-噻唑基)苯甲酰胺，一種最先由Rossignol和Cavier在1975年合成的化合物。在1ml的DMSO中能夠溶解2mg的硝噻醋柳胺。硝噻醋柳胺容易被口服吸收。
到目前為止，沒有證據(jù)表明通式(I)和/或通式(II)可能對(duì)廣泛的寄生蟲感染有效，或者它們的毒性足以使甚至免疫損傷的患者耐受。
在US 3,950,351以及本發(fā)明人的出版物中公開了硝噻醋柳胺的制劑和特定用途。有時(shí)把通式為(I)的化合物脫乙酰基-硝噻醋柳胺稱作為tizoxanide或d-NTZ，它是硝噻醋柳胺的一種代謝產(chǎn)物。
在WO 95/28393中，本發(fā)明人公開了一種生產(chǎn)通式(II)的純化合物的方法，以及含有通式(I)和(II)的化合物的混合物的組合物的用途。
現(xiàn)已觀察到當(dāng)給動(dòng)物或人口服時(shí)，粒度在170和520μm之間(平均粒度＝352μm)的通式(I)化合物、通式(II)化合物或其混合物的固體顆粒具有非常有限的功效。這類顆粒的功效還不如現(xiàn)存的藥品，所以不能被管理或商業(yè)目的所接受。
從狗中也觀察到動(dòng)物口服每千克50毫克單一劑量的粒度小于5μm的通式(I)化合物和通式(II)化合物的固體顆粒引起嚴(yán)重的副作用。
現(xiàn)已觀察到為了對(duì)動(dòng)物和人被寄生蟲、細(xì)菌、真菌和病毒所引起的感染有一個(gè)有效而安全的療法，該藥用組合物，或者是固體劑型或者是液體懸浮液必須包括有效劑量的粒度小于200μm的固體顆粒狀的活性劑，該活性劑包括通式(I)化合物和/或通式(II)的化合物，活性固體顆粒的平均大小大于10μm。
相對(duì)于粒度在5和200μm的顆粒含量而言，高含量的粒度大于200μm的顆粒存在會(huì)降低該化合物的化療活性。本發(fā)明的藥用組合物優(yōu)選不含有5％以上的粒度大于200μm的活性固體顆粒。本發(fā)明的藥用組合物更優(yōu)選幾乎不含粒度大于200μm的活性固體顆粒。
在動(dòng)物或人中，相對(duì)于粒度在5和200μm的顆粒含量而言，高含量的粒度小于5μm的活性劑顆粒的存在能夠產(chǎn)生副作用。另外，現(xiàn)已觀察到胃腸道能夠更快地吸收粒度小于5μm的顆粒到血流中，所以對(duì)共生于動(dòng)物和人的胃腸道中的寄生蟲、細(xì)菌、真菌和病毒沒有抵抗作用。
熟練的科學(xué)家不能預(yù)見通式(I)的化合物和通式(II)的化合物的粒度會(huì)對(duì)動(dòng)物和人中的抗微生物活性有這樣顯著的影響。例如，在發(fā)明人進(jìn)行的研究中，抗寄生蟲化合物如阿苯達(dá)唑、甲苯達(dá)唑、氯硝柳胺、吡喹酮和甲硝唑沒有證實(shí)在人或動(dòng)物中的抗寄生蟲活性依賴于它們粒度而產(chǎn)生這樣顯著的差異。另外，一名熟練科學(xué)家不能預(yù)見通式(I)的化合物和通式(II)的化合物的粒度會(huì)對(duì)動(dòng)物或人服用該活性劑的耐受力具有這樣一種不利影響。
通式(I)和(II)的化合物可以或者固體劑型或者液體懸浮液給藥，優(yōu)選該藥用組合物以通式(I)和/或(II)的固體顆粒形式含有有效量的活性劑，該固體顆粒具有正如用一臺(tái)CoulterCounter LS100所測(cè)定的小于200μm的粒度和大于10μm的平均活性粒度。該設(shè)備使用750nm的激光通過光衍射法測(cè)定0.4到900μm直徑的顆粒的大小。為了增加粉末的濕潤(rùn)性和抗絮凝性，在含有少量的TritonX-100的水中測(cè)定樣品。
有益的是，該活性固體顆粒的平均粒度在10和100μm之間，優(yōu)選在20和50μm之間。優(yōu)選組合物的例子是·一種組合物，其中粒度大于100μm的活性固體顆粒低于10％(重量)；·一種組合物，其中粒度小于50μm的活性固體顆粒至少為50％(重量)。
有益的是，該活性固體顆粒的平均粒度在10和100μm之間，優(yōu)選在20和50μm之間。按照該組合物優(yōu)選的實(shí)施方案，該活性固體顆粒的10％以下具有小于5μm的粒度。
在固體劑型或懸浮液中所用的活性劑最好是通式(I)和通式(II)的化合物的固體顆粒的混合物，其中固體粒度小于200μm，相對(duì)于該混合物中所含的通式(I)和通式(II)的化合物的重量而言，通式(I)的化合物的含量在0.5和20％之間，優(yōu)選在0.5和10％之間。
本發(fā)明也涉及上述藥用組合物，它最好含有至少一種藥學(xué)上可接受的酸。這類酸的例子是檸檬酸、谷氨酸、琥珀酸、乙磺酸、乙酸、酒石酸、抗壞血酸、甲磺酸、延胡索酸、己二酸、蘋果酸及其混合物。檸檬酸是非常合適的。該酸的存在提高了活性劑的穩(wěn)定性。
藥學(xué)上可接受的酸與該活性固體顆粒的重量比最好在0.01和0.5之間，優(yōu)選在0.03和0.2之間。酸的用量最好足以能夠調(diào)節(jié)懸浮液的pH值在2和6之間，優(yōu)選在3和5之間，更優(yōu)選在3.5和4.5之間。
WP 95/28393中公開了該藥用組合物的固體和液體劑型的制備技術(shù)和優(yōu)選實(shí)施例，本文將該說明書引用為參考文獻(xiàn)。該組合物最好含有一種濕潤(rùn)劑和可能是一種淀粉衍生物如在US 5,578,621中所公開的那些。為了公開可能的濕潤(rùn)劑和淀粉衍生物本文將該美國(guó)專利的內(nèi)容引用為參考文獻(xiàn)。在US 5,578,621中把濕潤(rùn)劑描述為一種分散劑。
這種藥用組合物或者作為固體或者為液體劑型或著作為糊劑或油膏劑能夠任選含有額外的活性劑如抗菌劑、抗病毒劑或質(zhì)子泵抑制劑。當(dāng)它不利時(shí)，也可能這類藥用制劑含有大于200μm的通式(I)和/或通式(II)的化合物的活性固體顆粒。
該組合物能夠含有公知的賦型劑從而達(dá)到制備適合于口服劑型的目的。
為了具有優(yōu)異的抗廣譜寄生蟲、細(xì)菌、真菌和病毒功效，該活性固體顆粒的分布系數(shù)最好在0.8和2之間，優(yōu)選在1.1和1.9之間，最佳大于1.5，該分布系數(shù)可以按照下列公式計(jì)算F90％＝(90％-10％)/((90％+10％)/2)其中·F90％是在90％時(shí)的分布系數(shù)；·90％是相對(duì)于90％的活性固體顆粒的最大顆粒直徑的顆粒部分；·10％是相對(duì)于10％的活性固體顆粒的最大顆粒直徑的顆粒部分。
按照本發(fā)明的特殊實(shí)施方案，按照上述方法制備通式(I)和/或(II)的化合物的顆粒，然后磨碎從而使10％以下的活性顆粒大于100μm，50％以下的該顆粒大于50μm并且10％以下的該活性顆粒的直徑小于5μm，平均粒度在20和50μm。然后用含有活性固體顆粒和至少一種制粒劑的混合物來把該活性顆粒制成顆粒狀。制粒劑的例子是聚乙烯吡咯烷酮、水、乙醇、蔗糖、羥基纖維素及其混合物。在制粒步驟中最好加入至少一種藥學(xué)上可接受的酸。
