專利名稱：化合物的制作方法
技術領域：
本發明特別涉及用原位抗體產生以提供增強選擇性特別是用于癌癥治療的基因定向的酶前體藥物療法(GDEPT)。
已知基于基因治療的前體藥物治療方法包括病毒定向的酶前體藥物療法(VDEPT)和基因定向的酶前體藥物療法(GDEPT)，后一個術語同時包括VDEPT和非病毒載體系統。VDEPT包括用帶有編碼能夠活化前體藥物酶基因的病毒載體靶向腫瘤細胞。病毒載體進入腫瘤細胞并且由細胞中的該酶基因表達酶，在GDEPT中，其它的方法如顯微注射-脂質體運送和受體介導的DNA攝入以及病毒可用于轉運編碼此酶的基因。
在VDEPT和GDEPT中，該酶基因都受能夠在哺乳動物細胞如腫瘤細胞中選擇性活化的DNA序列的轉錄調節(EP 415 731(Wellcome)；Huber等，美國國家科學院院報，88，8039-8043，1991)。盡管達到一定程度的選擇性，基因表達也可在非靶細胞中發生且當此方法用于活化前體藥物成為潛在細胞毒劑時此效應顯然不理想。此外，與用病毒啟動子相比，這些調節序列一般將導致該酶表達下降且此將導致在靶組織中轉化前體藥物能力的下降。
前體藥物活化酶在細胞內部的表達與定位具有缺點。前體藥物設計受到以下事實的嚴重限制，即前體藥物必須能夠穿過細胞膜并且在細胞內由活化酶轉成成藥之前是無毒的。大多數前體藥物利用親水基團以阻止進入細胞且因此減少細胞毒性。活化酶對前體藥物的轉移產生可進入細胞的較少親水性的藥物從而產生抗癌效應。當活化酶在細胞內部表達時不可用此方法。另一個缺點是缺乏胞內活化酶的靶細胞將難以攻擊因為它們不能夠產生活性藥物。為了達到此理想的“旁觀者活性”(或“鄰近細胞殺傷”)，該活性藥物將必須能夠擴散出含有活化酶的細胞以達到缺乏酶表達的靶細胞。當在細胞內部產生時許多活性藥物將不能夠逃離該細胞而完成此旁觀者效應。
已提出對GDEPT的一些改進從而克服上述的一些問題。首先描述了這樣的載體，據稱它們通過附著信號肽與跨膜區域到活化酶上而在靶細胞(WO 96/03515)表面上表達活化酶。如果可行，該方法將克服大細胞內部具有活化酶的問題但仍將不得不依賴于能夠選擇性表達于靶細胞中的轉錄調節序列從而限制細胞表達。如上述用這些序列也有缺點。其次，描述了導致該酶從靶細胞分泌的載體(WO 96/16179)。在此方法中該酶將能夠從其產生位點擴散出去因為其為細胞外的且沒有附著到細胞表面上。從靶位點擴散出來的酶將能夠在非靶位點活化前體藥物從而導致不必要的毒性。為了達到一定的選擇性，建議可使用這樣的酶前體，即通過病理學相關的蛋白酶將其切割以形成活性酶。通過此方法可能達到一定的選擇性但活化僅在靶位點發生是不可能的。此外一旦活化，該酶將仍然自靶位點擴散出去且因此遭受與上述相同的弊端。
對于GDEPT方法，可觀察到三個水平的選擇性。首先，在細胞感染時期具有選擇性從而僅靶向特異性的細胞類型。例如，可通過基因運載系統本身提供細胞選擇性。在國際專利申請WO 95/26412(UAB研究基金)中提出了這種選擇性的實例，其中描述了摻入細胞持異性配體的修飾腺病毒纖維蛋白的使用。細胞特異性靶向的其它實例包括體外轉移基因至特異細胞類群如淋巴細胞中和直接注射DNA至肌肉組織中。
第二檔次水平的選擇性是在細胞感染后例如通過使用細胞或組織特異性啟動子控制基因表達。如果該基因以選擇性的方式導入細胞類型中那么選擇與該細胞類型中活性相容的啟動子是重要的。
第三水平的選擇性可認為是表達的基因構建體的選擇性。此水平的選擇性到目前為止受到很少注意。在國際專利申請WO 96/16179(Wellcome Foundation)中，建議使用這樣的酶前體，即通過以病理學相關的蛋白酶切割此前體以形成活性酶。通過此方法可能達到一定的選擇性但活化將僅在此靶位點發生是不可能的。此外，一旦活化，該酶將仍然自由從靶位點擴散出來且因此在非靶位點遭受活化前體藥物相同的弊端而導致不必要的毒性。
還存在更為選擇性GDEPT系統的必要以減少由于錯誤的前體藥物活化而導致正常組織中不必要的效應。
本發明是基于這樣的發現，即抗體-異源性酶基因構建體可在胞內表達并用于GDEPT系統(或其它系統如AMIRACS-見下文)中從而由于抗體的特異性進行細胞靶向因而以選擇性方式運載可得到的細胞表面上的酶。此方法可任選與任何其它適當的特異性增強技術如靶細胞感染和/或組織特異性表達聯合使用。
根據本發明的一個方面，提供了編碼細胞靶向抗體和異源性酶的基因構建體從而用作哺乳動物宿主中的藥物，其中的基因構建體能夠表達抗體和酶作為哺乳動物宿主靶細胞中的綴合物且其中的綴合物可離開細胞然后選擇性定位于由該抗體所識別的細胞表面抗原。
根據本發明的另一方面，提供了編碼細胞靶向部分和異源前體藥物活化酶的基因構建體從而用作哺乳動物宿主中的藥物，其中的基因構建體能夠表達細胞靶向部分和異源前體藥物活化酶作為哺乳動物宿主細胞內的綴合物并且其中的綴合物定向離開此細胞然后選擇性定位于由該細胞靶向部分所識別的細胞表面抗原。
“細胞靶向部分”定義為通過識別細胞表面抗原而選擇性結合到宿主中特定細胞類型上的任何多肽或其片段。優選此細胞靶向部分為抗體。除抗體以外的細胞靶向部分包括配體如在國際專利申請WO97/26918(癌癥研究運動技術有限公司)中所述的用于配體介導的酶前體藥物治療中的那些配體，例如表皮生長因子、heregulin、c-erdB2和血管內皮生長因子，其中以后者為優選的。
“細胞靶向抗體”定義為通過識別細胞表面抗原而選擇性結合到宿主中特定細胞類型上的抗體或其片段。優選的細胞靶向抗體為實體瘤特異性抗體，更為優選為直腸結腸癌特異性抗體，更為優選為抗-CEA抗體，更為優選為抗體A5B7或806.077抗體，其中以806.077抗體為尤其優選的抗體。雜交瘤806.077抗體根據布達佩斯條約以許可號96022936于1996年2月29日保藏于歐洲動物細胞保藏中心(ECACC)，PHLS應用微生物及研究中心，Porton Down，Salisbury，Wiltshire SP4 OJG，英國。
抗體A5B7結合人癌胚抗原(CEA)并特別適用于靶向直腸結腸癌。A5B7可獲自DAKO有限公司，16 Manor Courtyard，HughendenAvenue，High Wycombe，Bucks HP13 5RE，英國。一般地，該抗體(或抗體片段)-酶綴合物應該至少為二價的，那即是說能夠結合至少2種腫瘤相關抗原(可相同或不同)。可通過已知的方法將抗體分子人源化如通過EP239400中公開的“CDR嫁接”或通過US 4816567中所述將例如來自鼠抗體的完整可變區嫁接到人恒定區上(“嵌合抗體”)。人源化抗體對于減少抗體(或抗體片段)的免疫原性可能是有用的。抗體A5B7的人源化版本已公開于國際專利申請WO 92/01059(Celltech)中。
產生單克隆抗體A5B7的雜交瘤保藏于歐洲動物細胞保藏中心，生物部，PHLS應用微生物及研究中心，Porton Down，Salisbury，Wiltshire SP4 OJG，英國。保藏日期為1993年7月14日且許可號為No.93071411。用本領域已知的標準技術如Fenge C，Fraune E &Schuegerl K在“來自培養動物細胞生物制品的制備”(Spier RE，Griffiths JR & Meignier B，編)Butterworth-Heinemann，1991，262-265中所述的技術及Anderson BL & Gruenberg ML在“商業制備單克隆抗體”(Seaver S.編)中所述技術可從保藏的雜交瘤中獲取抗體A5B7。
為了維持高水平抗體的產生，這些細胞可能需要通過有限稀釋不時地重新克隆。
“異源酶”定義為用于轉換已施用至宿主中底物的酶并且該酶天然不存在于宿主中的有關區域。該酶對于哺乳動物宿主也許是外源性的(如，細菌酶如CPG2)或者其可能天然不出現于有關的宿主部分中(例如，用溶菌酶作為ADEPT酶(為了解釋ADEPT，見下面)是可能的因為溶菌酶天然不出現于循環中，見US 5433955，Akzo NK)。有關的宿主部分指其中分布有底物的哺乳動物宿主的部分。優選的酶為適于ADEPT或AMIRACS(在癌癥病灶中通過失活營救劑的抗代謝物；見Bagshawe(1994)，細胞生物物理24/25，83-91)的酶組ADEPT酶為優選的。抗體導向的酶前體藥物治療(ADEPT)為已知的癌癥治療方法。ADEPT使用交聯至酶上的腫瘤選擇性抗體。將該綴合物施用至病人(通常靜脈內施用)，讓其它位于腫瘤病灶并從血液和其它正常組織中清除掉。然后將該前體藥物施用至病人，在此其通過(位于腫瘤病灶中的)酶而轉換成殺死腫瘤細胞-細胞毒藥物。
在96年7月14日公開的國際專利申請WO 96/20011中，我們提出了基于突變人酶的“反極性”ADEPT系統，與例如細菌酶相比，這些酶具有低免疫原性的優點。特定的宿主酶為人胰CPB(見例如，實施例15[D253K]人CPB &16[D253R]人CPB)及其前體藥物(見其中的實施例18及19)。將宿主酶突變從而得到與天然宿主酶相比就底物識別而言酶與前體藥物間相互作用方式的改變。在我們隨后的國際專利申請No PCT/GB 96/01975(97年3月6日公開為WO 97/07796)中描述了用于ADEPT的突變CPB酶/前體藥物組合的進一步工件。適于ADEPT的優選酶為任何一種CPG2或反極性的CPB酶，例如任一種[D253K]HCPB，[G251T，D253K]HCPB或[A248S，G251T，D253K]HCPB。優選的CPG2形式為其中的多肽糖基化位點受到突變從而在哺乳動物細胞中表達時防止或減少糖基化的多肽(見，WO 96/03515，癌癥研究運動技術中心)；這得到改良的酶活性。進一步的考慮來自這樣的酶如需要原區域(Pre-domain)促進正確折疊的CPB；這里原區域或者可單獨(反式)表達或者作為融合蛋白的一部分而表達且然后去除。
Sherwood等(1985)在歐洲生化雜志.，148，447-453中描述了從假單胞菌RS-16中大規模純化CPG2。CPG2可獲自應用微生物學及研究中心，Rorton Down，Salisbury，Wiltshire SP4 OJG，英國。CPG2也可通過重組技術獲得。CPG2的核苷酸序列編碼已由Minton.，N.P等.，在基因，31(1984)，31-38中公開。已報導在大腸桿菌(Chambers，S.P.等.，應用微生物學，生物技術.(1988)，29，572-578)和酵母(Clarke，L.E.等.，J Gen Microbiol，(1985)131，897-904)中此編碼序列的表達。全基因合成已由M.Edwards在動物生物技術實驗室(1987)，5，38-44中描述過。異源蛋白在大腸桿菌中的表達已由F.A.O.Marston在DNA克隆第III卷，實踐方法系列，(IRL出版社(編者D M Glover)，1987，59-88)中綜述過。酵母中蛋白的表達已由C.Guthrie和G R Fink編的酶學方法194卷，(學術出版社，1991)中綜述過。
只要靶抗原可被篩選并且適當的酶/前體藥物組合可以制備、當進行癌癥治療方法時本發明也可應用于其它治療領域。例如，炎癥疾病如類風濕性關節炎可通過例如用對滑液細胞選擇性的并融合至能夠將前體藥物形式的抗炎癥藥物轉換為抗炎癥藥物酶上的抗體加以治療，用抗體靶向類風濕性關節炎疾病已由Blakey等，1988，Scand在類風濕病學雜志、增刊、76，279-287中描述過。
抗體與酶之間的“綴合物”可為融合蛋白(共價鍵)或者此綴合物可通過抗體與原位形成的酶之間的非共價結合而形成、優選該綴合物為融合蛋白的形式，更為優選融合的抗體部分至少為二價的(用于與一價抗體相比改進的結合活性)。缺乏Fc部分的抗體構建體。尤其是Fab或F(ab′)2片段是優選的。對于CPG2融合(或與任何非單體酶的融合)，特定的考慮適用因為CPG2為二聚體酶并且該抗體優選為二價的因此存在2種分子間不必要竟爭二聚化的可能。因此，優選的CPG2融合為這樣的融合，即其中的融合蛋白通過連接抗體Fab重鏈的C末端(即缺乏鉸鏈區)至CPG2分子的N-末端而形成；然后這些Fab-CPG2分子中的2個通過CPG2二聚化區域而二聚化從而形成(Fab-CPG)2綴合物。對于具有單體酶的抗體構建體，F(ab′)2片段，尤其是具有人IgG3鉸鏈區的F(ab′)2片段是優選的。抗體與酶之間的融合可任選通過短肽接頭例如(G4S)3來完成。優選的融合構建體為其中的酶經其重鏈或輕鏈融合到此抗體C-末端的那些酶，其中以經抗體重鏈的融合為優選的。因此，優選的基因構建體為用作這里所述藥物的基因構建體，其中的抗體-酶CPG2綴合物為其中的酶經其重鏈或輕鏈融合至抗體C-末端的融合蛋白，由此為表達時，編碼綴合物的二聚化通過CPG2上的二聚化區域發生。更為優選的基因構建體為用作藥物的這樣的基因構建體，其中的融合蛋白經過連接抗體Fab重鏈的C-末端至CPG2分子的N-末端上以形成Fab-CPG2而形成，由此，當表達時2個Fab-CPG2分子經CPG2而二聚化從而形成(Fab-CPG2)2綴合物。在本發明的另一實施方案中，用作藥物的優選基因構建體為這樣的構建體，其中的羧肽酶選自[D253K]HCPB，[G251T，D253K]HCPB或[A248S，G251T，D253K]HCPB。
應當注意到如果獲得單體形成的天然多聚體酶而同時基本上維持酶活性是可能的，那么單體形式的酶可用于形成本發明的綴合物。類似地，應當注意到如果獲得多聚體形式的天然單體酶而同時基本上維持酶活性是可能的，那么多聚體形式的酶可用于形成本發明綴合物。
此綴合物在此表達后注定要通過用分泌引導序列而離開此細胞，當該綴合物穿過細胞膜時被切割掉。優選此分泌引導區為抗體天然存在的分泌引導區。
根據本發明的另一方面，提供了用編碼細胞靶向抗體和異源酶的基因構建體制備用于哺乳動物宿主中癌癥治療的藥物，其中的基因構建體能夠表達抗體和酶作為哺乳動物宿主靶細胞中的綴合物，并且其中的綴合物可離開細胞然后選擇性定位于由該抗體所識別的細胞表面抗原。
任何適當的運載系統可應用于運載本發明的基因構建體，包括病毒和非病毒系統，病毒系統包括反轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺伴隨病毒、牛痘、單純皰疹病毒、HIV、小鼠微小病毒、乙型肝炎病毒和流感病毒。非病毒系統包括非復合DNA、DNA-脂質體復合體、DNA-蛋白復合體和DNA-包被的金顆粒。
反轉錄病毒載體缺乏免疫原性蛋白并且沒有預先存在的宿主免疫性但限于感染正在分裂的細胞。反轉錄病毒已用于臨床試驗(Rosenberg等.，N.Engl.J.Med.，1990，323570-578)。反轉錄病毒由包裹于源自宿主細胞膜包括中的RNA基因組和病毒蛋白所組成。為了基因表達，其必需首先反轉錄其正鏈RNA基因組成雙鏈DNA，然后用反轉錄病毒顆粒中包含的反轉錄酶和整合酶蛋白將其整合入宿主細胞的DNA中。整合的原病毒能夠用宿主細胞裝置進行基因表達。
鼠的血病病毒受到廣泛使用(Miller等.，酶學方法.，1993，217581-599)。通過去除gag、pol和env基因從而為有關的有效負載騰出空間并排除該病毒的復制功能而構建反轉錄病毒載體。去除毒性編碼的mRNAs并且此去除了對轉導細胞的任何潛在的免疫應答。常包括編碼抗生素抗性的基因作為篩選的手段。例如也可包括啟動子和增強子功能以在體內施用后提供組織特異性表達。在長末端重復中含有的啟動子與增強子功能也可使用。
這些病毒僅可在病毒包裝細胞系中產生。包裝細胞系可通過以下方式加以構建，即穩定插入缺失的病毒基因(gag、pol和env)至細胞中從而他們位于不同的染色體上以防止重組。包裝細胞系用于通過插入重組原病毒DNA構建發生細胞系，這將產生含有有關有效負荷基因的復制缺陷的逆轉錄病毒。用標準的用于DNA轉移和攝入的技術(電穿孔、鈣沉淀等)將含有殼體化序列和目的基因的在小部分gag基因兩側含有長末端重復序列的質粒DNA轉染入包裝細胞系。已經利用該方法的變異體降低產生復制活性病毒的可能性(Jolly，D.，癌癥基因治療，1994，1，51-64)。此病毒的宿主細胞范圍通過包被基因(env)加以測定并且具有不同細胞特異性的env基因的替代可以利用。摻入適當的配體至包被蛋白中也可用于靶向。
施用可通過任何適當的技術完成，如通過直接注射病毒至組織中而體外轉導患者細胞和通過施用反轉錄病毒生產者細胞。
體外方法的缺點在于其要求在患者細胞的組織培養物中分離和維持，但其具有這樣的優勢，即基因轉換的程度可容易地定量并且可靶向特定的細胞類群。此外，可達到高比例的病毒顆粒對靶細胞的比例且因此提高轉導效率(Anderson等.，人類基因治療.，1990，1331-341；Rosenberg等.，N.Engl.J.Med.，1990，323570-578；Culver等.，人類基因治療.，1991，2107-109，Nienhuis等.，癌癥，1991，672700-2704，Anderson等.，人類基因治療.，1990，1331-341，Grossman等.，Nat.Genet.，1994，6335-341，Lotze等.，人類基因治療，1992，3167-177；Lotze，M.T.，細胞移植，1993，233-41；Lotze等，人類基因治療.，1994，541-55和美國專利5399346(Anderson)。在有些情況下直接在體內導入病毒是必需的。反轉錄病毒已用于治療腦瘤，其中的反轉錄病毒僅感染正在分裂的細胞(腫瘤細胞)的能力可能是優別優越的。
為了增加效率，Oldfield等在人類基因治療1993，439-69中提出將反轉錄病毒生產者細胞系直接施用至患者腦瘤中。鼠生產者細胞將在腦瘤中存活一些天，并將分泌能夠轉錄周圍腦瘤的反轉錄病毒。帶有皰疹病毒胸苷激酶基因的病毒使細胞對丙氧鳥苷的殺傷易感，該化合物被胸苷激酶代謝成細胞毒性化合物。反轉錄病毒的專利參考為EP334301，WO 91/02805及WO 92/05266(Viagene)和；US 4650764(威斯康星大學)。
人腺病毒感染已被描述過(見Horwitz，M.S.，病毒學，第2版.Raven出版社，紐約，1990，pp.1723-1740)。大多數成年人以前曾暴露于腺病毒并且具有抗腺病毒抗體。這些病毒具有雙鏈DNA基因組，并且不隨宿主細胞分裂而復制。
腺病毒載體具有優越的特性。它們能夠轉導廣泛的人組織并且可在正在分裂與非正在分裂細胞中獲得高水平的基因表達。多種施用途徑可以使用，包括靜脈內、膽管內、腹膜內、囊泡內(intravesicular)、顱內和椎管內注射，和直接進行靶器官注射。因此，基于解剖邊界的靶向是易行的。
腺病毒基因組編碼大約15種蛋白并且感染包括纖維蛋白結合至細胞表面受體。病毒衣殼的五鄰體基涉及細胞表面上的整合素受體區域(α3β3，或β3β5)從而導致此病毒的內化。病毒DNA進入細胞核并開始轉錄而無細胞分裂。表達與復制在E1A和E1B基因控制之下(見Horwitz，M.S.，病毒學，第2版，1990，pp.1723-1740)。去除E1基因使病毒復制失活。腺病毒蛋白的表達同時導致可能限制效應特別是對重復施用的限制效應的免疫應答。然而，最近的方法(其中的其它腺病毒基因如E2a基因(其控制纖維柄及許多其它病毒蛋白的表達)也從病毒基因組中去除)可去除或大大降低許多種這些病毒蛋白在靶細胞中的表達。
腺病毒血清型2和5已廣泛用于載體構建。Bett等.，美國自然科學院院報，1994，918802-8806使用了缺乏E1和E3腺病毒基因的腺病毒血清型5載體系統。293人胚腎細胞系已被加工成表達E1蛋白并可因此反式互補E1-缺陷性的病毒基因組。此病毒可從293細胞培養基中分離并通過有限稀釋噬斑分析加以純化(Graham，F.L.和Prevek，L.分子生物學方法基因轉移和表達方法，Humana出版社，1991，pp.109-128)。重組病毒可在293細胞系培養物中培養并通過裂解感染細胞和氯化銫密度梯度離心純化而分離。293細胞制備重組病毒的一個困難是由于E1基因額外的側翼區，它們在病毒顆粒產生過程中可能產生復制感受態的腺病毒(RCA)。盡管此材料僅為野生型腺病毒并且為非復制活性、但其對所需腺病毒材料終產量具有明顯影響并導致制備成本增加、制備過程中的質量控制問題及為了臨床使用的批量接受問題。已開發出別的細胞系如PER.C6，其較293細胞系具有更為有限的E1基因(即含有不位于病毒序列兩側的序列)，這將不允許有產生RCA的重組事件且因此具有克服上述病毒產生問題的可能。
由于免疫系統清除和靶細胞分裂過程中的稀釋喪失，腺病毒載體具有相對較短時間轉基因表達的缺點但載體設計的改進又是所預期的。腺病毒的專利參考有WO 96/03517(Boehringer)，WO 96/13596(Rhone Poulenc Rorer)；WO 95/29993(密西根大學)和；WO96/24969(Canji)。Bilbao等在Exp.Opin.Ther.Patents，1997，7(12)1427-1446中綜述了腺病毒載體用于癌癥基因治療的最新進展，包括開發降低免疫原性的策略。嵌合腺病毒/反轉錄病毒載體和有條件(或限制的)復制重組腺病毒系統。
腺伴隨病毒(AAV)(Kotin，R.M.，人類基因治療.，1994，5793-801)為能夠整合入很寬宿主范圍的非分裂細胞基因組中的單鏈DNA非自主復制的細小病毒。AAV沒有顯示出與人類疾病相關并不誘發免疫應答。
AAV具有2種不同的生活周期時相。野生型病毒將感染宿主細胞，整合并保持潛伏狀態。在腺病毒存在下，病毒的裂解相受到誘導，其依賴于早期腺病毒基因的表達，并導致活性病毒的復制。AAV基因組由2個開放閱讀框(稱為rep和cap)所組成，此閱讀框兩側為末端反向重復(ITR)序列。rep區域編碼四種蛋白，其介導AAV復制、病毒DNA轉錄和用于宿主基因組整合的核酸內切酶功能。rep基因為病毒復制所需的唯一AAV序列。cap序列編碼形成病毒衣殼的結構蛋白。ITRs含有病毒復制起點、提供衣殼化信號、和參與病毒DNA整合。已開發用于基因治療的重組、復制缺陷型病毒缺乏rep和cap序列。復制缺陷的AAV可通過將AAV復制必需的分離的元件共轉染入許可的293細胞系而加以制備。有關AAV的專利參考包括WO 94/13788(匹茲堡大學)和US 4797368(美國衛生部)。
來自痘病毒的基因治療載體已經描述過(Moss，B.和Flexner，C.，免疫學年鑒.，1987，5305-324；Moss，B.，病毒學，1990，pp.2079-2111)。牛痘為大型的在感染細胞的胞漿中復制的包被的DNA病毒。感染來自許多不同組織的非正在分裂和正在分裂細胞，并觀察未整合基因組的基因表達。重組病毒可通過將轉基因插入來源于牛痘的質粒中并且將此DNA轉染入牛痘感染的細胞中而制備，其中的同源重組導致病毒產生。明顯的缺點是其誘發對150到200種病毒編碼的蛋白的宿主免疫應答，導致重復施用困難。
單純皰疹病毒為適于基因轉移的在感染細胞的細胞核中復制的大型雙鏈DNA病毒(見Kennedy，P.G.E和Steiner，I.，Q.J.Med.，1993，86697-702)。代替包括廣泛的宿主細胞范圍，感染正在分裂和非正在分裂的細胞，并且大的外源DNA序列可通過同源重組插入病毒基因組中。缺點是難以去除病毒制品中復制活性的病毒和潛在的免疫應答。病毒胸苷激酶基因的缺失使病毒在具有低水平胸苷激酶的細胞中復制缺失。正在進行活性細胞分裂的細胞(如，腫瘤細胞)具有足夠的胸苷激酶活從而產生復制。Cantab藥丁有一項有關皰疹病毒的公開的專利申請(WO 92/05263)。
許多種其它病毒，包括HIV、小鼠細小病毒、乙型肝炎病毒和流感病毒被認為是用于基因轉移的可能載體(見Jolly，D.，癌癥基因治療，1994，151-64)。
也已提出用特異性靶向和復制于低氧環境(如腫瘤壞死中心中所見的環境)中的減毒傷害沙門氏菌作為基于前體藥物酶治療(稱為TAPETTM的腫瘤擴增的前體藥物酶治療)的基因轉換載體并正由Vion藥丁開發之中。此系統為下述的病毒和非病毒轉移方法提供了進一步的基因轉移方案。
非病毒DNA轉移策略也是可用的。這些DNA轉移系統包括未復合的質粒DNA、DNA-脂質體復合體、DNA-蛋白復合體，和DNA包被的金顆粒。
純化的核酸可直接注射入組織并導致例如肌肉組織中暫時的基因表達，這對再生肌肉尤為有效(Wolff等，科學1990，2471465-1468)。Davis等.，在人類基因治療.，(1993，4733-740)中公開了直接將DNA注射入成熟肌肉中。骨骼肌和心肌一般是優選的。專利參考有WO 90/11092，US 5589466(Vical)和WO 97/05185(用于注射的生物可降解DNA浸滲的水凝膠，Focal)。
金顆粒上的質粒DNA可用基因槍“打”入細胞(如.，表皮或黑素瘤)。將DNA共沉淀于金顆粒上且然后用電火花或高壓氣體作為推力打入(Fynen等.，美國自然科學院院報，1993，9011478-11482)。通過用利用多-針排列的電穿孔探針和脈沖旋轉電場，電穿孔也用于使DNA能夠轉移入實體瘤中(Nishi等，癌癥研究.，1996，561050-1055)。已要求保護向皮下腫瘤的高效基因轉換，其與腫瘤內注射方法相比具有顯著的細胞轉染增強功能和更好的分布特征。