本發(fā)明涉及含有本發(fā)明組合物的固體劑型如片劑、分散片劑、包衣片、骨架類等。本發(fā)明的劑型包括，例如·粒度小于200μm的固體活性顆粒，10％以下的該顆粒具有大于100μm的大小，50％以下的該顆粒具有大于50μm的大小并且10％以下的該顆粒具有小于5μm的大小，平均顆粒大小在20的50μm之間。
·至少一種制粒劑；·至少一種濕潤(rùn)劑；·至少一種淀粉衍生物；·至少一種藥學(xué)上可接受的酸，優(yōu)選在制粒步驟中加入。
本發(fā)明的液體劑型如含水懸浮液包括，例如·作為活性劑，固體顆粒含有通式(I)化合物和/或通式(II)化合物，這些顆粒具有小于200μm的粒度，該顆粒中10％以下具有大于100μm的大小，該顆粒中50％以下具有大于50μm的大小并且該顆粒中10％以下具有小于5μm的大小以及·至少一種制粒劑；·至少一種濕潤(rùn)劑；·至少一種藥學(xué)上可接受的酸，該懸浮液的pH值在2和6之間，優(yōu)選在3和5之間，最佳為3.5和4.5之間；·至少一種增稠劑，例如黃原膠、瓜爾膠、晶體纖維素、carruba膠、羧甲基纖維素及其混合物。
適合于口服的本發(fā)明糊劑或油膏劑包括，例如·作為活性劑，固體顆粒含有通式(I)化合物和/或通式(II)化合物，這些顆粒具有小于200μm的粒度，該顆粒中10％以下具有大于100μm的大小，該顆粒中50％以下具有大于50μm的大小并且該顆粒中10％以下具有小于5μm的大小以及·至少一種濕潤(rùn)劑；·至少一種藥學(xué)上可接受的酸，該懸浮液的pH值在2和6之間，優(yōu)選在3和5之間，最佳為3.5和4.5之間；·至少一種增稠劑，例如黃原膠、瓜爾膠、晶體纖維素、carruba膠、羧甲基纖維素或其混合物。適合于局部或陰道內(nèi)給藥的本發(fā)明糊劑或油膏劑包括，例如·作為活性劑，固體顆粒含有通式(I)化合物和/或通式(II)化合物，這些顆粒具有小于200μm的粒度，該顆粒中10％以下具有大于100μm的大小，該顆粒中50％以下具有大于50μm的大小并且該顆粒中10％以下具有小于5μm的大小以及·至少一種濕潤(rùn)劑；·至少一種藥學(xué)上可接受的酸，該懸浮液的pH值在2和6之間，優(yōu)選在3和5之間，最佳為3.5和4.5之間；·鯨蠟醇和/或甘油衍生物和/或丙二醇；·至少一種增稠劑，例如黃原膠、瓜爾膠、晶體纖維素、carruba
膠、羧甲基纖維素或其混合物。藥用組合物的制備描述使干燥純化的通式(I)化合物和干燥純化的通式(II)化合物經(jīng)受研磨并借助目篩分出大小。
研磨之后，通式(I)化合物、通式(II)化合物及其混合物就具有圖8所給出的粒度的分布。圖8顯示了粒度小于μm的顆粒百分?jǐn)?shù)。
從該圖中似乎可以看到·該顆粒10％(重量)以下具有小于大約5μm的粒度；·該顆粒10％(重量)以下具有大于大約70μm的粒度；·平均粒度約為40μm；·該顆粒的分布系數(shù)是大約1.73，該分布系數(shù)可用下列公式計(jì)算F90％＝(90％-10％)/((90％+10％)/2)其中·F90％是在90％時(shí)的分布系數(shù)；·90％是相對(duì)于90％的活性固體顆粒的最大顆粒直徑的顆粒部分；·10％是相對(duì)于10％的活性固體顆粒的最大顆粒直徑的顆粒部分。
下表中公開該組合物的具體例子。表1.含有通式(I)化合物和通式(II)化合物作活性劑的口服分散片的組合物例子硝噻醋柳胺(99％)+脫乙酰基硝噻醋柳胺(1％) 200mg微晶纖維素 116mg由FMC-USA出售的Avicel pH 102 25mg聚維酮 3mg硬脂酸鎂 5mg膠體二氧化硅 10mg檸檬酸10mg由Robertet出售的草莓香料877720號(hào) 10mg糖精鈉 2mg表2.含有通式(I)化合物和通式(II)化合物作活性劑的口服包衣片的組合物例子硝噻醋柳胺 500mg玉米淀粉 60mg預(yù)凝膠化的玉米淀粉 70mg羥丙基甲基纖維素 5mg蔗糖 20mg淀粉乙醇酸鈉 30mg檸檬酸 25mg滑石粉8mg硬脂酸鎂 7mg包衣在含有500mg活性劑的片或膠囊上噴灑熱糖液或膜包衣。表3.含有通式(I)化合物和通式(II)化合物作活性劑的口服含水懸浮液的例子。該懸浮液的pH值大約為4.1。硝噻醋柳胺(98％)+脫乙酰基硝噻醋柳胺(2％)2g蒸餾水 100ml苯甲酸鈉0.2g蔗糖30.5g黃原膠 0.2g微晶纖維素和羧甲基纖維素鈉由FMC-USA出售的Avicel RC-5910.8g檸檬酸 0.2g二水合檸檬酸鈉 50mg由Robertet出售的草莓香料877720號(hào)125mg紅色顏料33D和C號(hào)1mg表4.含有通式(I)化合物和通式(II)化合物作活性劑的口服糊劑的例子硝噻醋柳胺(98％)+脫乙酰基硝噻醋柳胺(2％)500mg礦物油 10g棕色糖 1g微晶纖維素和羧甲基纖維素鈉由FMC出售的Avicel RC-5910.8g檸檬酸 0.2g表5.陰道內(nèi)或表面使用的糊劑或油膏劑的例子，該糊劑或油膏劑含有通式(I)化合物和通式(II)化合物作活性劑硝噻醋柳胺(98％)+脫乙酰基硝噻醋柳胺(2％)8mgCremaphor A62gCremaphor A25 1.5g礦物油 7gLuvitol EHO 7g單甘油酯4g鯨蠟醇 3gSimeticone 0.5gGermaben II 1g丙二醇 3.5g蒸餾水 62.5g本發(fā)明的藥用組合物是對(duì)寄生蟲、細(xì)菌、真菌和病毒具有廣譜作用的組合物，尤其是在口服時(shí)。
以上所公開的藥用組合物的功效和安全性對(duì)動(dòng)物和人是優(yōu)異的。尤其是，在人的臨床研究中，現(xiàn)已觀察到在治療寄生蟲感染方面，上述藥用組合物的功效比使用粒度在170和520μm之間(平均粒度＝352μm)的活性化合物的效果更顯著，甚至是與給患者以高達(dá)三次的劑量和更長(zhǎng)的時(shí)間把較大顆粒給藥相比。表6顯示了所獲得的治愈率的例子。表6.把使用粒度在170μm到520μm范圍(平均＝352μm)的通式(I)和通式(II)的化合物與使用粒度在從5μm到200μm(平均＝34μm)通式(I)和通式(II)的化合物所獲得的人臨床研究結(jié)果的比較。通式(I)的化合物(98％)+通式(II)的化合物(2％)粒度170μm到520μm粒度5到200μm劑量＝15到50mg/kg/天 劑量＝15mg/kg/天3到7天 3天寄生蟲 治愈數(shù)/總數(shù)＝％治愈率 治愈數(shù)/總數(shù)＝％治愈率人芽囊原蟲 12/27＝44％ 10/10＝100％(Blastocystis hominis)痢疾阿米巴 29/47＝62％ 106/133＝80％(Entamoeba histolytica)蘭氏賈第鞭毛蟲 11/37＝30％ 50/73＝68％(Giardia Camblia)人蛔蟲 3/69＝4％ 144/179＝80％(Ascaris Cumbricoides)毛首鞭蟲7/48＝15％ 58/79＝73％(Trichuris trichiura)對(duì)表6中所列的各寄生蟲，用5和200μm之間的活性顆粒比用170μm到520μm大小的活性顆粒治療患者，治愈率會(huì)顯著地好，在每種情況統(tǒng)計(jì)性的顯著性為p＜0.02(使用標(biāo)準(zhǔn)的X2檢驗(yàn)法)。這種情況即使較大的粒度活性劑的劑量通常較高并且治療期間經(jīng)常長(zhǎng)于接受具有小于200μm粒度的活性劑的藥用組合物的患者的給藥期間。對(duì)每組患者作出的報(bào)告沒有嚴(yán)重的副作用。
在動(dòng)物的檢驗(yàn)中也觀察到了與上述對(duì)人研究結(jié)果相似的結(jié)果。
另外，在廣泛的動(dòng)物研究中使用粒度在5和200μm(平均＞10μm)的通式(I)化合物和通式(II)的化合物沒有觀察到給狗口服單一劑量每千克50毫克的通式(I)的化合物和通式(II)的化合物所觀察到的副反應(yīng)，即使90天或更長(zhǎng)時(shí)間每天度服用相同劑量或較高劑量的化合物。
而且，該組合物是穩(wěn)定的(甚至當(dāng)經(jīng)受40℃的溫度和65％的相對(duì)濕度6個(gè)月，或者在液體懸浮液中，當(dāng)在這些條件下懸浮在水中3個(gè)月時(shí))，由此推測(cè)活性組分沒有降解并且組合物在為了醫(yī)療和商業(yè)目的進(jìn)行適當(dāng)?shù)闹苽浜笠欢螘r(shí)期內(nèi)都保持了它的功效。
下列將證實(shí)該藥用組合物的功效。
實(shí)施例I小隱孢子蟲在臨床試驗(yàn)初期，每天口服500至2000mg的硝噻醋柳胺治療患有慢性隱孢子蟲腹瀉的30名AIDS患者。如果繼續(xù)腹瀉，使患者接受另外四周的硝噻醋柳胺直到一天2000mg。
28人完成了兩周或更多周的治療并且其中16名對(duì)由第8周治療引起的治療反應(yīng)是可評(píng)估的。在之后的組中，12人在每天的腸運(yùn)動(dòng)頻率有50％或更大的下降并且10人有顯著的下降或者在糞便中消滅了寄生蟲，其中該微生物在4人中逐漸測(cè)定不到了。6名患者在益處上都符合臨床和寄生蟲學(xué)反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)。
長(zhǎng)期接受較高藥物每日劑量的患者更有可能有陽(yáng)性反應(yīng)。
對(duì)AIDS-相關(guān)隱孢子蟲腹瀉的硝噻醋柳胺的開標(biāo)研究證實(shí)了在每天服用500、1000、1500或2000mg的藥物的人中降低了腸運(yùn)動(dòng)。試驗(yàn)參與者都具有42個(gè)細(xì)胞/mm3的平均CD4+計(jì)數(shù)(在0-303個(gè)細(xì)胞/mm3之間)、平均15個(gè)月內(nèi)每天平均6.7次腸運(yùn)動(dòng)、糞便中有小隱孢子蟲卵囊并且沒有其他明顯的腸道病原體。用阿齊紅霉素或巴龍霉素治療幾乎所有參與者都失敗了。
23周后，13名中的9名具有了完全的臨床反應(yīng)(顯著地形成了每天1到3次腸運(yùn)動(dòng))，并且13名中的4名具有了部分臨床反應(yīng)(每天腸運(yùn)動(dòng)至少有50％的下降或者糞便稠度的變化至少有75％形成)。試驗(yàn)最后，11名中的8名已經(jīng)完全地消滅了寄生蟲并且其他3名在糞便的程度上實(shí)際下降了。用每天1000mg或更高的劑量和更長(zhǎng)的治療有一個(gè)好轉(zhuǎn)的趨勢(shì)。兩名試驗(yàn)參與者有了尋麻疹類的皮膚疹；90％以上的堅(jiān)持試驗(yàn)制度四周多。
實(shí)施例II小隱孢子蟲體外劑量信息把硝噻醋柳胺溶于無菌二甲基亞砜(DMSO)并以100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml和0.1μg/ml的濃度試驗(yàn)抗完整的小隱孢子蟲糞便感染的單細(xì)胞層。進(jìn)行第二個(gè)試驗(yàn)以在另外的20、2、0.2和0.02μg/ml濃度測(cè)試硝噻醋柳胺。用DMEM的完全培養(yǎng)基連續(xù)稀釋得到這些濃度從而獲得最終DMSO的濃度為0.5％。該培養(yǎng)基對(duì)照組也接觸了0.5％的DMSO。
試驗(yàn)使用了一種生長(zhǎng)在7mm腔室中的MDBKF5D2細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物，并且每孔5×104GCH1糞便作為小隱孢子蟲，并進(jìn)行巴龍霉素(陽(yáng)性對(duì)照)與硝噻醋柳胺(試驗(yàn)藥物)的比較。物質(zhì)包括免疫的抗-小隱孢子蟲子孢子兔血清(0.1％)和結(jié)合熒光素的山羊抗-兔抗體(1％)。毒性試驗(yàn)測(cè)定把200μl的以100、10、1和0.1μg/ml的濃度含有硝噻醋柳胺的培養(yǎng)基和適當(dāng)?shù)膶?duì)照物接種到含有匯合MDBKF5D2細(xì)胞單層的96孔培養(yǎng)皿的兩個(gè)孔中和不含單層的兩個(gè)孔中。在37℃和8％CO2單細(xì)胞層上培養(yǎng)該藥物。在24小時(shí)(試驗(yàn)1)和48小時(shí)(試驗(yàn)2)，MTS(Owen溶液)中，分別以333μg/ml的濃度和25μl把PMS加到每個(gè)孔中。把培養(yǎng)皿放回黑暗中的恒溫箱中進(jìn)行兩小時(shí)。在兩小時(shí)時(shí)，把100μl的各上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的顯微滴定平臺(tái)上并在ELISA讀數(shù)器的490nm處讀數(shù)。記錄并分析結(jié)果。毒性百分?jǐn)?shù)是這樣計(jì)算的從培養(yǎng)基對(duì)照上清液(不含藥)的平均光密度(OD)中減去藥物上清液的平均光密度(OD)除以培養(yǎng)基對(duì)照物的OD并乘以100。
完整小隱孢子蟲糞便測(cè)定37℃下(8％CO2)在匯合的MDBKF5D2細(xì)胞單層上硝噻醋柳胺(100、20、10、2、1、0.2、0.1和0.02μg/ml)培養(yǎng)每孔中5×104個(gè)小隱孢子蟲卵囊。測(cè)定在每個(gè)孔中的感染程度并用一臺(tái)免疫熒光測(cè)定儀分析24到48小時(shí)。計(jì)算抑制百分?jǐn)?shù)，即從培養(yǎng)基對(duì)照組(不含藥物)中平均寄生蟲數(shù)/10個(gè)視野減去藥物試驗(yàn)孔中平均寄生蟲數(shù)/10個(gè)視野，除以平均對(duì)照數(shù)，然后乘以100。
結(jié)果試驗(yàn)124小時(shí)。
*寄生蟲數(shù)/10個(gè)視野**因?yàn)槎拘远鴽]有提供。
試驗(yàn)248小時(shí)。