脂質體通過用疏水分子環繞親水分子以利于細胞進入而發揮作用。脂質體是由脂類所構成的單層或多層球體。脂類的組成和制備方法影響脂質體結構。其它分子可摻入脂膜。脂質體可為陰離子或陰離型。Nicolau等.，美國自然科學院院報.，1983，801068-1072公開了由注射入大鼠中的陰離子脂質體進行胰島素的表達。除非另有靶向，否則陰離子脂質體主要靶向肝臟的網狀內皮細胞。分子可摻入脂質體的表面以改變其行為，例如細胞選擇性轉換(Wu G.Y.和Wu，C.H.生物化學雜志.，1987，2624429-4432)。
Felgner等.，美國自然科學院院報，1987，847413-7417公開了陽離子脂質體、證明其通過靜電相互作用而結合核酸并顯示出細胞進入當注射于至器官的流入血流中時，靜脈內注射陽離子脂質體導致大多數器官的轉基因表達。可通過氣溶膠施用陽離子脂質體以靶向肺上皮(Brigham等.，美國醫學雜志.，1989，289278-281)。脂質體的專利參考為WO 90/11092、WO 91/17424、WO 91/16024、WO 93/14788(Vical)和；WO 90/01543(Intracel)。
用陽離子脂質體轉基因轉移的體內研究已在下面文獻中發表包括Nabel等.，人類基因治療綜述.，1994，579-92；Hyde等.，自然，1993，362250-255和；Conary等.，臨床研究雜志.，1994，931834-1840)。
正在研究微粒作為轉移DNA至吞噬細胞的系統，這種方法已由Pangaea藥丁在其ENDOSHERETM微囊化轉移系統中應用過，該系統已用于更為有效地轉錄吞噬細胞如攝入微球體的巨噬細胞。微球體將編碼強免疫原性肽的質粒DNA，這些肽表達時通過細胞表面上的MHC分子導致肽顯示，這可刺激抗這些肽和含有相同表位蛋白序列的免疫應答。該方法目前旨在抗腫瘤和病原體疫苗開發中的潛在作用但可能具有其它可能的基因治療應用。
用與合成聚合物相同的方式包裝DNA，該方法用于包裝能夠均一自我裝配成病毒樣顆粒(VLPs)的DNA天然病毒外殼蛋白。人多形瘤病毒的主要結構外殼蛋白的VP1可作為重組蛋白表達并且能夠在自我裝配過程中將質粒DNA包裝進入VLP。得到的顆粒可隨后用于轉導各種細胞系，而預先研究顯示對此基于VP1的VLPs很少有免疫原性應答。這些系統可提供合成聚合物非病毒載體和別的病毒轉移系統之間的具有重要意義的中間體因為它們可提供組合優勢如制備的簡單性和高水平的轉導效率。
為了提高基因轉移的特異性和治療基因的表達，已經單獨和與許多先前描述的轉移系統一起研究將靶元件包括進轉移載體和調節表達元件的使用。
也已經制備了DNA載體中的一些改進并且有可能適用于所有的非病毒轉移系統。這些包括由RPR Gencell報導的超螺旋小環(既無細菌的復制起點又無抗生素抗性基因且因此盡管其表現出高水平的生物污染物但相當安全)、由Copernicus Gene Systems Inc開發的附加型表達載體(復制附加型表達系統，其中的質粒在細胞核內染色體外擴增并因此避免了整合事件)和由Progenitor開發的T7系統(嚴格的細胞質表達載體，其中的載體本身用第一啟動子產生的聚合酶表達噬菌體T7 RNA聚合酶且治療基因由第二個T7啟動子所驅動)。對DNA載體技術的其它更為一般的改進包括用順式作用元件達到高水平的表達(Vical)、源自alphoid重復DNA的序列提供每細胞周期一次的復制和核靶向序列(來自EBNA-1基因(Calos于Stanford，用Megabios)；SV40早期啟動子/增強子或附著于DNA上的肽序列)。
基于通過連接到DNA上配體的細胞受體識別的靶向系統已由Michacl，S.I.和Curiel，D.T.，在基因治療，1994，1223-232中描述過。用該受體識別的配體，此DNA變得選擇性結合并內在入靶細胞中(Wu G.Y.和Wu，C.H.生物化學雜志.，1987，2624429-4432)。聚L-賴氨酸(PLL)，一種聚陽離子，已用于通過化學交聯方法偶聯多種蛋白配體至DNA。靶向系統已由下列文獻中發表，包括Zenke等.，美國自然科學院院報.，1990，87，3655-3659，使用轉鐵蛋白受體；Wu G.Y.和Wu，C.H.生物化學雜志.，1987，2624429-4432，使用脫唾液酸血清類粘蛋白的受體和Batra等.，基因治療，1994，1255-260，用細胞表面碳水化合物。試劑如氯奎或共同定位的腺病毒可用于減少溶酶體中DNA的降解(見Fisher，K.J.和Wilson，J.M.，生化雜志.，1994，299，49-58)。Cristiano等(美國自然科學院院報.，1993，9011548-11552)構建了腺病毒-DNA-配體復合體。有關受體介導的內容作用的專利參考為WO 92/05250(脫噬液酸糖蛋白，康涅狄格大學)和US 5354844(轉鐵蛋白受體，Boehringer)。
DNA和配體可包被于腺病毒的表面以創建包被的腺病毒(Fisher，K.J.和Wilson，J.M.，生化雜志.，1994，299，49-58)。然而，用于DNA進入的2種受體途徑(配體受體和腺病毒受體)的存在降低了此轉移系統的特異性，但腺病毒受體途徑可用抗腺病毒纖維蛋白的抗體作為連接至DNA上的手段而排除(Michael，S.I.和Curiel，D.T.，在基因治療，1994，1223-232)。用純化的內體裂解(endosomalytic)蛋白而不是完整的腺病毒顆粒是另一種選擇(Seth，P.，病毒學雜志.，1994，681204-1206)。
本發明基因構建體在其靶位點的表達優選在轉錄調節序列(TRS)的控制下。TRS為任選與增強子和/或控制元件組合的啟動子如下述的遺傳開關。
TRS的一個實例為這樣的“遺傳開關”，其一旦被轉移入靶細胞中可用于控制本發明基因構建體的表達。用原核調節元件控制更高等真核細胞中的基因表達(為本發明優選的)已由Gossen等在TIBS，1993年12月18日，471-475中綜述過。適當的系統包括大腸桿菌lac操縱子且特別優選為大腸桿菌四環素抗性啟動子。四環素系統的文獻包括Gossen等(1995)科學268，1766；Damke等(1995)，酶學方法257，學術出版社；Yin等(1996)生化年鑒235，195和；專利US5464758、US 558 9362、WO 96/01313和WO 94/29442(Bujard)。基于蛻皮激素的開關(國際專利申請No.PCT/GB 96/01195，公開號WO 96/37609，Zeneca)為別一種選擇。其它選擇方案如下。ConnaughtLaboratories(WO-93/20218)描述了一種合成可誘導的真核啟動子，其包括至少2種不同類的可誘導元件。Rhone-Poulenc Rorer(WO96/30512)描述了有關四環素應用于有條件的基因表達系統。Ariad(WO 94/18317)描述了一種已顯示其體內活性的基于蛋白二聚化的系統。Baylor醫學院的Bert O′Melley(WO 93/2343、US 5364791、WO 97/10337)描述了基于用修飾的類固醇受體的分子開關。白頭研究所具有NF-κB可誘導的基因表達系統(WO 88/05083)。BatelleMemorial描述了應激可誘導的啟動子(歐洲專利EP 263908)。
不依賴于細胞類型的TRS實例包括如下內容巨細胞病毒啟動子/增強子、SV40啟動子/增強子和反轉錄病毒長末端重復啟動子/增強子。依賴于細胞類型(以達到額外靶向程度)的TRS的實例包括以下啟動子用于靶向直腸結腸、肺和乳腺的癌胚抗原(CEA)；用于靶向轉化肝細胞的α-甲胎蛋白(AFP)；用于靶向成神經細胞瘤的酪氨酸羥化酶、乙酰膽堿轉移酶或神經元特異性的烯醇化酶；用于靶向胰臟的胰島素和；用于靶向膠質母細胞瘤的膠質纖維酸性蛋白。也可使用一些在有些腫瘤中選擇性表達的癌基因，如乳腺中的HER-2(neu或c-erbB2和神經母細胞瘤中的N-myc。
因此，用作藥物的優選基因構建體為包括轉錄調節序列的構建體，此調節序列包括為控制此基因構建體表達遺傳開關的啟動子和控制元件。優選的遺傳開關控制元件受四環素或蛻皮素存在的調節。優選的啟動子依賴于細胞類型并且選自下面的啟動子癌胚抗原(CEA)；α-甲胎蛋白(AFP)；酪氨酸羥化酶；乙酰膽堿轉移酶；神經元特異性烯醇化酶；胰島素；膠質纖維酸性蛋白；HER-2/neu；c-erbB2；和N-myc。優選用作這里所述藥物的基因構建體包裝于腺病毒中從而轉移至哺乳動物宿主中。靶向基因治療的一般綜述列于Douglas等.，腫瘤靶向，1995，167-84。
由本發明基因構建體編碼的抗體可為任何形式的抗體構建體如F(ab′)2；F(ab′)、Fab、Fv、單鏈FV及V-min。應考慮任何適當的抗體構建體，例如新近描述的抗體片段為“L-F(ab)2”由Zapata(1995)在蛋白質工程，8，1057-1062中所述。也應考慮二硫鏈結合的Fvs。對于基于CPG2酶的構建體，經過酶二聚化而二聚化的Fab片段構建體是優選的。非-人抗體可人化而用于人類以降低宿主免疫反應。人化抗體、相關片段或抗體結合結構為主要由來源于人免疫球蛋白序列的結構框架所組成，其中的免疫球蛋白序列支持抗原結合位點(互補決定區或CDRs)內或周圍的非來源于人的氨基酸序列。例如，在WO 91/09967、EP 0328404和Queen等.，美國自然科學院院報86，10029，Mountain和Adair(1989)生物技術與遺傳工程綜述10，1(1992)中已詳述過適當的方法學，盡管也可考慮其它的人化方法如抗體表面殘基的鑲嵌(veneering)(EP 519596，Merck/NIH，Padlan等)。
根據本發明的另一方面，提供了設計用于哺乳動物宿主中匹配的2種組分系統，其中的組分包括(i)包括編碼細胞靶向抗體和異源前體藥物活化酶基因構建體的第一種成分，其中的基因構建體能夠表達抗體和酶作為哺乳動物宿主靶細胞中的綴合物并且其中的綴合物可離開此細胞然后選擇性定位于由該抗體所識別的細胞表面抗原和；(ii)包括可由酶轉換成活性藥物的前體藥物的第2種成分。
抗體導向的酶前體藥物療法(ADEPT)為已知的癌癥治療方法。ADEPT使用交聯至酶上的腫瘤選擇性抗體。將此綴合物施用至患者(通常靜脈內施用)，使其定位于腫瘤病灶并從血液和其它正常組織下清除。然后將前體藥物施用至患者，由此酶(位于腫瘤病灶)將其轉換成殺死腫瘤細胞的細胞毒性藥物。
本發明可應用至任何的ADEPT系統。ADEPT系統適當的實例包括基于任何下面的酶的那些系統羧肽酶G2；羧肽酶A；氨肽酶；堿性磷酸酶；糖苷酶；β-葡萄醛酸酶；青霉素酰胺酶；β-內酰胺酶；半胱氨酸脫氨酶；硝基還原酶；或突變的宿主酶包括羰肽酶A、羧肽酶B和核糖核酸酶。關于ADEPT系統的適當文獻包括MeltonRG(1996)，國立癌癥研究院院報88，1；Niculescu-Duvaz I(1995)，當今藥物化學2，687；Knox RJ(1995)臨床免疫治療，3，136；WO 88/07378(RCT)；Blackey等.，癌癥研究，56，3287-92，1996；US 5587161(CRCT和Zeneca)；WO 97/07769(Zeneca)；和WO95/13095(Wellcome)。此異源酶可以為催化抗體的形式；參見例如EP 745673(Zeneca)。有關ADEPT系統的綜述文章包括Hay &Denny(1996)，未來藥物，21(9)，917-931和Blakey(1997)，Exp.Opin.Ther.Patents，7(9)，965-977。
優選匹配的2種組分系統為這樣的系統其中的第一種組分包括編碼異源酶CPG2的基因；且第二種組分的前體藥物選自N-(4-[N，N-雙(2-碘乙基)氨基]苯氧羰基)-L-谷氨酸，N-(4-[N，N-雙(2-氯乙基)氨基]-苯氧羰基)-L-谷氨酸-γ-(3，5-二羧基)酰基苯胺或N-(4-[N，N-雙(2-氯乙基)氨基]-苯氧羰基)-L-谷氨酸或其藥物上可接受的鹽。使用CPG2的優選前體藥物描述于下面的來自Zeneca有限公司和癌癥研究運動技術有限公司的美國專利US 5714148，US 5405990、5587161 & 5660829。
在本發明的另一方面中，提供了用于轉移細胞毒性藥物至病灶的方法，包括將包括這里所述的基因構建體的第一種組分施用至宿主；然后給宿主施用第二種組分，該組分包括可由第一種組分編碼的異源酶轉換成細胞毒性藥物的前體藥物的第二種組分。轉移細胞毒性藥物至病灶的優選方法為這樣的方法、其中的第一種組分包括編碼異源酶CPG2的基因；并且第二種組分前體藥物選自N-(4-[N，N-雙(2-碘乙基)氨基]苯氧羰基)-L-谷氨酸，N-(4-[N，N-雙(2-氯乙基)氨基]-苯氧羰基)-L-谷氨酸-γ-(3，5-二羧基)酰基苯胺或N-(4-[N，N-雙(2-氯乙基)氨基]-苯氧羰基)-L-谷氨酸或其藥物上可接受的鹽。
在此使用的簡稱包括AAV 腺伴隨病毒ADEPT 抗體導向的酶前體藥物療法AFP α-甲胎蛋白AMIRACS 在癌癥病灶具有挽救劑失活的抗代謝物APS 過硫酸銨b.p.堿基對BPB 溴酚藍CDRs互補決定區CEA 癌胚抗原CL 抗體輕鏈恒定區CPB 羧肽酶BCPG2羧肽酶G2CPG2R6 被突變以防止在真核細胞中表達時糖基化的羧肽酶G2，見實施例1dDAB 底物3，3′-2氨基聯苯胺四鹽酸DEPC焦碳酸二乙酯DMEMDulbecco改進的Eagle培養基ECACC 歐洲動物細胞保藏中心EIA 酶免疫分析ELISA 酶聯免疫吸附分析FAS 補充的甲酰四氫葉酸FCS 胎牛血清Fd 任選含有鉸鏈區的Fab、Fab′或F(ab′)2的重鏈GDEPT 基因導向的酶前體藥物療法HAMA人抗小鼠抗體HCPB人羧肽酶B，優選為胰臟(來源)(IgG)鉸鏈 含有連接2條重鏈半膠氨酸的富含脯氨酸的短肽HRPO或HRP 辣根過氧化物酶IRES內部核糖體進入位點MTX 氨甲喋呤MCA 非特異性交聯反應抗原NCIMB 國家工業及海洋微生物保藏有限公司OPD鄰苯二胺PBS磷酸緩沖鹽溶液PCR聚合酶鏈式反應PGPN-(4-[N，N-雙(2-氯乙基)氨基]-苯氧羰基)-L-谷氨酸preproCPB 具有N-末端前導序列的原CPBproCPB 具有其N-末端原區的CPBscFV 單鏈FvSDS-PAGE 十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳SSC檸檬酸鈉鹽TBSTris-緩沖鹽Temed N，N，N′，N′-四甲基乙二胺TFA三氟乙酸TRS轉錄調節序列VDEPT 病毒導向的酶前體藥物療法VH 抗體重鏈的可變區VK 抗體輕鏈的可變區。
在本說明書中，應當考慮特異氨基酸序列的保守氨基酸類似物，其維持本發明組分的相關生物學特性但在序列中有一個或更多個保守氨基酸替代、缺失或添加的差異。然而，特異性列出的氨基酸序列是優選的。典型的保守氨基酸替代列表如下。原始的氨基酸 典型的取代優選的取代Ala(A)Val；Leu；Ile ValArg(R)Lys；Gln；Asn LysAsn(N)Gln；His；Lys；Arg GlnAsp(D)Glu GluCys(C)Ser SerGln(Q)Asn AsnGlu(E)Asp AspGly(G) Pro ProHis(H) Asn；Gln；Lys；Arg ArgIle(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；Leu正亮氨酸Leu(L) 正亮氨酸；Ile；Val； IleMet；Ala；PheLys(K) Arg；Gln；AsnArgMet(M) Leu；Phe；IleLeuPhe(F) Leu；Val；Ile；Ala LeuPro(P) Gly GlySer(S) Thr ThrThr(T) Ser SerTrp(W) Tyr TyrTyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser PheVal(V) Ile；Leu；Met；Phe； LeuAla；正亮氨酸氨基酸命名如下。丙氨酸 Ala A精氨酸 Arg R天冬酰胺 Asn N天冬氨酸 Asp D半胱氨酸 Cys C谷氨酸 Glu E谷氨酰胺 Gln Q甘氨酸 Gly G組氨酸 His H異亮氨酸 Ile I亮氨酸 Leu L賴氨酸 Lys K甲硫氨酸 Met M苯丙氨酸 Phe F脯氨酸Pro P絲氨酸Ser S蘇氨酸Thr T色氨酸Trp W酪氨酸Tyr Y纈氨酸Val V任何氨基酸Xaa X在此說明書中，應該考慮具體核酸序列的核酸變異(缺失、替代和添加)，這些變異的核酸在嚴格的條件下維持與這里提及特異性序列雜交的能力。嚴格的條件定義為6×SSC，0.1％SDS于60℃5分鐘。然而，具體列出的核酸序列是優選的。應當考慮天然核酸結構的化學類似物如“肽核酸”(PNA)可能為可接受的等價物，特別是為了無需翻譯蛋白的目的(Wittung(1994)自然368，561)。
本發明現將參照下面的非限定實施例加以說。溫度為攝氏度。

圖1顯示融合基因構建體的圖解，該融合基因構建體包括A5B7抗體重鏈Fd片段，其C-末端通過彈性的(G4S)3肽接頭連接至CPG2多肽的N-末端上。SS代表信號序列。L代表接頭序列。CPG2/R6代表其糖基化位點經突變而失活的CPG2如文中所述。圖2a顯示(Fab-CPG2)2融合蛋白的圖解，其中的二聚化通過2個CPG2分子間的非共價鍵而發生。圖2b顯示F(ab′)2抗體片段的圖解。圖3顯示分泌的融合蛋白材料基于細胞的ELISA分析。僅僅CEA陽性線與增加量的加入融合蛋白具有增加的結合水平，而CEA陰性細胞線整個過程中僅具有恒定的背景結合。縱軸代表在490nm處測得的光密度讀數且橫軸代表以ng蛋白計量的加入融合蛋白的量。該圖顯示獲自實驗的數據，其中眾多的細胞系和陰性對照(無細胞)用實施例6中所述的細胞分析方法與增加量的融合蛋白孵育。結果顯示僅僅LoVo(CEA陽性)細胞系顯示出相應于增加量加入融合蛋白的增加的OD490讀數。所有其它的細胞系(CEA陰性)和對照(無細胞)僅僅顯示出不隨融合蛋白加入而增加的背景OD490nm讀數。這些結果提供這樣的證據，即該融合蛋白材料特異性地以劑量依賴性的方式結合CEA陽性細胞系并且不結合CEA陰性細胞系。圖4顯示分泌至重組LoVo腫瘤細胞融合蛋白的保留。縱軸代表在490nm處測得的光密度讀數并且橫軸代表以ng/ml蛋白測得的加入抗-CEA抗體(IIE6)的量。實驗用不同的細胞系按實施例7中所述進行，包括重組LoVo和Colo 320DM細胞系(其自身分泌融合蛋白)和對照不分泌融合蛋白的母本LoVo細胞系。首先，將細胞系固定，并且清洗以去除存在的上清和未結合物質，然后加入逐漸增加濃度的抗-CEA抗體(IIE6)至固定細胞中。按文中所述開發此方法以測定任何分泌材料的保留水平和是否進一步加入的抗體將增加此信號。結果顯示不加入抗-CEA抗體，對照母本Lovo線僅僅顯示出背景OD490nm讀數(如預期的)而重組的LoVo線得到很強的OD490nm讀數表明此融合蛋白物質保留于CEA陽性的LoVO細胞中。CEA陰性重組Colo 320DM較LoVo細胞得到更為微弱的讀數而此信號高于背景(可能由于在早期分析方法中分泌抗體沒有固定)。加入至固定細胞中的逐漸增加濃度的抗-CEA抗體(IIE6)在母本LoVo細胞的情況中顯示出劑量相關的應答。因此表明它們為CEA陽性且可結合CEA結合物質(如如果存在或添加的融合蛋白)。重組的Colo320DM和Lovo細胞用逐漸增加量的抗體時在總的OD490信號中幾乎沒有表現出增加，除了在最高抗體劑量時表現出略微應答之外。由于重組Colo320DM為CEA陰性，故由于抗-CEA抗體沒有信號增加，這些細胞的結果將是所預期的。在重組LoVo細胞的情況，由于加入此分析中抗體的量的增加信號除了最高劑量時以外由于原初信號的相對強度可能會下降。圖5顯示分泌至重組LoVo腫瘤細胞中融合蛋白的保留。縱軸代表適中的腫瘤體積(cm3)并且橫軸代表施以前體藥物后以天為單位的時間。實驗用60mg/kg劑量的前體藥物按實施例12中所述進行。結果顯示對照GAD(c)(無前體藥物處理)的腫瘤在收獲腫瘤時的11天(施以劑量后的天數)長至其起始大小的6倍，前體藥物處理的腫瘤GAD(d)顯示出顯著更慢的生長速率并且至16天(施以劑量后天數)僅達到其起始大小的3倍。此數據表明至少有11天的腫瘤生長延緩。
在下面的實施例中，除非另有說明，否則應用下面的方法學和材料。
用GENECLEANTMII試劑盒(Stratech科學有限公司或Bio 101有限公司)回收和純化DNA。此試劑盒含有1)6M的碘化鈉；2)氯化鈉的濃縮液，用于制備氯化鈉/乙醇/水洗液的Tris和EDTA；3)玻璃乳(Glassmilk)。含有1.25ml在水中特異性制備硅基質的懸液。這是基于美國科學院院報(1979)76卷615頁中發表的Vogelstein和Gillesole方法的DNA純化技術。簡言之，此試劑盒方法如下。向1體積的凝膠切片中加入3體積來自該試劑盒的碘化鈉溶液。通過于55℃加熱混和物10分鐘而熔化瓊脂糖且然后加入玻璃乳(5-10ml)，充分混合并置于環境溫度中靜置10分鐘，離心玻璃乳并用試劑盒的NEWWASHTM(0.5ml)清洗3次。從玻璃乳中去除清洗緩沖液并通過將玻璃乳水(5-10ml)在55℃孵育5-10分鐘而洗脫DNA。離心回收含有洗脫DNA的水溶性上清。洗脫步驟可從重復并且上清可以合并。
感受態大腸桿菌DH5α獲自生活技術有限公司(MAXTM效率DH5α感受態細胞)。
用Bio 101有限公司(目錄號2070-400)的RPMTMDNA制備試劑盒或類似的產品小量制備雙鏈質粒DNA-該試劑盒含有堿性裂解液從而從細菌細胞中釋放質粒DNA并在旋轉濾器(spinfilter)中含有玻璃乳以吸收釋放的DNA，然后從pH 7.5的無菌水或10mM Tris-HCl，1mM EDTA將其洗脫。
標準的PCR反應含有100ng質粒DNA(除了特別說明的之外)，5μl dNTPs(2.5mM)、5μl 10×酶緩沖液(500mM KCl，100mMTris pH 8.3)、15mM MgCl2和0.1％明膠)、1μl 25pM/μl每條引物的貯備液，0.5μl熱穩定的DNA聚合酶和水以得到50μl的體積。標準的PCR條件為94℃ 90秒；55℃ 60秒；72℃ 120秒15個PCR循環，最后一個循環以進一步72℃孵育10分鐘而結束。
可從Perkin-Elmer Cetus得到的AMPLITAQTM用作熱穩定的DNA聚合酶的來源。
一般的分子生物學方法可遵循“分子克隆-實驗指南”第二版，Sambrook，Fritsch和Maniatis(冷卻泉實驗室，1989)中所述的任何方法。
無血清培養基為OPTIMEMTMI減少的血清培養基，Gibco BRL目錄號31985。這是改進的以Hepes和碳酸氫鈉緩沖的Eagle基本必需培養基，并補充以次黃嘌呤核苷、胸腺嘧啶脫氧核苷、丙酮酸鈉、L-谷氨酰胺、痕量元素和生長因子。
LIPOFECTINTM試劑(GibcoBRL目錄號18292-011)為1∶1(w/w)的濾膜過濾的水中的陽離子脂N-[1-(2，3-二油酰氧基(dioleyloxy))丙基]-n，n，n-三甲銨氯化物(DOTMA)和二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)的脂質體制劑。其自發與DNA結合以形成脂-DNA復合體-見Felgner等美國自然科學院院報(1987)84，7431。
G418(磷酸鹽)為GENETICINTM，GibcoBRL目錄號11811，一種用作分子遺傳實驗中篩選劑的與為他霉素有關的氨基糖苷類抗生素；對于CEA ELISA，將96孔免疫板(NUNC MAXISORBTM)的每只孔以50mM pH 9.6的碳酸鹽/碳酸氫鹽包被緩沖液(緩沖膠囊-Sigma C3041)中的50ng CEA包被并于4℃孵育過夜。將平板以PBS-TWEENTM(PBS+0.05％TWEENTM20)洗三次然后以150μl每孔的位于PBS-TWEENTM中的1％BSA于室溫封閉1小時。將平板用PBS-TWEENTM洗三次，每孔加入100μl測試樣品并于室溫孵育2小時。將平板從PBS-TWEENTM洗三次，將100μl每孔的HRPO-標記的羊抗人卡巴抗體(Sigma A 7164)的1/500稀釋液加入PBS-TWEENTM中的1％BSA中并于室溫在搖床上孵育至少1小時。將平板以PBS-TWEENTM洗三次，且然后再以PBS洗一次。為了檢測結合，每孔加入100μl顯影液(溶于100ml H2O中的一膠囊磷酸檸檬酸鹽緩沖液-Sigma P4922，向其中加入一粒30mg的鄰苯二胺二鹽酸片劑-Sigma P8412)并孵育達15分鐘。通過加入75μl 2M H2SO4而終止反應并于490nm處讀數吸收值。