*寄生蟲數(shù)/10個(gè)視野硝噻醋柳胺對(duì)完整的小隱孢子蟲的卵囊的作用在試驗(yàn)1中，10、1和0.1的濃度的硝噻醋柳胺分別造成了94.4、77.2和51.8％的寄生蟲抑制程度，并且細(xì)胞毒性程度分別為65.1、8.3和19.3％。盡管在10μg/ml出現(xiàn)了接近完全抑制寄生蟲的感染，但卻顯出了高毒性率。在1μg/ml的硝噻醋柳胺，寄生蟲的抑制和細(xì)胞毒性好于在2mg/ml濃度的巴龍霉素(對(duì)1μg/ml的硝噻醋柳胺，77.2％的寄生蟲抑制和8.3％毒性與對(duì)2mg/ml濃度的巴龍霉素51％的寄生蟲抑制和23.8％的細(xì)胞毒性)。
在試驗(yàn)2中，改進(jìn)該藥物以獲得最小毒性的更好劑量分布。結(jié)果是，培養(yǎng)物能夠存活48小時(shí)替代了試驗(yàn)中的24小時(shí)。培養(yǎng)48小時(shí)明顯導(dǎo)致了更高的相關(guān)細(xì)胞毒性，這正如在兩種試驗(yàn)中對(duì)巴龍霉素檢測(cè)所得到的數(shù)據(jù)。盡管細(xì)胞單層似乎仍然是完整的，但是在48小時(shí)培養(yǎng)的20μg/ml的硝噻醋柳胺仍然有太大的毒性。有可能影響細(xì)胞功能的較高毒性也影響寄生蟲的感染/發(fā)生。2μg/ml的硝噻醋柳胺對(duì)寄生蟲的感染有顯著的抑制同時(shí)也具有相對(duì)較低的細(xì)胞毒性。進(jìn)一步稀釋也能夠產(chǎn)生顯著的抑制和低毒性。在藥物濃度為2μg/ml時(shí)，中等細(xì)胞毒性和94.90％的抑制活性表明在體外小隱孢子蟲感染2μg/ml的硝噻醋柳胺優(yōu)于2mg/ml的巴龍霉素(如1000倍的較高濃度)。
實(shí)施例III小隱孢子蟲體外劑量和存放資料測(cè)試存放的硝噻醋柳胺和脫乙酰基硝噻醋柳胺(NTZ和NTZdes)在10、1、0.1和0.01μg/ml的濃度時(shí)抗完整的小隱孢子蟲卵囊脫囊的子孢子感染的細(xì)胞單層。把每種化合物溶于100％的二甲基亞砜(DMSO)并且用無菌DMEM稀釋到理想的濃度。硝噻醋柳胺和培養(yǎng)基對(duì)照物的各種濃度都包括0.025％DMSO作一個(gè)常數(shù)。
該試驗(yàn)使用了生長(zhǎng)在7mm腔室的MDBKF5D2細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物和用每孔5×104的GCH1卵囊作為小隱孢子蟲，并且進(jìn)行該試驗(yàn)來對(duì)比巴龍霉素(陽(yáng)性對(duì)照)和硝噻醋柳胺(試驗(yàn)藥物)。材料包括免疫的抗-小隱孢子蟲子囊兔血清(0.1％)和結(jié)合熒光的山羊抗-兔抗體(1％)。毒性試驗(yàn)測(cè)試把200μl上述提到的濃度的含有硝噻醋柳胺的培養(yǎng)基溶液和適當(dāng)?shù)膶?duì)照物接種到含有匯合的MDBKFD2細(xì)胞單層的96孔培養(yǎng)皿的兩個(gè)孔中和沒有單層的兩個(gè)孔中。在37℃和8％CO2條件下在該單細(xì)胞層上培養(yǎng)該藥物。48小時(shí)時(shí)，分別以333μg/ml和25μM的濃度把MTS(Owen溶液)和PMS加入各孔中。把該培養(yǎng)皿放回黑暗中的恒溫箱培養(yǎng)2小時(shí)。在2小時(shí)時(shí)，把100μl的各上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的顯微滴定片上并在ELISA讀數(shù)計(jì)的290nm處讀數(shù)。記錄并分析結(jié)果。這樣計(jì)算毒性的百分?jǐn)?shù)從對(duì)照的培養(yǎng)基上清液(沒有藥物)的平均光密度(OD)中減去藥物上清液的平均光密度(OD)，除以對(duì)照培養(yǎng)基的OD并乘以100。
按如下給細(xì)胞毒性打分0.5％毒性＝0，6-25％毒性＝1，26-50％毒性＝2，51-75％毒性＝3和76-100％毒性＝4。按照標(biāo)準(zhǔn)，把0或1的細(xì)胞毒性分?jǐn)?shù)當(dāng)作可接受的毒性程度。把2、3或4的毒性當(dāng)作高程度或?qū)?xì)胞單層的毒性。完整的小隱孢子蟲卵囊測(cè)定在37℃(8％CO2)匯合的MDBKF5D2細(xì)胞單層以上面所提到的硝噻醋柳胺濃度培養(yǎng)5×104個(gè)小隱孢子蟲卵囊。測(cè)定在每孔的感染程度并且在48小時(shí)通過免疫熒光測(cè)定法進(jìn)行計(jì)算機(jī)分析。這樣計(jì)算抑制的百分?jǐn)?shù)從培養(yǎng)基對(duì)照組(不含藥物)中平均寄生蟲數(shù)/每個(gè)視野減去藥物試驗(yàn)孔中平均寄生蟲數(shù)/每個(gè)視野，除以平均對(duì)照數(shù)，然后乘以100。
結(jié)果小隱孢子蟲卵囊測(cè)定法(48小時(shí)
濃度-μg/ml；寄生蟲-平均寄生蟲數(shù)/視野(分析的12個(gè)視野)；％抑制率-寄生蟲感染的抑制百分?jǐn)?shù)；％毒性-藥物對(duì)細(xì)胞毒性的百分?jǐn)?shù)。
從上述可以看出NTZdes的抑制活性與實(shí)施例II NTZ的相同。當(dāng)每種組合物分別用10和1μg/ml所得到98和94％抑制率的平行試驗(yàn)時(shí)，硝噻醋柳胺和脫乙酰基硝噻醋柳胺二者在體外抗小隱孢子蟲的功效是相同的。對(duì)硝噻醋柳胺，1μg/ml是得到90％以上的抑制率的最低濃度而用硝噻醋柳胺的較底濃度如0.2、0.1和0.02μg/ml可能獲得50％的抑制率。在相同試驗(yàn)條件下，用作陽(yáng)性對(duì)照的巴龍霉素比在2,000μg/ml的濃度達(dá)到51到83％范圍的抑制濃度的功效小2,000倍。
實(shí)施IVE.INTESTINALIS和V.CORNEA以每孔2.6×105個(gè)細(xì)胞的濃度把2RK-13細(xì)胞(兔腎細(xì)胞系)加入到24孔培養(yǎng)板(1.0ml培養(yǎng)基；具有2mM L-谷氨酸的RPMI 1640和5％熱滅活的胎牛血清)。在37℃ CO2恒溫箱把碟子培養(yǎng)過夜，這時(shí)細(xì)胞已達(dá)到了匯合(增加一倍，估計(jì)每孔5×105個(gè))。
以相對(duì)于所估計(jì)的宿主細(xì)胞3∶1的比率或以每孔15×106個(gè)生物把Septata intestinalis(來自組織培養(yǎng)物的)生物加到宿主細(xì)胞中。該比率造成大約50％的逐漸感染的宿主細(xì)胞。
把藥物溶于MDSO、水或甲醇(取決于溶解度)來生產(chǎn)1.0mg/ml的貯存液。把該貯存液存放在-70℃。在試驗(yàn)中在完全組織培養(yǎng)基中使用稀釋液。在一式三份的孔中試驗(yàn)所有稀釋液。
每隔三到四天更換培養(yǎng)基(含有新鮮稀釋的藥物)。
在第六天(加入寄生蟲和藥物后)，檢測(cè)細(xì)胞的毒性。檢測(cè)給藥但沒寄生蟲的對(duì)照細(xì)胞的匯合、細(xì)胞形態(tài)和死亡或漂浮細(xì)胞的存在。檢測(cè)只用寄生蟲培養(yǎng)的細(xì)胞來證實(shí)寄生蟲的感染(即寄生蟲類的空泡的存在)。細(xì)胞培養(yǎng)寄生蟲并且評(píng)估藥物對(duì)宿主細(xì)胞毒性和寄生蟲空泡的相對(duì)數(shù)(即高度、中度或低度)。
在第10天，把100μl的10％ SDS(0.5％最終濃度)加到培養(yǎng)基孔中來破裂宿主細(xì)胞膜并引起小孢子蟲目的釋放。通過計(jì)算血細(xì)胞計(jì)數(shù)器上的整除數(shù)來測(cè)定每孔中存在的寄生蟲總數(shù)。用抑制百分?jǐn)?shù)來表示結(jié)果(相對(duì)于沒給藥的感染細(xì)胞)。
在圖1-4中顯示了結(jié)果。
實(shí)施例V岡氏弓形蟲試驗(yàn)硝噻醋柳胺和脫乙酰基硝噻醋柳胺抗寄生蟲，更具體地說是鼠連續(xù)排便所保留的岡氏弓形蟲的RH株。用岡氏弓形蟲培養(yǎng)96孔微培養(yǎng)板中培養(yǎng)MRC5成纖維細(xì)胞(Bio-Merieux，法國(guó))的細(xì)胞培養(yǎng)物。向各培養(yǎng)物孔中加入200個(gè)新鮮收獲的速殖子，除了8個(gè)對(duì)照孔(陰性對(duì)照)。培養(yǎng)4小時(shí)后，把藥物稀釋液加入培養(yǎng)基中。
在8.10-4和40mg/L之間的濃度試驗(yàn)硝噻醋柳胺(NTZ)和脫乙酰基硝噻醋柳胺(dNTZ)。開始以2mg/mL的濃度把藥物溶于DMSO中，然后在培養(yǎng)基中制備連續(xù)的稀釋液。沒有觀察到沉淀。
把藥物稀釋液加入培養(yǎng)物中(各稀釋液的8個(gè)孔中)，然后把該培養(yǎng)物培養(yǎng)72小時(shí)。然后用冷甲醇固定培養(yǎng)物。用過氧化酶標(biāo)記的抗岡氏弓形蟲的兔抗體通過ELISA進(jìn)行岡氏弓形蟲生長(zhǎng)的測(cè)定。記錄每孔的光密度。
通過繪制從每個(gè)培養(yǎng)孔所得到的OD值對(duì)培養(yǎng)物中藥物的濃度圖表示結(jié)果。統(tǒng)計(jì)分析由95％置信區(qū)間的回歸分析和來自各藥物所產(chǎn)生的OD值的劑量-反應(yīng)曲線的測(cè)定所組成。
用吉姆薩給一個(gè)平皿染色來檢查培養(yǎng)物中細(xì)胞病的作用。
了解這三種試驗(yàn)。在每個(gè)試驗(yàn)中，每個(gè)化合物用兩個(gè)培養(yǎng)皿；在每個(gè)培養(yǎng)皿中，對(duì)各藥物濃度使用8個(gè)同樣的孔。結(jié)果在三組試驗(yàn)中得到了相似的結(jié)果。在圖5a、b、c和6a、b、c上顯示了每種藥物一個(gè)代表性試驗(yàn)的圖示。硝噻醋柳胺(圖5a、b、c)對(duì)10-4mg/l和0.3mg/L之間濃度沒有注意到抑制作用。對(duì)≥0.6mg/L的濃度注意到顯著的作用，對(duì)≥2.5mg/L的濃度能夠完全抑制岡氏弓形蟲的生長(zhǎng)。但是，對(duì)≥2.5mg/L的濃度能夠在細(xì)胞單層上注意到顯著的毒性。
細(xì)胞單層的顯微鏡檢查表明在1.25mg/L的濃度的NTZ誘發(fā)了對(duì)寄生的細(xì)胞的細(xì)胞病作用，伴有放大的寄生蟲樣的空泡和細(xì)胞內(nèi)寄生蟲數(shù)目的減少。從回歸分析中，估計(jì)在1.2mg/L能夠達(dá)到50％的抑制濃度。脫乙酰基硝噻醋柳胺(圖7a、b、c)用脫乙酰基硝噻醋柳胺得到了相似的結(jié)果在10mg/L和0.3mg/L之間的濃度沒有作用，≥0.6mg/L的濃度能夠抑制并且≥2.5mg/L的濃度有顯著毒性。估計(jì)在1.2mg/L能夠達(dá)到50％的抑制濃度。
所得到的結(jié)果在三次不同的試驗(yàn)中是可重復(fù)的，同時(shí)也評(píng)估了各藥物濃度時(shí)對(duì)重復(fù)培養(yǎng)物的藥物抑制作用。
對(duì)硝噻醋柳胺和脫乙酰基硝噻醋柳胺來說，在大約1.2mg/L的濃度能夠觀察到對(duì)弓形蟲生長(zhǎng)的顯著抑制，同時(shí)改變了寄生蟲樣的空泡但沒有顯著改變寄生蟲本身。
這些結(jié)果表明這些藥物對(duì)抗岡氏弓形蟲具有良好的活性，并且在體內(nèi)血清或組織中得到大約1mg/L的濃度能夠預(yù)期有治療作用。
實(shí)施例VI分支桿菌現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)硝噻醋柳胺具有抗TB器官的抗菌活性。下表顯示了一種由瓊脂稀釋技術(shù)硝噻醋柳胺和脫乙酰基硝噻醋柳胺的MIC抗胞內(nèi)分支桿菌的測(cè)定方法。這些結(jié)果以幾個(gè)試驗(yàn)為基礎(chǔ)，對(duì)使用Middlebrook瓊脂的瓊脂稀釋方法來說，其中每個(gè)試驗(yàn)花費(fèi)約3周的時(shí)間。使用來自ATCCd胞內(nèi)分支桿菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株，按照標(biāo)準(zhǔn)瓊脂稀釋方法所得到的這些數(shù)據(jù)表明硝噻醋柳胺在2μg/ml具有抗分支桿菌的MIC而脫乙酰基硝噻醋柳胺在4μg/ml具有MIC。硝噻醋柳胺和脫乙酰基硝噻醋柳胺對(duì)胞內(nèi)分支桿菌的MIC
MIC硝噻醋柳胺2μg/ml脫乙酰基硝噻醋柳胺4μg/ml*MIC是通過使用Middlebrook 7H11瓊脂的標(biāo)準(zhǔn)瓊脂稀釋法測(cè)定3周。該試驗(yàn)使用了一種標(biāo)準(zhǔn)菌株胞內(nèi)分支桿菌ATCC13950。
圖7是一幅以測(cè)定硝噻醋柳胺抗液體肉湯中分支桿菌生長(zhǎng)的功效的圖表。我們使用了MTS比色測(cè)定法，該方法使我們能夠測(cè)定在4小時(shí)而不是用瓊脂計(jì)數(shù)方法所測(cè)的3周的生長(zhǎng)。正如從圖7數(shù)據(jù)中所看到的，當(dāng)在開始培養(yǎng)后72小時(shí)加入硝噻醋柳胺時(shí)，比單獨(dú)的對(duì)照培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)有對(duì)持續(xù)生長(zhǎng)更迅速的作用。硝噻醋柳胺3μg/ml的劑量在24小時(shí)后能夠終止生長(zhǎng)，然后在2天后會(huì)有一個(gè)緩慢的生長(zhǎng)。在培養(yǎng)物的144小時(shí)過程中50μg/ml的劑量是可完全制菌的。
實(shí)施例VII小隱孢子蟲在試驗(yàn)性感染鼠中試驗(yàn)硝噻醋柳胺的抗小隱孢子蟲的作用。硝噻醋柳胺是由佛羅里達(dá)的Tampa的Romark實(shí)驗(yàn)室L.C.提供的。