用抗CPG2報告抗體的CEA ELISA基本上與上述相同但不是用HRPO-標記的羊抗人卡巴抗體，而是加入位于PBS-TWEENTM中1％PBS中的1/1000稀釋的兔抗-CPG2多克隆血清并于室溫在搖床上孵育至少2小時。將平板以PBS-TWEENTM洗三次。然后加入羊-抗兔HRPO標記抗體(Sigma A-6154)的1/2000稀釋液并于室溫在搖床上孵育1小時，將平板以PBS-TWEENTM洗三次并以PBS洗一次。為了檢測結合，每孔加入100μl顯影液(溶于100ml H2O中的一膠囊磷酸鹽-檸檬酸緩沖液-Sigma P4922，其中加入一個30mg鄰苯二胺二鹽酸片劑-Sigma P8412)并孵育達15分鐘。通過加入75μl 2MH2SO4而終止反應并于490nm處讀數吸收值。
按如下進行轉染上清的Western印跡分析。用適當的微凝膠系統(HOEFER MIGHTY SMALLTM)制備用于分析融合蛋白轉染的10％微型凝膠。10％電泳凝膠為20ml丙烯酰胺、6ml 10×電泳凝膠緩沖液；34ml H2O；300ml 20％SDS；600μl APS；30μlTemed。電泳凝膠10x緩沖液為3.75M pH 8.6的Tris。6％積層膠為9ml丙烯酰胺；4.5ml 10×積層膠緩沖液；31.5ml H2O；225μl 20％的SDS；45μl 10％的APS；24μl Temed)。10x積層膠緩沖液為1.25M pH 6.8的Tris。SDS/PAGE的5×電泳緩沖液為249mMTris、799mM甘氨酸、0.6％w/v SDS(pH未調節)。
樣品的制備2×Laemmli緩沖液為0.125M Tris，4％ SDS；30％甘油；4M尿素；任選含有5％β-巰基乙醇的0.002％ BPB。上清25μl樣品+25μl 2×Laemmli緩沖液；上樣40μl。標準的F(ab′)2和CPG22μl 10mg/ml標準品；8μl H2O；10μl 2×Laemmli緩沖液(-巰基乙醇)；上樣20μl。分子量標記(AmershamRAINBOWTM)8μl樣品；8μl 2×Laemmli緩沖液(+巰基乙醇)上樣10μl電泳條件30毫安直到染料前沿至凝膠底部(大約1小時)。印跡用半干印跡儀(LKB)印跡至硝酸纖維素膜上。毫安＝0.7×cm2，45分鐘。封閉用PBS-TWEENTM中5％干燥脫脂牛奶40分鐘。
F(ab′)2的檢測用PBS-TWEENTM中0.5％干燥的脫脂牛奶1/2500稀釋的羊抗人卡巴輕鏈HRPO標記的抗體。
CPG2的檢測用小鼠抗CPG2單克隆(與PBS-TWEENTM中0.5％干燥脫脂牛奶中的1/2000稀釋液)孵育過夜；用羊抗小鼠卡巴輕鏈HRPO標記的抗體Sigma 674301-(于PBS-TWEENTM中0.5％干燥脫脂牛奶中的1/10000稀釋液)孵育至少2小時。
印跡的顯色使用增強劑存在下根據魯米諾底物(PierceSUPERSIGNALTM底物)對HRPO進行化學發光檢測。按如下制備底物工作液建議的體積0.125ml/cm2的印跡表面。混合等體積的魯米諾/增強劑溶液和穩定的過氧化物溶液，將印跡與工作液孵育5-10分鐘，去除溶液并將印跡置于膜保護器中并對放射自顯影膠片曝光(通常30秒到5分鐘)。
微生物保藏質粒pNG3-Vkss-HuCk根據布達佩斯條約以保藏號NCIMB 40798于1996年4月11日保藏于國立工業和海洋微生物保藏有限公司(NCIMB)，α3 St Machar Drive，Aberdeen ABZ 1RY，Scotland，英國。質粒pNG4-VHss-HuIgG2CH1根據布達佩斯條約以保藏號NCIMB 40797于1996年4月11日保藏于國立工業和海洋微生物保藏有限公司(NCIMB)，23 St Machar Drive，Aberdeen AB21RY，Scotland，英國。質粒pNG3-Vkss-HuGk-NEO根據布達佩斯條約以保藏號NCIMB 40799于1996年4月11日保藏于國立工業和海洋微生物保藏有限公司(NCIMB)，23 St Machar Drive，AberdeenAB2 1RY，Scotland，英國。質料pICI266根據布達佩斯條約以許可號NCIMB 40589于1993年10月11日保藏于國立工業和海洋微生物保藏有限公司(NCIMB)，St Machar Drive，Aberdeen AB2 1RY，Scotland英國。
胰蛋白酶作用(Typsinisation)將胰蛋白酶EDTA(Gibco BRL453000-019)和Hanks平衡的鹽溶液(HBSS；Gibco BRL 14170-088)于37℃水浴中預溫。存在的培養基從培養物中去除并以一定體積的HBSS(以前培養基體積的一半)代替并通過細心振蕩平板或培養瓶從而去除含有培養基的任何殘余血清而清洗細胞層。去除HBSS并加入一定體積的胰蛋白酶溶液(為原初培養基體積的四分之一)，輕輕振蕩培養瓶以確保細胞層被完全覆蓋并靜置5分鐘。通過加入適當的正常培養基(2×體積的胰蛋白酶液)而失活胰蛋白酶。然后將此細胞懸液或者計數或者進一步稀釋用于根據待進行的方法而繼續培養。
胎牛血清(FCS)的加熱滅活將FCS(Viralex A15-651認可的批號-Non European)貯存于-20℃。為了使用，將血清于4℃完全融化4℃第二天，將此血清于37℃水浴中孵育15分鐘且然后轉移至56℃水浴中孵育15分鐘。取出血清并在其分成50ml等份之前冷卻至室溫并貯存于-20℃。
常規的DMEM培養基(用Gibco BRL成分)向500ml DMEM(41966-086)中加入12.5ml Hepes(15630-056)；5ml NEAA(11140-035)；5ml pen/strep(10378-016)；和50ml熱滅活的FCS。
FAS培養基(除非另有說明，否則用Gibco BRL成分)490mlDMEM(41966-086)；12.5ml Hepes(15630-056)；5ml非必需氨基酸(11140-035)；5ml pen/strep(10378-016)；5ml維他命(11120-037)；5ml基本氨基酸(51051-019)；甲酰四氫葉酸(Sigma F8259)至10μg/ml的終培養基濃度；50ml加熱滅活的FCS；5ml dNTP混合物；和50mg/ml的G41850貯備液(以制備適當的篩選濃度)。
dNTP混合物將35mg G(Sigma G6264)，35mg C(SigmaC4654)，35mg A(Sigma A4036)，35mg U (SigmaU3003)，125mg T(Sigma T2895)溶解于100ml水中，過濾除菌并貯存于-20℃。
G418篩選對于LoVo細胞(ATCC CCL 209)，篩選在1.25mg/ml進行，對于HCT 116(ATCC CCL 247)細胞和Colo 320 DM(ATCCCCL 220)細胞，除非另有說明，否則篩選在1.5mg/ml進行。
BLUESCRIPTTM載體獲自Stratagene克隆系統。
Tet-On基因表達載體獲自Clontech(Palo Alto，加利福尼亞)目錄號K1621-1。
除非另有說明或從上下文中顯而易見，否則在實施例中所稱的抗體-CPG2融合構建體使用突變的CPG2以防止糖基化。實施例1(A5B7 Fab-CPG2)2融合蛋白的構建為了獲得同時表現CPG2酶活性的二價人癌胚抗原(CEA)結合分子的目的而安排(A5B7 Fab-CPG2)2酶融合的構建。向其末端設計起始的構建體從而含有A5B7抗體重鏈Fd片段，該片段通過彈性的(G4S)3肽接頭連接至CPG2多肽的N-末端(圖1)。
抗體A5B7結合人癌胚抗原(CEA)并特別適用于靶向結腸癌或其它具有CEA抗原的細胞(CEA作為癌癥相關抗原的重要性由Shively，J.E.和Beatty，J.D.在“癌癥學/血液學中的CRC關鍵性綜述”第2卷，p 355-399，1994中進行了綜述)。CPG2酶在自然界中為天然二聚化形式，由2種連接的相同多肽亞單位所組成。此分子二聚體的每種亞單位由較大的催化結構域和形成二聚體界面的第二個較小結構域所組成。
一般地，抗體(或抗體片段)-酶綴合物或融合蛋白應該至少為二價的，即是說能夠結合至少2種(可為相同或不同的)腫瘤相關抗原。在(A5B7 Fab-CPG2)2融合蛋白的情況，酶組分的二聚化與天然酶一樣在表達后發生，因而形成含有2個Fab抗體片段(且因此相對于抗體結合位點而言對二價的)和2分子CPG2的酶促分子(圖2a)。a)A5B7抗體基因的克隆重組鼠A5B7 F(ab′)2抗體的制備、純化和特征分析方法已經發表(國際專利申請，Zeneca有限公司，WO 96/2001，見這里的參考實施例5)。在參考實施例5中f部分，將A5B7抗體基因克隆入GS-SYSTEMTM(Celltech)載體中，見國際專利申請WO 87/04462，WO 89/01036，WO 86/05807和WO 89/10404，其中的A5B7 Fd克隆入pEE6并將輕鏈克隆入pEE12。這些載體為構建A5B7 Fab-CPG2融合蛋白的A5B7抗體基因的來源。b)嵌合A5B7載體構建體用適當的PCR引物通過PCR從pEE6和pEE12質粒載體中擴增A5B7鼠抗體可變區，其中的PCR引物包括必需的限制位點用于以正確的框架分別將重鏈和輕鏈可變區克隆入載體pNG4-VHss-HuIgG2CHI′(NCIMB保藏號40797)和pNG3-Vkss-HuCk-NEO(NCIMB保藏號407997)中。將得到的載體命名為pNG4/A5B7VH-IgG2CHI′(A5B7嵌合重鏈Fd′)和pNG3/A5B7VK-HuCk-NEO(A5B7嵌合輕鏈)。c)CPG2基因的克隆CPG2編碼基因可獲自應用微生物和研究中心，Porton Down，Salisbury，Wiltshire SP4 OJG，英國。CPG2也可通過重組技術獲得。CPG2的核苷酸編碼序列已由Minton，MP等在基因，(1984)31，31-38中發表。此編碼序列在大腸桿菌中的表達(Chambers，S.P.等.，應用微生物，生物技術(1988)，29，572-578)和在釀酒酵母中的表達(Clarke，L.E.等.，普通微生物學雜志(1985)，31，897-904)已有報導。此外，CPG2基因可通過多種方法而制備成合成DNA構建體并用作進一步實驗的來源。全基因合成已描述于M.Edwards美國生物技術實驗室(1987)，5，38-44，Jayarman等.，(1991)美國自然科學院院報88，4084-4088，Foguet和Lubbert(1992)生物技術13，674-675和Pierce(1994)生物技術16，708。
在準備克隆CPG2基因過程中，構建載體pNG3-Vkss，其為pNG3-Vkss-HuCk-NEO(NCIMB保藏號40799)的一種簡單衍生物。通過以下方法構建此載體，首先用限制酶XbaI消化而去除新霉素基因(因為其含有EcoRI限制酶位點)，然后分離載體片段且然后再連接以形成質粒pNG3/Vkss-HuCk。用SacII和EcoRI消化此中間載體，從而切下HuCk基因片段。然后將消化產物上樣于1％的瓊脂糖凝膠中并從剩余的載體中分離切下的片段，然后從凝膠中切下載體DNA并加以純化。設計和合成2條寡核苷酸CME 00261和CME 00262(SEQ IDNO1和2)。通過加入200pmoles每種寡核苷酸至總共30μl H2O中，加熱至95℃并讓此溶液緩慢冷卻至30℃而將這2種寡核苷酸進行雜交。然后將100pmoles退火的DNA產品直接連接入前面制備的載體中并將連接混合物轉化入大腸桿菌中。在得到的克隆中，導入此DNA“彈夾”產生一種新的多接頭序列而備用于隨后的CPG2基因克隆以制備載體pNG3-Vkss。