按照Paget和Barnes改良人的總劑量(1g/天7天，即7g)來用于小鼠。把人的劑量乘以0.0026用于小鼠(稱量大約20g)來得到對(duì)每個(gè)宿主連續(xù)7天早晚所需藥物的重量。每個(gè)小鼠接受2.6mg/天(7000mg×0.0026/7)。用裝有圓形傾斜針頭的塑料注射器由口把所述劑量給藥。
通過口服100,000個(gè)從感染的小牛得到的小隱孢子蟲的卵囊，把20只(20)2天齡的哺乳小鼠感染。在對(duì)小鼠給藥前，按照Fayer &Ellis所述的技術(shù)使用糖溶液濃縮該卵囊。獲取每只小鼠的直腸化驗(yàn)樣本并每天用Graczyl等所述的改良的Niehl-Neelsen染色技術(shù)進(jìn)行檢查。在動(dòng)物口服感染后2天脫落的卵囊出現(xiàn)在糞便中。在動(dòng)物感染后第三天，10只小鼠早晚連續(xù)7天接受了1.3mg的硝噻醋柳胺，同時(shí)保留10只剩余的小鼠作未治療的對(duì)照。在治療的7天中的每天和治療后7天的每天獲取直腸化驗(yàn)樣本。把卵囊懸浮于油中并在顯微鏡下每100視野計(jì)數(shù)。結(jié)果
在下表中顯示的結(jié)果清楚地表明把硝噻醋柳胺以2.6mg/天的每日劑量連續(xù)7天可以有效地抗小隱孢子蟲，相對(duì)于對(duì)照動(dòng)物減少感染小鼠糞便中的卵囊數(shù)。在治療第三天結(jié)束時(shí)，試驗(yàn)藥物能夠減少10只治療小鼠中的6只的脫落的卵囊。在治療第7天結(jié)束時(shí)，完全降低了脫落的卵囊，當(dāng)與未治療的對(duì)照小鼠相比時(shí)，所有治療小鼠的糞便檢查都呈陰性。正如通過在治療后第3和7天所觀察到陰性檢查所示，這種作用在治療后至少持續(xù)7天。
實(shí)施例VIII分支桿菌把硝噻醋柳胺與izoniazide抗菌藥比較。原始記錄使用了BCG(卡介菌)作分支桿菌菌株。該菌株的敏感性與結(jié)核分支桿菌的相同，但該菌株更無害，所以不需要高含量的結(jié)核病藥劑的內(nèi)容物。
給小鼠服用每天4mg/每只鼠的0.2ml向日葵油。用硝噻醋柳胺治療的小鼠結(jié)果與接受izoniazide組是相當(dāng)?shù)摹?
實(shí)施例IX肝片吸蟲試驗(yàn)硝噻醋柳胺和脫乙酰基硝噻醋柳胺體內(nèi)抗肝片吸蟲的功效。
在LA.Bunkie，Hardy’s Meat Packers的Louisiana Veterinary醫(yī)療診斷實(shí)驗(yàn)室中由于姜片蟲病而宣告不適用的3個(gè)牛肝臟的膽管中收集成熟的肝片吸蟲。在無菌生理鹽水中洗滌吸蟲1小時(shí)并轉(zhuǎn)入無菌生理鹽水或RPMI(pH7.4)另外3小時(shí)。然后在37℃5％CO2條件下，把吸蟲放于無菌RPMI-兔血漿(50∶50v/v)或無菌RPMI(pH7.4)過夜。
按照改良的Ibarra和Jenkins的方法(Z.Parasitenkd.70655-661，1984)進(jìn)行體外培養(yǎng)(37℃，5％CO2)。使用無菌技術(shù)，在hank平衡鹽溶液(pH7.2)中把吸蟲洗滌兩次2-3分鐘并分別方于6孔Linbro培養(yǎng)平板的孔中，其中培養(yǎng)板中含有10ml等分的藥物在培養(yǎng)基中定義的稀釋液。培養(yǎng)基是由含有2％兔血的無菌50∶50v/vRPMI-兔血清加100ppm青霉素和100ppm鏈霉素組成。只使用具有正常活性和形態(tài)的吸蟲。
使用100ml的容量瓶，把由Romark提供的NTZ或其D-NTZ的備用溶液溶于DMSO(2000μg/ml)并用培養(yǎng)基稀釋來生成特定的藥物濃度(100、50、25、10、5、3、1μg/ml)。在每個(gè)復(fù)制品中培養(yǎng)兩個(gè)對(duì)照吸蟲，一個(gè)在含有RBC的沒有藥物的培養(yǎng)基而另一個(gè)在含有RBC的沒有藥物的培養(yǎng)基中。
使用帶背景光的操縱臺(tái)和一個(gè)3×放大的帶光鏡片，為了藥物治療的功效檢查吸蟲，把與未治療的對(duì)照吸蟲相比死亡、能動(dòng)性分布或形態(tài)變化作為證據(jù)。結(jié)果試驗(yàn)1對(duì)D-NTZ來說，在50和100μg治療中的吸蟲是瀕死的或在1小時(shí)內(nèi)死亡的。在25μg的治療中7條吸蟲中的4條是瀕死的，兩條是具有活性的，并且在第1小時(shí)內(nèi)一條是遲鈍的；到3小時(shí)所有都死亡了除了兩條緩慢的吸蟲并且在4小時(shí)后僅有1條遲鈍的吸蟲存活。在10μg時(shí)，在1、3和4小時(shí)注意到了降低的活性并且到7小時(shí)所有的都瀕死或死亡。在有3μg緩慢發(fā)作的5μg和3μg組中直到24小時(shí)才看到一些個(gè)體中下降的活性；在各組中除了一條遲鈍的吸蟲外到50小時(shí)3和5μg治療孔中全部死亡。在42-47小時(shí)注意1μg組有一些延緩的活性并只有3條存活，在91小時(shí)還存活著一條瀕死的吸蟲；在115小時(shí)只有1條瀕死的吸蟲存活在1/g組。在66小時(shí)(一條吸蟲)、91小時(shí)(一條吸蟲)和115小時(shí)(四條吸蟲)觀察到含有RBC的對(duì)照組中的能動(dòng)性。在不含RBC的對(duì)照組中，在91小時(shí)所有都活著并且在15小時(shí)一條是死亡的。
試驗(yàn)2通過在8次重復(fù)中對(duì)能動(dòng)性分?jǐn)?shù)和死亡率的早期作用注意到NTZ相對(duì)于D-NTZ的結(jié)果具有稍微好的活性。在100、50和25μg組，除了25μg組在1小時(shí)存在1條吸蟲外，所有的吸蟲都死亡，而存在的那條吸蟲在3小時(shí)后死亡。在開始后第1小時(shí)可以看到其他各用藥治療組在死亡率上有與劑量相關(guān)的下降。在10μg組，只有一條吸蟲存活到16小時(shí)。在5μg組，只有3條吸蟲在第6小時(shí)是活的并且在16小時(shí)沒有一條存活。到23小時(shí)，在3μg組中只有2條呆滯的吸蟲存活著；到41小時(shí)就死亡了。對(duì)1μg組來說，到16小時(shí)有一條吸蟲死亡，到41小時(shí)有3條而到74小時(shí)有5條死亡；在91小時(shí)有3條吸蟲存活并且在115小時(shí)有一條吸蟲具有活性。在有RBS對(duì)照組中，在74小時(shí)7或8條吸蟲是活的，在91小時(shí)有3條是活的并且在115小時(shí)有2條是存活的。在沒有RBC的對(duì)照組中，6或8條吸蟲在74小時(shí)具有活性，在91小時(shí)有4只具有活性而在115小時(shí)有2只具有活性。
在高劑量組(25、50、100μg)中吸蟲的死亡是迅速的并與收縮和腹側(cè)‘卷曲’有關(guān)。在較低的給藥劑量時(shí)，在一定時(shí)期多數(shù)吸蟲是緩慢的，當(dāng)瀕死或死亡時(shí)吸蟲變得更松弛和‘扁平’。
在91小時(shí)污染對(duì)一些重復(fù)開始的試驗(yàn)結(jié)果有限制。對(duì)D-NTZ試驗(yàn)來說，到115小時(shí)在兩次重復(fù)平皿中出現(xiàn)了大多數(shù)細(xì)菌或真菌的生長(zhǎng)過度和相關(guān)的死亡率。對(duì)NTZ試驗(yàn)中，到91小時(shí)(有兩次重復(fù))和115小時(shí)(有5次重復(fù))在全部重復(fù)平皿中出現(xiàn)生長(zhǎng)過度和吸蟲的死亡率。由于多數(shù)平皿的一般性污染，把139小時(shí)的觀察視為無效。結(jié)論通過兩組測(cè)試藥物的試驗(yàn)表明硝噻醋柳胺具有很強(qiáng)的殺吸蟲功效。據(jù)觀察硝噻醋柳胺對(duì)肝片吸蟲的殺吸蟲活性稍微好于脫乙酰基硝噻醋柳胺，脫乙酰基硝噻醋柳胺被認(rèn)為是在肝濃度中具有活性的主要代謝產(chǎn)物。
在D-NTZ體外給藥率＞50μg時(shí)，1小時(shí)內(nèi)出現(xiàn)吸蟲的快速死亡，在25μg為4小時(shí)并且在10μg到6-7小時(shí)。如果藥物動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)表明單一治療后＞6-8小時(shí)保持組織濃度，10μg可能是一個(gè)適當(dāng)?shù)膯我恢委煱邢蛩幬镞\(yùn)送率。
在3和5μg劑量率觀察到兩種化合物74小時(shí)(三天)殺吸蟲的強(qiáng)烈活性。在1μg給藥量觀察到延長(zhǎng)的存活途徑但不等于沒有給藥治療的對(duì)照吸蟲；所以在肝組織中需要3到4天把這種含量的藥物運(yùn)送給吸蟲可能對(duì)寄生蟲具有不足的治療作用。
實(shí)施例X大片吸蟲在試驗(yàn)性感染的兔中測(cè)試硝噻醋柳胺對(duì)成熟的和未成熟的大片吸蟲抵抗作用。
在使用Abdel-Ghany所述的技術(shù)用大片吸蟲感染L.calludi蝸牛28-35天后，在透明紙上收集包在囊內(nèi)的大片吸蟲的后囊蚴(EBC)，其中在純凈的脫氯自來水中使蝸牛暴露在人工光線30分鐘。在4℃的冰箱中把所得到的包在囊內(nèi)的后囊蚴(EMC)保存在水面下5到8天直到把它們用于感染的試驗(yàn)動(dòng)物。
在試驗(yàn)中包括40只重量在1.5到2kg的Boscat兔，并分成每組20只的兩個(gè)治療組。
用包在萵苣葉中并放在動(dòng)物舌根上的35-40個(gè)包在囊內(nèi)的后囊蚴口服感染第1組動(dòng)物。用手緊閉動(dòng)物口腔直到把包在囊內(nèi)的后囊蚴吞咽下去。用第1組的這些動(dòng)物測(cè)試硝噻醋柳胺抗未成熟狀態(tài)(4-5周大的)的大片吸蟲的功效。
如上所述把第2組動(dòng)物用10-15個(gè)包在囊內(nèi)的后囊蚴口服感染并用來測(cè)試硝噻醋柳胺抗成熟吸蟲(＞10周大的)的功效。
在寄生蟲循環(huán)的未成熟狀態(tài)感染后4周，使第1組中的10只動(dòng)物早晚連續(xù)7天接受35mg的硝噻醋柳胺。第1組中剩余10只動(dòng)物作為未治療的對(duì)照。
在寄生蟲成熟狀態(tài)感染后4周，使第2組中的10只動(dòng)物早晚連續(xù)7天接受35mg的硝噻醋柳胺。第2組中剩余10只動(dòng)物作為未治療的對(duì)照。
用干燥的飼料配量喂養(yǎng)這些動(dòng)物直到試驗(yàn)結(jié)束。
在硝噻醋柳胺最后劑量給藥后7天，殺死各組的所有動(dòng)物。檢查肝臟表面是否存在壞死的遷移性皺紋尤其是在寄生蟲循環(huán)的未成熟狀態(tài)。用兩個(gè)手術(shù)針檢查這些壞死區(qū)從而按照El-Bahy所述的技術(shù)提取遷移的幼稚吸蟲。把特別是遷移性皺紋周圍的肝臟切成小片并在顯微鏡下浸軟來提取存在的吸蟲。用溫水清洗腹腔和內(nèi)臟表面。然后收集清洗水，篩選并檢查識(shí)別幼稚吸蟲。在第1和2組中治療的和未治療的動(dòng)物中計(jì)算所收集的所有寄生蟲以及部分寄生蟲的數(shù)目。活著的吸蟲顏色為粉紅色、顯出半透明的完整體膚，特別是從用溫水從肝臟組織中提取得到的吸蟲，同時(shí)死亡的吸蟲在顏色損失上是灰色的并且顯示出斷裂的壞死表面。用下列公式計(jì)算硝噻醋柳胺的功效
其中a＝對(duì)照組動(dòng)物糞便中收集的吸蟲數(shù)b＝治療組動(dòng)物糞便中收集的吸蟲數(shù)。結(jié)果如表7所示的研究結(jié)果表明與對(duì)照組相比從治療組兔肝臟所收集的未成熟的吸蟲數(shù)有顯著的下降。下降的平均百分?jǐn)?shù)計(jì)算為46.77％(范圍40-60％)。
表7在試驗(yàn)性感染的兔中硝噻醋柳胺抗未成熟(4周大)大片吸蟲的功效
正如表8所示的，在感染的早期成熟狀態(tài)，硝噻醋柳胺顯示出了一種完全的作用(100％下降)并且在檢查治療兔肝臟后與未治療對(duì)照動(dòng)物相比可以看到?jīng)]有腸蟲。表8在試驗(yàn)性感染的兔中硝噻醋柳胺抗早期成熟(10周大的)大片吸蟲的功效
以70mg/天的劑量連續(xù)7天給藥硝噻醋柳胺對(duì)抗大片吸蟲的未成熟狀態(tài)具有中等程度的功效并且對(duì)抗該寄生蟲早期成熟狀態(tài)具有完全的功效。
實(shí)施例XIII血吸蟲在試驗(yàn)性感染的小鼠中測(cè)試硝噻醋柳胺抗曼氏血吸蟲和埃及血吸蟲的功效。
把重量為30到50克的40只白鼠分為兩個(gè)治療組，每組20只動(dòng)物。用懸浮于0.25ml蒸餾水中300-500曼氏血吸蟲的游離活性尾蚴并通過腹腔注射為每只小鼠給藥來感染第1組。除了埃及血吸蟲尾蚴不同外用相同的方式感染第2組。然后把這兩組在實(shí)驗(yàn)室放置總共70天。
權(quán)利要求
1.一種口服藥物組合物，它含有至少一種選自下組中的化合物作活性劑通式(I)的化合物
和通式(II)的化合物
2.按照權(quán)利要求1的組合物，其中所述的活性化合物為粒度小于200μm和平均粒度大于10μm的活性顆粒形式。
3.按照權(quán)利要求2的組合物，其中該活性顆粒的平均粒度在10和100μm之間。
4.按照權(quán)利要求2的組合物，其中該活性顆粒的平均粒度在20和50μm之間。
5.按照權(quán)利要求2的組合物，其中該活性顆粒重量的10％以下具有大于100μm的粒度。
6.按照權(quán)利要求2的組合物，其中至少該活性顆粒重量的50％具有小于50μm的粒度。
7.按照權(quán)利要求2的組合物，其中該活性顆粒重量的10％以下具有小于5μm的粒度。
8.按照權(quán)利要求2的組合物，它含有通式(I)和通式(II)的活性顆粒化合物的混合物，相對(duì)于通式(I)和通式(II)化合物的混合物的重量而言，通式(I)化合物的重量含量在0.5和20％之間。