用適當的DNA寡核苷酸引物和標準的PCR反應條件通過PCR擴增編碼包括氨基酸殘基Q26-K415的CPG2結構基因。反應產物用1％瓊脂糖凝膠進行分析，將預期大小的(大約12000bp)條帶切下，純化并于20μl H2O中進行洗脫。然后用限制酶SacII消化此物質，然后將反應液上樣于1％瓊脂糖凝膠中并切下預期大小(大約250bp)的條帶且隨后進行純化。將此片段連接至預先以限制酶SacII消化的去磷酸化的質粒載體pNG3Vkss中，于1％的瓊脂糖凝膠中電泳，將線性化的載體切下純化并將連接混合物轉化入大腸桿菌。通過用BglII和FseI進行DNA限制性分析而分析得到克隆的CPG2 SacII片段的存在與方向。通過DNA測序確證似乎具有正確大小與方向片段的克隆。此中間質粒稱為pNG3-Vkss-SacIICPGfrag。將此質粒用限制酶AgeI和EcoRI消化、去磷酸化并將載體片段分離。將最初的CPG2基因PCR產物也以AgeI和EcoRI消化，分離到大約1000bp的片段，連接并轉化入大腸桿菌中。通過用限制酶HindIII和EcoRI消化而分析得到克隆的全長CPG2基因(大約1200bp)；對具有正確大小的插入子的克隆進行測序以確證一致性。最后，將此質粒(pNG3/Vkss-CPG2)以XbaI消化，去磷酸，分離載體片段并將XbaI新霉素基因片段(也在早期分離的大約1000bp)重新連接入質粒中并轉化入大腸桿菌中。通過以XbaI和EcoRI分別消化而檢查得到克隆中新霉素基因的存在與方向。將此載體命名為pNG2-Vkss-CPG2-NEO。d)CPG2 R6變異體的構建質粒pNG3-Vkss/CPG2-NEO用作對CPG2基因進行PCR誘變的模板從而突變在天然細菌酶序列中鑒定到的3個潛在的糖基化位點。用Minton，N.P.等在基因(1984)31，31-38中發表定位計數方法在位置222(N-I-T)、264(N-W-T)和272(N-V-S)觀察到推斷的氨基酸糖基化位點(N-X-T/S)。3個糖基化位點的天冬酰胺殘基(N)被突變成谷氨酰胺(Q)因此使此糖基化位點無效以避免完成CPG2表達或酶活性的任何糖基化位點。
其中的所有3個位點在單一反應系列中被突變的PCR誘變技術用于建立CPG2 R6基因變異體。載體pNG3/Vkss/CPG2-NEO用作三個起始PCR反應的模板。反應R1使用合成寡核苷酸序列引物CME00395并且CME 00397(SEQ ID NOS3和4)，反應2使用合成寡核苷酸序列引物CME 00395和CME 00399(SEQ ID NOS3和5)并且反應R3使用合成寡核苷酸序列引物CME 00396和CME00400(SEQ ID NOS6和7)。PCR反應R1與R2的產物分別含有突變的222和264+272糖基化位點，其中的R3產物為CPG2基因C-末端片段的拷貝。瓊脂糖凝膠分離和純化后，將R2和R3產物(R大約750bp；R3大約360bp)加入進一步的PCR反應中。制備不同量的產物R2和R3的混合物并用合成寡核苷酸CME 00395和CME00396(SEQ ID NOS3和6)進行PCR反應。得到的產物R4(大約1200bps)再次用寡核苷酸CME 00398和CME 00396(SEQ IDNOS8和6)擴增。將得到產物R5(大約600bp)加入終PCR反應中的產物P1(大約620bp)中，此PCR反應用寡核苷酸CME 00395和CME 00396(SEQ ID NOS3和6)進行。可將現含有所有三個突變糖基化位點的得到的PCR產物R6(大約1200bp)(在用限制酶AgeI和BsrGI消化和分離得到的片段后)克隆入(預先以限制酶AgeI和BsrGI和隨后分離的)載體pNG3/Vkss-CPG-2-Neo中。這在表達載體pNG3/Kvss-CPG2 R6-NEO內建立了所需的編碼CPG2/R6蛋白序列(SEQ ID NO10)的DNA。e)A5B7重鏈Fd-CPG2融合蛋白基因的構建重鏈抗體片段和CPG2酶基因均通過PCR擴增質粒模板而獲得。用引物CME 0096(SEQ ID NO11)和CME 00969(SEQ IDNO12)擴增質粒pNG4/A5B7VH-IgGCH′獲得A5B7 Fd組分(大約300bp)并且用引物CME 00967(SEQ ID NO13)和CME 00968(SEQ ID NO14)擴增質粒pNG3/Vkss/CPG2 R6-NED以獲得酶組分(大約1350bp)。在每種情況下上樣反應產物并于1％瓊脂糖凝膠上分離，切下正確產物大小的條帶，隨后純化并于20μl H2O中洗脫。
進行進一步的PCR反應從而將2種純化的PCR反應產物連接(或剪接)到一起。使用標準的PCR反應條件但每種產物量有變化(在0.5～2μl之間)且用25個循環(代替正常的15個循環)。反應產物用1％瓊脂糖凝膠分析并切下預期大小(大約1650bp)的條帶、純化并于20μlH2O中洗脫。然后用限制酶NheI和BamHI消化此物質，然后回收預期大小的(大約1600bp)條帶。通過以限制酶NheI和BamHI消化后將DNA去磷酸化并分離較小的NheI和BamHI片段與較大的載體帶。回收載體帶、純化并隨后將類似限制性消化的PCR產物連接入制備的載體中并將連接混合物轉化入大腸桿菌。從得到的克隆中制備DNA且隨后測序以確證此融合基因序列。發現許多克隆為正確的并將這些克隆中的一個克隆(命名為R2.8)重新命名為pNG4/A5B7VH-IgG2CH1/CPG2R6(SEQ ID NO15和SEQ ID NO16)。f)共轉染，暫時表達用下述的基于LIPOFECTINTM的方法將(編碼抗體嵌合Fd-CPG2融合蛋白)的質粒pNG4/A5B7VH-IgGCH1/CPG2R6和(編碼抗體嵌合輕鏈；SEQ ID NO17和SEQ ID NO18)的pNG3/A5B7VK-HuCk-NEO共轉染入COS-7細胞。將來自亞匯合培養的COS7細胞以2×105細胞/2ml/孔種植于6孔平板中并于37℃5％CO2中培養過夜。LIPOFECTINTM無血清培養基混合物組成如下12ml LIPOFECTINTM加上200ml無血清培養基并于室溫孵育30分鐘。DNA/無血清培養基混合物組成如下4mg DNA(每種構建體2mg)加上200ml無血清培養基。然后將200ml LIPOFECTINTM/無血清培養基混合物加入到DNA混合物中并于室溫孵育15分鐘。然后將60ml無血清培養基加入每種樣品中。用2ml無血清培養基沖洗細胞一次然后將1ml LIPOFECTINTM/DNA混合物加入細胞中并于37℃5％CO2中孵育5小時。從細胞中去除LIPOFECTINTM/DNA混合物并加入標準的培養基，然后于37℃ 5％CO2中將細胞孵育72小時。收獲細胞上清。g)抗體-酶融合蛋白的分析通過以下方法分析上清物質中抗體融合蛋白的存在，包括用抗人卡巴輕鏈受體抗體通過結合-CEA ELISA(測定抗體的存在)，用抗-CPG2受體抗體通過結合-CEA ELISA(測定結合CEA的CPG2融合蛋白的存在)，基于HPLC的CPG2酶活性分析(以測定特異的CPG2的活性)和SDS/PAGE及(用抗人卡巴輕鏈受體或抗CPG2報告抗體)的Western印跡以測定表面的物質。
基于HPLC的酶活性分析清晰地顯示CPG2酶活性存在于細胞上清中且兩種抗CEA ELISA分析表現出蛋白以相當的水平與二價A5B7抗體分子結合。用抗-CPG2報告抗體檢測的抗CEA ELISA也表現出清晰的CEA結合的事實表明不僅抗體而且抗體-CPG2融合蛋結合CEA。
同時用2種報告抗體分析的Western印跡分析顯示出預期的大約90kDa大小而無降解的融合蛋白亞單位或可觀察到的較小產物(如Fab或酶)。
由于已知CPG2僅在其為二聚化狀態時表現出酶活性并且因為僅僅抗體酶融合蛋白存在，故此表明90kDa的融合蛋白(在SDS-PAGE條件下所見到的)通過天然的CPG2二聚化機制二聚化以在“天然”緩沖液條件中形成180kDa二聚化抗體-酶融合蛋白分子(圖2a)。此外，該分子同時顯示出CPG2酶活性和CEA抗原結合特性，這與僅僅酶或抗體相比在融合蛋白中似乎沒有明顯不同。h)在體外細胞毒性分析中表達的融合蛋白與CPG2前體藥物的使用進行體外細胞殺傷分析，將其中的(A5B7-CPG2R6)2融合蛋白與“常規的”通過用化學異雙功能試劑將A5B7 F(ab′)2連接至CPG2而形成的A5B7 F(ab′)2-CPG2綴合物進行比較。在每種情況下，將表現出等量CPG2酶活性或等量抗體-CPG2蛋白的物質與帶有CEA的LoVo腫瘤細胞孵育。然后沖洗細胞以去除未結合的蛋白材料且隨后重懸于含有CPG2酶前體藥物的培養基(PGP，見下面實施例2)中1小時，然后沖洗細胞并重懸于新鮮培養基中并讓其增殖4天。最后將細胞用SRB染色處理并測定其數目。
得到的結果清楚地顯示與等量水平的(與前體藥物)的A5B7F(ab)2-CPG2綴合物相比，(與相同前體藥物)的(A5B7-CPG2R6)2融合蛋白導致至少相當的細胞殺傷并在分析結束時得到更少數目的細胞。(高于基準對照水平)的細胞殺傷僅在前體藥物由CPG2酶轉化為活性藥時可能發生(并且由于細胞被沖洗以去除未結合蛋白，所以僅僅結合細胞的酶將在加入前體藥物時保留)。因此，此實驗顯示與作為更大程度細胞殺傷的常規A5B7F(ab′)2-CPG2綴合物相比，至少相同水平的A5B7-CPG2R6融合蛋白保持結合(可能是由于更多的前體藥物至藥物轉換)發生。i)用于在短暫和穩定細胞系中表達的其表達融合蛋白載體的構建為了更為簡單的轉染方法和直接將2種表達彈夾偶聯至單一篩選標記上，用(編碼抗體Fd-CPG2融合蛋白)的現存載體pNG4/A5B7VH-IgG2CH1/CPG2R6和(編碼抗體輕鏈)的pNG3/A5B7VK-HuCk-NEO構建用于融合蛋白表達的其-表達載體。將pNG4/A5B7VH-IgG2CH1/CPG2 R6質粒首先用限制酶SacI消化，將反應液上樣于1％瓊脂糖凝膠中并從凝膠中切下線性載體并純化。此載體DNA然后用限制酶BglII和BamHI消化，反應液上樣于1％瓊脂糖凝膠中，回收所需的帶(大約2700bp)并加以純化。用限制酶BamHI消化質粒pNG3/A5B7VK-HuCk-NEO，然后將此DNA去磷酸且然后上樣于1％瓊脂糖凝中并從凝膠中切下載體條帶并加以純化。將重鏈表達彈夾片段連接入制備的載體中并將連接混合物轉化入大腸桿菌中。通過多種限制性消化檢查此方向并篩選具有與輕鏈相同方向重鏈彈夾的克隆。將這些質粒命名為pNG3-A5B7-CPG2/R6-coexp.-NEO。j)用于蛋白表達的基因開關已預見CPG2和CPG2融合蛋白在哺乳動物細胞中的體外表達可能降解培養基葉酸從而導致緩慢的細胞生長或細胞死亡。高活性的CPG2酶有可能使此葉酸缺陷難以通過培養基補充來克服。然而，認為在CPG2或CPG2融合蛋白表達在哺乳動物體內細胞中表達的情況，有可能這些問題將會發生，因為這些細胞將通過正常的循環和細胞機制而不斷地補充所有生長需求。
已考慮過許多避免可能的體外葉酸耗竭問題的方案。其中的一種解決方法包括使用緊密控制但可誘導的基因開關系統如“TET開”或“TET關”(Grossen，M.等(1995)科學2681766-1769)或蛻皮素/muristerone A開關(No，D等(1996)PNAS 933346-3351)。這些系統使準確控制目的基因的表達成為可能并可從以編碼毒性或潛在有害表達產物的基因穩定轉化哺乳動物細胞。基因開關將允許摻入CPG2融合基因的重組穩定細胞系可能更容易建立、維持和擴增而用于蛋白表達和種子培養而用于體內腫瘤生長研究。實施例2表達抗體-酶融合蛋白的HCT116腫瘤細胞在體外受到前體藥物的選擇性殺傷用實施例1的抗體-CPG2融合蛋白基因轉染的HCT116結腸癌細胞(ATCC CCL247)可由前體藥物選擇性殺傷，此前體藥物由該酶轉換為活性藥物。
為了測定此殺傷，將對照未轉染的HCT116細胞或以抗體-CPG2融合蛋白基因轉染的HCT116細胞與前體藥物，4-[N，N-雙(2-氯乙基)氨基]-苯氧羰基-L-谷氨酸(PGP；Blakey等，英國癌癥雜志72，1083，1995)或由CPG2釋放的相應藥物，4-[N，N-雙(2-氯乙基)氨基]酚孵育。將高于5×10-4到5×10-8M濃度范圍的藥物加入含有1000-2,500個HCT116細胞/孔的96孔微滴定板中于37℃1小時。然后沖洗細胞并于37℃進一步孵育3天。沖洗去除死細胞后，加入TCA并按Skehan等所述(國立癌癥研究院院報，82，1107，1990)通過加入SRB染料而分析附著到此平板上的細胞蛋白的量。通過抑制50％生長抑制(IC50)所需的濃度分析此前體藥物或藥物的效價。
用該藥物處理未轉染或轉染的HCT116細胞導致大約1μm的IC50。相反，PGP前體藥物對未轉染的細胞導致大約200μm的IC50并且對轉染的細胞導致大約1μm的IC50。這些結果證明表達抗體-CPG2融合蛋白的轉染細胞可將PGP前體藥物轉換成更為有效的活性藥物而未轉染的HCT116細胞不能夠轉換此前體藥物。因此，就細胞殺傷而言與未轉染的HCT116細胞相比，轉染的HCT116細胞對PGP前體藥物敏感100多倍。(見實施例1j)中關于包括細胞中可能的葉酸耗竭問題。