9.按照權(quán)利要求1的組合物，其中該組合物還含有至少一種藥學(xué)上可接受的酸。
10.按照權(quán)利要求9的組合物，其中該藥學(xué)上可接受的酸選自檸檬酸、谷氨酸、琥珀酸、乙烷磺酸、乙酸、酒石酸、抗壞血酸、甲烷磺酸、延胡索酸、己二酸、蘋果酸及其混合物。
11.按照權(quán)利要求9的組合物，其中該活性劑是粒度小于200μm和平均粒度大于10μm的固體顆粒形式，并且其中藥學(xué)上可接受的酸與該固體顆粒的重量比在0.01和0.5之間。
12.按照權(quán)利要求11的組合物，其中藥學(xué)上可接受的酸與該活性固體顆粒的重量比在0.03和0.2之間。
13.一種治療一種選自于下組中的微生物對(duì)免疫損傷的哺乳動(dòng)物感染的方法，其中所述的微生物為小隱孢子蟲、人等孢子蟲、Enterocytzoon bieneusi、Encephalitozoon intestinalis、結(jié)核分支桿菌、鳥分支桿菌、胞內(nèi)分支桿菌、卡氏肺囊蟲和兔弓形體，該方法包括把一種含有至少一種選自于通式(I)
和通式(II)
組中的化合物作活性劑的藥物組合物給藥。
14.按照權(quán)利要求12的方法，其中該活性劑為平均粒度在10和200μm之間的顆粒狀。
15.按照權(quán)利要求12的方法，其中該活性劑為平均粒度在20和50μm之間的顆粒狀。
16.按照權(quán)利要求12的方法，其中該藥物組合物至少含有一種藥學(xué)上可接受的酸。
17.按照權(quán)利要求16的方法，其中該藥學(xué)上可接受的酸選自于下組檸檬酸、谷氨酸、琥珀酸、乙烷磺酸、乙酸、酒石酸、抗壞血酸、甲烷磺酸、延胡索酸、己二酸、蘋果酸及其混合物。
18.按照權(quán)利要求12的方法，其中該活性劑是通式(I)的化合物。
19.按照權(quán)利要求12的方法，其中該活性劑是通式(II)的化合物。
20.按照權(quán)利要求12的方法，其中該哺乳動(dòng)物是人并且其中該活性劑是以每日500-2000mg的量給藥的。
21.按照權(quán)利要求20的方法，其中該活性劑是以每日1000-1500mg的量給藥的。
22.一種治療選自下組吸蟲的寄生蟲感染的方法，其中的吸蟲組由血吸蟲屬、片吸蟲屬、姜片蟲屬、雙腔吸蟲屬、異形吸蟲屬和后殖吸蟲屬組成，該方法包括把含有至少一種選自于通式(I)
和通式(II)
組中的化合物作活性劑的藥物組合物給藥。
23.一種治療選自于下組中的吸蟲的寄生蟲感染的方法，其中的吸蟲組由曼氏血吸蟲、埃及血吸蟲、湄公河血吸蟲、日本血吸蟲、居間血吸蟲、肝片吸蟲、大片吸蟲、布氏姜片蟲、支雙腔吸蟲、異形異形吸蟲和橫川后殖吸蟲組成，該方法包括把含有至少一種選自于通式(I)
和通式(II)
組中的化合物作活性劑的藥物組合物給藥。
24.按照權(quán)利要求23的方法，其中該活性劑為平均粒度在10和200μm的顆粒狀。
25.按照權(quán)利要求24的方法，其中該活性劑為平均粒度在20和50μm的顆粒狀。
26.按照權(quán)利要求23的方法，其中該藥物組合物含有至少一種藥學(xué)上可接受的酸。
27.按照權(quán)利要求26的方法，其中該藥學(xué)上可接受的酸選自于下組中檸檬酸、谷氨酸、琥珀酸、乙烷磺酸、乙酸、酒石酸、抗壞血酸、甲烷磺酸、延胡索酸、己二酸、蘋果酸及其混合物。
28.按照權(quán)利要求26的方法，其中藥學(xué)上可接受的酸與該固體顆粒的重量比在0.01和0.5之間。
29.按照權(quán)利要求23的方法，其中該活性劑為通式(I)的化合物。
30.按照權(quán)利要求23的方法，其中該活性劑為通式(II)的化合物。
31.一種局部給藥的藥物糊劑，該糊劑含有至少一種選自于通式(I)和通式(II)組的化合物的固體顆粒作活性劑，該粒度小于200μm而平均顆粒大于10μm；
至少一種增稠劑；至少一種濕潤(rùn)劑；和至少一種藥學(xué)上可接受的酸，該糊劑的pH值在2和6之間。
32.按照權(quán)利要求31的藥物糊劑，其中該糊劑還含有至少一種選自于下組中的添加劑鯨蠟醇、甘油酯衍生物、丙二醇及其混合物。
33.一種口服的藥物組合物，它含有在成粒劑存在下制成顆粒的活性劑，其中該活性劑為至少一種選自于通式(I)
和通式(II)
化合物的固體活性顆粒形式，并且該顆粒具有小于200μm的粒度和大于10μm的平均粒度。
34.按照權(quán)利要求33的組合物，其中該成粒劑選自于下組聚乙烯吡咯烷酮、水、乙醇、蔗糖、羥基纖維素及其混合物。
35.按照權(quán)利要求33的組合物，其中該制成顆粒的活性固體顆粒含有至少一種藥學(xué)上可接受的酸。
36.按照權(quán)利要求35的組合物，其中該藥學(xué)上可接受的酸選自于下組中檸檬酸、谷氨酸、琥珀酸、乙烷磺酸、乙酸、酒石酸、抗壞血酸、甲烷磺酸、延胡索酸、己二酸、蘋果酸及其混合物。
37.按照權(quán)利要求35的組合物，其中藥學(xué)上可接受的酸與該活性劑的重量比在0.01和0.5之間。
38.一種口服藥用組合物，它含有活性劑、濕潤(rùn)劑和一種淀粉衍生物，其中該活性劑為為至少一種選自于通式(I)
和通式(II)
化合物的固體活性顆粒形式，并且該顆粒具有小于200μm的粒度和大于10μm的平均粒度。
39.按照權(quán)利要求38的藥用組合物，它還含有至少一種藥學(xué)上可接受的酸。
40.按照權(quán)利要求38的藥用組合物，其中在成粒劑存在下把活性顆粒制成顆粒從而形成顆粒化活性劑，它含有2到99.97％(重量)的該活性化合物和0.03到10％(重量)的成粒劑。
41.按照權(quán)利要求40的藥用組合物，其中該成粒劑選自于下組聚乙烯吡咯烷酮、水、乙醇、蔗糖、羥基纖維素及其混合物。
42.一種口服的活性劑的液體懸浮液，該懸浮液包括至少一種選自于通式(I)
和通式(II)
化合物的固體顆粒作活性劑，并且該顆粒具有小于200μm的粒度和大于10μm的平均粒度；以及至少一種藥學(xué)上可接受的酸，該懸浮液的pH值在2和6之間。
43.按照權(quán)利要求42的懸浮液，其中該懸浮液的pH值在3和5之間。
44.按照權(quán)利要求42的懸浮液，它還含有一種成粒劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種藥物組合物,其中的藥物組合物含有至少一種選自于通式(Ⅰ)和通式(Ⅱ)組中的化合物作活性劑。該活性劑優(yōu)選為粒度小于200μm和平均粒度大于10μm的顆粒狀。該藥物組合物優(yōu)選用至少一種藥學(xué)上可接受的酸來穩(wěn)定。該藥物組合物尤其可用于治療免疫系統(tǒng)已遭致?lián)p害的或被抑制的患者的機(jī)會(huì)致病菌的感染以及治療吸蟲感染。
文檔編號(hào)A61K31/426GK1255060SQ98804900
公開日2000年5月31日 申請(qǐng)日期1998年5月6日 優(yōu)先權(quán)日1997年5月7日
發(fā)明者J·F·羅西尼奧爾 申請(qǐng)人:羅馬克實(shí)驗(yàn)室有限公司