這些研究證明用抗體-酶融合蛋白基因轉染腫瘤細胞可導致前體藥物選擇性腫瘤細胞殺傷。實施例3表達抗體-CPG2融合蛋白的HCT116腫瘤中PGP前體藥物的抗腫瘤活性可按如下證明在表達抗體-CPG2融合蛋白的HCT116腫瘤中PGP前體藥物的體內抗-腫瘤活性。將以抗體-CPG2融合蛋白基因轉染的HCT116腫瘤細胞或對照未轉染的HCT116腫瘤細胞皮下注射至無胸腺裸鼠(107個腫瘤細胞/只子鼠)中。當腫瘤為5-7mm直徑時，將PGP前體藥物腹膜內注射至小鼠(以5-25mg kg-1的劑量范圍每小時間隔經2小時3次劑量)。通過以2個方向測定腫瘤長度并用下面公式計算腫瘤體積而判斷抗-腫瘤效應體積＝π/6×D2×d其中D為腫瘤較大的直徑且d為腫瘤較小的直徑。
腫瘤體積以相對于施用PGP前體藥的時的腫瘤體積表示。抗腫瘤活性與對照組進行比較，對照組接受轉染或未轉染的腫瘤細胞和PBS(170mM NaCl，3.4mM KCl，12mM Na2HPO4和1.8mM KH2PO4，pH 7.2)而不是PGP前體藥物。通過與PBS處理的腫瘤相比PGP處理腫瘤體積的減小以及與PBS處理腫瘤相比PGP處理的腫瘤明顯需要更長時間以達到其最初腫瘤體積的4倍來判定。施用PGP至從轉染HCT116細胞而建立的HCT116腫瘤細胞得到顯著的抗腫瘤效應。相反，施用PGP至從未轉染細胞建立的HCT116腫瘤細胞沒有導致明顯的抗腫瘤活性。
類似的研究可用于證明當與PGP前體藥物聯合使用時，在適當的載體中運載從而從未轉染HCT116細胞建立的HCT116腫瘤的抗體-酶基因可導致明顯的抗腫瘤活性。因此，將未轉染的HCT116細胞注射入無胸腺裸鼠(每只鼠1×107腫瘤細胞)且一旦腫瘤達到5-7mm的直徑，將含有抗體酶融合蛋白基因的載體注射入腫瘤內。使抗體-酶融合蛋白由HCT116腫瘤細胞表達并與其結合1-3天后，按上述施用PGP前體藥物。與接受PBS而非PGP前體藥物的對照小鼠相比，這導致了明顯的抗腫瘤活性。實施例4用補充FAS的培養基和/或V-79滋養細胞改進對附著細胞系的轉染已經預見CPG2和CPG2融合蛋白在哺乳動物細胞中的體外表達可能降解培養基葉酸，從而導致緩慢的細胞生長或細胞死亡。開發這里所述的用于表達CPG2和CPG2融合蛋白細胞系的FAS(補充葉酸)的培養基從而更好地支持這些細胞系的生長。
在準備轉染過程中，將附著細胞系在常規DMEM培養基中培養并在轉染之前至少傳代三次。將V-79(獲自MPC放射學公司，(Harwell，Oxford.，英國)的倉鼠肺成纖維細胞)飼料細胞培養于常規的DMEM培養基中并在用前傳代三次。為了轉染，進行粘附細胞進行存活計數(用血細胞計數器/苔酚藍染色)并以2×105個細胞/孔將細胞鋪于6孔平板(Costar 3516)并放置18-24小時而讓細胞再次粘附。
對于每次單獨的轉染，將20μl LIPOFECTINTM加入80μl無血清培養基中并置室溫30分鐘。將目的質粒DNA(2μg)加入100μl無血清培養基中且隨后加入LIPOFECTINTM混合物中并進一步放置15分鐘。將每個6孔平板用每孔2ml無血清培養基沖洗以去除任何血清并代之以800μl新鮮無血清培養基。將預先制備的200μl DNA/LIPOFECTINTM/無血清培養基混合物加入每個細胞孔中。將平板于37℃孵育5小時，其除培養基并加入2ml新鮮的常規培養基且進一步孵育48小時。刮干凈6孔板中轉染的細胞，取出細胞懸液并離心。去除所有的上清并將細胞沉淀重懸于20ml含有適當用于轉染DNA(如G418)篩選劑的適當新鮮培養基(如.FAS DMEM培養基)中。從每孔(200μl)等份鋪板于96孔平板中(1.25×104個細胞每孔)。
為了增強克隆擴增，可將成纖維細胞飼料細胞加入轉染的細胞中。用胰蛋白酶消化半匯合的V-79滋養細胞并進行存活計數。將細胞以1×106細胞/ml重懸于無菌玻璃容器中，用暴露至5000拉德的銫源12分鐘進行輻射。然后將細胞貯存于4℃ 24-48小時(輻射過的細胞代謝上有活性但將不分裂，且因此可作其它細胞的“滋養”而不污染培養物)。滋養細胞應以4×104個細胞每孔鋪板于96孔平板中以制備用于出現重組克隆。滋養細胞最初附著于平板上但隨著時間推移而又脫離(平板)并漂浮入培養基中，使任何重組克隆仍附著于孔中。每周更換培養基(每次200μl)2次以去除漂浮的細胞并補充培養基。讓克隆形成10-14天，然后通過標準的ELISA分析篩選上清中的融合蛋白分泌。
為了測定(A5B7-CPG)2融合基因構建體的表達速率，將重組細胞從10ml新鮮常規培養基1×106個細胞接種恰好24小時。然后取出上清離心以去除細胞廢物并通過上述的ELISA和HPLC方法分析融合蛋白和酶活性。多種重組(A5B7-CPG)2融合蛋白細胞系的結果如下。
細胞系 克隆 ng/106個細胞/24小時HCT116F76550C12 3210HCT116F615560C16151B34502A84650D5630H9610G11 2081H42380A41634LoVo B98370C17350F12 2983C710770G10 41
Colo 320DM B310540G44720B9885B10 3090F12 35660實施例5穩定可誘導的表達(A5B7-CPG2)2融合蛋白腫瘤細胞系的構建a)可誘導的融合蛋白表達載體的構建為了利于從單個可誘導哺乳動物細胞啟動子的表達、構建了基于IRES(內部核糖體進入位點；見Y.Sugimoto等.，生物技術(1994)，12，694-8)的(A5B7-CPG2)2融合蛋白版本。構建體pNG3 pNG3/A5B7VK-HuCk-NEO(A5B7嵌合輕鏈；描述于上面實施例16中)用作擴增輕鏈基因的模板。用寡核苷酸CME 3153和CME 3231(SEQ IDNOS 19和20)擴增此基因。純化預期大小(大約700bp)的PCR產物。此產物然后用限制酶EcoRI和BamHI消化并隨后進行純化。將此片段克隆入BluescriptTMKS+載體(通過用相同的限制酶EcoRI和BamHI消化而制備成接受此片段)中，然后將此DNA去磷酸并純化較大的載體帶。將類似限制性消化的PCR片段連接入此制備的載體中并將連接混合物轉化入大腸桿菌中。從這些獲得的克隆中制備DNA并通過限制性消化分析之以檢查PCR片段的插入。對適當的克隆進行測序以確證此基因序列。獲得多個具有正確序列的克隆并將其中的一個克隆給以質粒命名A5B7 BluescriptTM。
以類似的方式，用寡核苷酸CME 3151和CME 3152(SEQ IDNOS 21和22)通過PCR從質粒pNG4/A5B7VH-IgG2CH1/CPG2R6(在上面的實施例1e中描述過)中擴增嵌合A5B7重鏈。純化預期大小(大約1800bp)的PCR反應產物。然后用限制酶BamHI和XbaI消化此產物后純化此片段條帶。也將此片段克隆入已用相同的限制酶BamHI和XbaI消化而制備成接受上述片段的BluescriptTMKS+載體中，其中的限制酶消化過的載體DNA被去磷酸并純化較大的載體片段。將類似限制性消化的PCR片段連接入制備的載體中并將連接混合物轉化入大腸桿菌中。從得到的克隆中制備DNA并通過限制性消化加以分析以檢查PCR片段的插入，對適當的克隆進行測序以確證該基因序列。獲得多個具有正確序列的克隆并將其中的一個克隆給以質粒命名BluescriptTMFd-CPG2 R6。
IRES序列源自載體pSXLC(Y.Sugimoto等.，生物技術(1994)，12，694-8)中描述過并獲自這些作者)。通過限制酶BamHI和NcoI消化而切下IRES序列。純化預期大小的(大約500bp條帶并將其連接入(預先以相同酶限制性消化而制備的)BluescriptTMFd-CPG2 R6質粒中。將此連接混合物轉化入大腸桿菌中并以得到的克隆中制備DNA。通過限制性消化分析此DNA以檢查此片段的插入并對適當的克隆進行測序以確證此基因序列。獲得多個具有正確序列的克隆并將其中一個給以質粒命名BluescriptTMIRES Fd-CPG2 R6。
為了利于以后的克隆步驟，缺失IRES片段中帶有的XbaI位點是必需的。這通過用寡核苷酸引物CME 3322和CME 3306(SEQ IDNOS23和24)和BluescriptTMIRES Fd-CPG2 R6作為模板DNA通過PCR誘變進行。純化預期大小(大約500bp)的PCR反應產物，用限制酶BamHI和NcoI消化并連接入(預先用相同的限制酶限制性消化而制備的)BluescriptTMIRES Fd-CPG2 R6質粒中。將連接混合物轉化入大腸桿菌中并以得到的克隆中制備DNA。通過限制性消化分析此DNA以檢查此片段的插入并對適當的克隆隨后進行測序以確證此基因序列。得到多個具有正確序列的克隆并將其中一個給以質粒命名BluescriptTMIRES Fd-CPG2 R6-Xba del。
通過限制酶EcoRI和BamHI消化而從質粒A5B7 BluescriptTM質粒中切下A5B7嵌合輕鏈片段。純化預期大小的(大約700bp)的條帶，將其連接入適當制備的BluescriptTMIRES Fd-CPG2 R6-Xba del質粒中并將連接混合物轉化入大腸桿菌中。從得到的克隆中制備DNA并通過限制性消化分析之以檢查該片段的插入。對適當的克隆隨后進行測序以確證該基因序列。得到多個具有正確序列的克隆并將其中一個給以質粒命名BluescriptTMA5B7 IRES Fd-CPG2 R6-Xba del。完整的基于IRES的A5B7嵌合蛋白基因序列示于SEQ ID NO52中。
然后將基于IRES的A5B7嵌合融合蛋白基因轉入四環素調節的表達載體中，用于Ter On基因表達系統的載體獲自Clontech。通過用限制酶EcoRI和Xba I消化、去磷酸化并純化較大的載體條帶制備四環素可開關的表達載體pTRE(又稱為pHUD10-3，見Gossen等，(1992)，PNAS，89，5547-51)以接受基于IRES的融合蛋白彈夾。用相同的限制酶從BluescriptTMA5B7 IRES Fd-CPG2 R6-Xba del質粒中切下IRES基因彈夾。將獲得的大約3000bp的片段連接入制備的載體中并將連接混合物轉化入大腸桿菌中。從得到的克隆中制備DNA并通過限制性消化分析之以檢查PCR片段的插入。對適當的克隆隨后進行測序以確證此基因序列。得到多個具有正確序列的克隆并將其中的一個克隆給以質粒命名pHUD10-3/A5B7 IRES Fd-CPG2 R6。b)穩定可誘導的表達融合蛋白的細胞系的構建。
用標準的脂質轉染法(如前面所述但不使用滋養細胞)制備重組的HCT116腫瘤細胞系。用1μg pHUD10-3/A5B7 IRES Fd-CPG2 R6質料和1μg pTet-On反式激活表達質粒(來自Clontech試劑盒)進行共轉染并用含有750μg G418/ml的FAS培養基篩選陽性克隆。c)重組HCT116可誘導細胞系的誘導研究將得到的克隆培養物分配至2個48孔平板，每孔含1×106個細胞。將細胞培養48小時，其中的一只平板用2μg/ml強力霉素加以誘導并且另一只平板用作未誘導的對照。用實施例1g中所述的ELISA/Western印跡分析測試細胞上清中(A5B7-CPG2)2融合蛋白的表達。這些結果可清楚地證明用強力霉素對可誘導細胞系融合蛋白的誘導，例如，得到的一個克隆(F11)中，誘導的細胞在上清中產生120ng/ml融合蛋白而未誘導細胞僅產生背景水平的融合蛋白(低于1ng/ml)。實施例6分泌的融合蛋白物質基于細胞的ELISA分析將細胞以每孔100μl常規培養基1×104個細胞的濃度接種于96孔平板(Becton Dickinson BiocoatTMpoly-D-Lysine，35-6461)中并于37℃放置約40小時。將100μl 6％的甲醛稀釋于DMEM中并于4℃放置1小時。離心平板并通過浸泡于含有0.05％TweenTM的PBS中沖洗3次(頭2次洗2分鐘且最后一次5分鐘)。
將100μl含有融合蛋白或嵌合A5B7抗-CEA的細胞培養上清2倍稀釋液適當地加入每孔中并將平板于4℃孵育過夜。按上述沖洗平板并且在嵌合融合蛋白的情況，加入100μl HRP標記的抗人卡巴抗體(Sigma A-7164)的1∶1000稀釋液并于室溫孵育2小時(抗-CPG2檢測方法可用于鼠scFv融合蛋白的情況中)。按上述沖洗平板并用OPD底物(Sigma P-8412)檢測HRP。使顯色大約5分鐘，用每孔75μl 2MH2SO4終止顯色并于490nm處計數OD值。
在(A5B7-CPG2)2融合蛋白的情況，物質從重組Colo 320DM腫瘤細胞(CEA-ve)的上清中產生。通過用上述的CEA ELISAs測定融合蛋白的含量。加入逐漸增加量的融合蛋白至許多CEA陰性細胞系和CEA陽性LoVo親本細胞系。示于圖3中的結果清楚地顯示僅僅CEA陽性細胞系隨著加入融合蛋白量的增加而結合水平增加而CEA陰性細胞系整個過程僅僅顯示出恒定的背景結合水平。這清楚地證明該融合蛋白特異性結合并維持于CEA陽性Lovo細胞中。實施例7表達抗體-酶融合蛋白的重組Lovo腫瘤細胞表現融合蛋白在細胞表面上的滯留從(A5B7-CPG2)2融合蛋白基因轉染的LoVo結腸癌細胞已表現出又分泌同時在其細胞表面上又維持有融合蛋白，這可能過在對分泌的融合蛋白進行基于細胞的ELISA中分析提出的條件下比較母本和表達重組融合蛋白的LoVo細胞而加以證明(圖4)。在顯色反應中可以重組LoVo細胞通過顯示出高水平的顏色而維持有表達的融合蛋白。在對照實驗中，用表達Colo320DM融合蛋白的細胞，該分析顯示有些融合蛋白的保留(可能是非特異性的)和母本LoVo細胞僅僅顯示出背景活性。其中加入CEA結合抗體至表達測試重組融合蛋白的腫瘤細胞以及加入到母本LoVo對照中的陽性對照得到了從母本LoVo獲得的信號(因此證明CEA存在于母本細胞上)但來自Colo320DM(CEA陰性)的信號沒有增加。此重組的LoVo細胞仍然得到如此強裂的起始信號從而加入的抗體對獲得的總的信號幾乎沒有影響，該信號比任何對照實驗要高得多。因此，似乎從CEA陽性腫瘤細胞系分泌的抗-CEA抗體酶-CPG2融合蛋白通過CEA結合到細胞表面而CEA陰性腫瘤表達的相同蛋白沒有表現出這種結合。實施例8表達抗體-酶融合蛋白的LoVo腫瘤細胞受前體藥物的選擇性殺傷用(A5B7-CPG2)2融合蛋白基因轉染的LoVo結腸癌腫瘤細胞可受前體藥物的選擇性殺傷，該前體藥物由CPG2酶轉化成活性的藥物。
為了證明此對照未轉染的LoVo細胞或者將以抗體-CPG2融合蛋白基因轉染的LoVo細胞與前體藥物，4-[N，N-雙(2-氯乙基)氨基]-苯氧羰基-L-谷氨酸(PGP；Blakey等，(1995)英國癌癥雜志72，p1083)或由CPG2，4-[N，N-雙(2-氯乙基)氨基]酚所釋放的相應藥物一起孵育，如實施例2中所述的HCT116細胞一樣。
表達抗體-CPG2融合蛋白的轉染細胞可將PGP前體藥物轉化成更為有活性的藥物而未轉染的LoVo細胞不能夠轉換此前體藥物。
這些研究證明以抗體-酶融合蛋白基因轉染腫瘤細胞可導致用前體藥物對腫瘤細胞的選擇性殺傷。實施例9表達融合蛋白的LoVo腫瘤異體移植在無胸腺小鼠中的建立將重組的表達融合蛋白(A5B7-CPG2)2的LoVo腫瘤細胞或將重組及母本LoVo細胞混合物皮下注射至無胸腺裸鼠(每只小鼠107個腫瘤細胞)。同時將100％重組LoVo細胞及重組母體LoVo細胞10％80％的混合物的腫瘤生長速率與僅僅母本細胞腫瘤的生長速率相比較。在觀察到的生長曲線中沒有見到明顯的差異，顯示在細胞系間的比較過程中無需校正。觀察到的腫瘤生長速率顯示在每種異體移植腫瘤的情況中，達到10×10mm的大小大約需要12天。實施例10腫瘤異體移植樣品中酶活性的測定為了用作測定的標準，在20％的正常腫瘤(母本細胞腫瘤)的勻漿物中制備CPG2酶標準曲線。隨后與正常腫瘤20％的勻漿物相同而制備樣品稀釋液。
從-80℃保藏(預先快速冷凍干液氮中)取出切下的腫瘤組織并使其融化。將腫瘤用手術刀切成小片段之前去除殘余的皮膚組織。將腫瘤組織轉入預先稱量好的試管中并稱取該腫瘤組織的重量。將含有0.2mMZnCl2溶液的PBS加入每種腫瘤樣品中以達到20％(w/v)混合物，勻漿并置于冰上。制備例如，干凈的1/10、1/20和1/40的(于20％正常腫瘤勻漿物中)樣品腫瘤的稀釋液。
為了標準曲線，將CPG2酶稀釋液制成400μl終體積中下面的濃度。類似地，也制備400μl每種重組腫瘤樣品稀釋液。平衡至30℃后，加入4μl的10mM氨甲喋呤(MTX)溶液。精確地在10分鐘后通過加入600μl冰冷的甲醇+0.2％TFA而終止反應，離心并收集上清。然后通過HPLC(用陽離子交換柱，HICROMTMS5SCX-100A，移動相260％甲醇，40％60mM的甲酸銨/0.1％TFA，300nm處檢測)分離上清中的底物與產物。為了計算腫瘤組織中的酶活性，將標準曲線繪成氨甲喋呤代謝物面積的單位(此標準的這樣，即僅僅20-30％的底物被代謝從而確保此為非速度限制性的)。通過比較代謝物單位面積與標準曲線且然后乘以稀釋因子而分析測試樣品。最后，制作1ml＝1g的工作假設，將結果乘以5(因為樣品最初被稀釋至20％的勻漿物)。
用表達(A5B7Fab-CPG2)2融合蛋白的20％重組80％母本LoVo細胞得到的結果顯示下面的結果于第5天取出的腫瘤具有平均酶活性＝0.26U/g(在0.18-0.36U/g之間的范圍)且在第12天具有平均酶活性＝0.65U/g(在0.19-1.1U/g的范圍)。實施例11血漿樣品中酶活性的測定為了用作測定的標準，在20％正常血漿中制備至下面濃度的CPG2酶標準曲線0.2、0.4、0.6、0.8和1.0U/ml。類似地也將所有的測試血漿樣品稀釋至20％的正常血漿。同時用20％的正常血清制備這些樣品的進一步稀釋液，如干凈的1/10、1/20和1/50稀釋液。將200ml等份的每種CPG2標準和測試樣品稀釋液平衡至30℃。加入2μl 10mM的MTX至每只試管中并充分混合至30℃。準確地在10分鐘后通過加入500μl冰冷的甲醇+0.2％TFA而終止反應(以增加測定的敏感性并可將孵育時間增加至30分鐘)并按上面實施例10中所述用HPLC檢測分析產物。
當腫瘤中酶活性水平超過2.0U/g時除了在少數情況外在血漿中沒有見到活性，這些少數情況中的血漿酶水平測定為0.013至0.045U/ml的范圍。實施例12CPG前體藥物在表達抗體-CPG2融合蛋白的LoVo腫瘤中的抗腫瘤活性。
按實施例9中所述將表達(A5B5-CPG2)2融合蛋白的重組LoVo腫瘤細胞或重組與母本LoVo細胞的混合物皮下注射至無胸腺裸晶中。
當腫瘤達到5.7mm直徑時將PGP前體藥物經腹膜內施用至小鼠(于DMSO/0.15M碳酸氫鈉緩沖液以小時為間隔經2個小時3個劑量，劑量為40-80mg kg-1)。
通過在2個方向測定腫瘤的長度并用下面的公式計算腫瘤體積而判定抗癌效應體積＝π/×D2×d其中的D為腫瘤的較大直徑且d為腫瘤的較小直徑。腫瘤體積可以相對于施用PGP前體藥物時的腫瘤體積來表示或者作為選擇可計算平均的腫瘤體積。將該抗腫瘤活性與接受轉染腫瘤細胞或未轉染腫瘤細胞與無PGP前體藥物的緩沖液的對照組相比較。
與對照相比PGP處理的腫瘤體積的減小并且與對照相比其需要明顯更長的時間使PGP處理的腫瘤達到其起始腫瘤體積的4倍(圖5)，由此所示施用PGP至從重組LoVo細胞或重組LoVo/母體LoVo細胞混合物建立的LoVo腫瘤導致了明顯的抗腫瘤效應。施用PGP至從未轉染細胞建立的LoVo腫瘤沒有導致明顯的抗腫瘤活性。
類似的研究可用于證明用適當的基因轉移載體轉移至從非轉染母本LoVo細胞建立的LoVo腫瘤中的抗體-酶基因當與PGP前體藥物聯合使用時可導致顯著的抗腫瘤活性。因此，將未轉染的LoVo細胞注射至無胸腺裸鼠(每只小鼠1×107個腫瘤細胞)并且一旦腫瘤達到5-7mm的直徑，將含有抗體-酶融合蛋白基因的載體注射至腫瘤內。使LoVo腫瘤細胞表達抗體-酶融合蛋白1-3天后并結合至其上，按上述施用PGP前體藥物。與對照相比這導致了顯著的抗腫瘤活性。實施例13(806.077 Fab-CPG2)融合蛋白的構建為了獲得也表現出CPG2酶活性的二價人癌胚抗原(CEA)結合分子，計劃構建(806.077 Fab-CPG2)2酶融合。設計此最初構建體的末端含有806.077抗體重鏈Fd片段，該片段通過彈性的(G4S)3肽接頭將其C-末端連接至CPG2多肽的N-末端(如圖1中所示但從806.077代替A5B7)。
抗體806.077(在Zeneca有限公司的國際專利申請WO 97/42329中描述過)以很高程度的特異性與人CEA結合。因此，806.077抗體特別適用于靶向結腸癌或其它帶有CEA抗原的細胞。
一般地，抗體(或抗體片段)-酶綴合物或融合蛋白應該至少為二價的，即是說能夠結合至少2種腫瘤相關抗原(可為相同的或不同的)。在(806.077 Fab-CPG2)2融合蛋白的情況，酶成分的二聚化(在表達后，與天然酶一樣)發生，因而形成含有2個Fab抗體片段(且因此就抗體結合位點來說是二價的)和2個CPG2分子的酶促分子(圖2a)。a)806.077抗體基因的克隆重組鼠806.077 F(ab′)2抗體的克隆及特征分析的方法已經公開(國際專利申請WO 97/42329，實施例7)，參考實施例7.5描述了將806.077抗體可變區基因克隆入BluescriptTMKS+載體中。這些載體然后用作806.077可變區基因的來源而用于構建806.077嵌合輕鏈和重鏈Fd基因。b)嵌合806.077抗體載體構建體國際專利申請WO 97/42329，實施例8公開描述了將806.077嵌合輕鏈和重鏈Fd基因克隆入載體pNG3-Vkss-HuCk-NEO(NCIMB保藏號40799)和pNG4-VHss-HuIgG2CH1′(NCIMB保藏號40797)中將得到的載體命名為pNG4/VHss 806.077VH-IgG2CH1′(806.077)嵌合重鏈Fd′和pNG3/Vkss806.077VK-HuCk-NEO(806.077嵌合輕鏈)。這些載體為用于構建806.077 Fab-CPG2融合蛋白的806.077抗體基因的來源。c)806.077重鏈Fd-CPG2融合蛋白基因的構建所用的CPG2基因的克隆與構建描述于實施例1c和d部分中。類似地，用于構建806.077重鏈Fd-CPG2構建的pNG4/A5B7VH-IgGCH1/CPG2R6載體的構建描述于實施例1的e部分中，通過用限制酶HindIII和NheI消化而從pNG4/VHss 806.077VH-IgG2CH1′載體中切下806.077可變區重鏈基因并純化含有此可變區基因的預期大小的(難300bp)的條帶。為了準備將用806.077可變區代替A5B7抗體的可變區，用相同的限制酶(HindIII/NheI)消化載體pNG4/A5B7VH-IgG2CH1/CPG2R6。消化后，將DNA去磷酸然后分離和純化較大的載體帶。然后將類似限制性消化的可變區基因連接入此制備的載體中并將連接混合物轉化入大腸桿菌中。從得到的克隆中制備DNA并通過限制性消化分析加以分析并且隨后進行測序以確證融合基因序列。發現許多克隆為正確的并挑選其中一個克隆，pNG4/VHss806VH-IgG2CH1/CPG2R6用于進一步工作。構建的806.077重鏈Fd-CPG2融合蛋白的基因的序列示于SEQ ID NOS25與26。d)共轉染、融合蛋白的暫時表達與分析用上面實施例1f中描述的基于LIPOFECTINTM的方法將(編碼抗體嵌合Fd-CPG2融合蛋白的)質粒pNG4/VHss806.077VH-IgG2CH1/CPG2R6和(編碼抗體嵌合輕鏈的)質粒pNG3/VHss806.077VK-HuCk-NEO共轉染入COS-7細胞中。按實施例18中所述對融合蛋白進行分析。基于HPLC的酶活性測定清楚地顯示CPG2酶活性存在于細胞上清中并且兩種抗-CEA ELISA分析顯示出以與二價的806.077抗體分子相當的水平的蛋白結合，用抗-CPG2報告抗體的抗-CEA ELISA測定也顯示出清晰的CEA結合的事實表明不僅抗體而且抗體-CPG2融合蛋白結合CEA。同時用兩種報告抗體的Western印跡分析清楚地顯示出預期的大約90kDa大小的(806.077 Fab-CPG2)2融合蛋白亞單位，其中僅可觀察到小量的降解或更小的產物(如Fab或酶)。由于僅知道CPG2僅在其為二聚化狀態時顯示出酶活性并且由于僅僅抗體酶融合蛋白存在，這表明90kDa的融合蛋白(在SDS/PAGE條件下所見到的)在“自然”緩沖液條件下通過天然CPG2二聚化機制二聚化從而形成180kDa的二聚化抗體-酶融合蛋白分子孔(圖2a)。此外，該分子同時顯示出CPG2酶促活性和CEA抗原結合活性，似乎與僅僅酶或抗體相比此融合蛋白有顯著不同。e)用于暫時及穩定細胞系表達的(806.077 Fab-CPG2)2融合蛋白共表達載體的構建為了更為簡單的轉染方法和直接偶聯2種表達彈夾與單一篩選標記，用(編碼抗體Fd-CPG2融合蛋白)的現存載體pNG4/VHss806.077VH-IgG2CH1/CPG2和(編碼抗體輕鏈的)現存載體pNG3/VHss806.077VK-HuCk-NEO構建融合蛋白表達的共-表達載體。首先用限制酶ScaI消化pNG4/VHss806.077VH-IgG2CH1/CPG2質粒，純化純性載體帶，用限制酶BglII和BamHI消化并純化所需的條帶(大約2700bp)。用限制酶BamHI消化質粒pNG3/VHss806.077VK-HuCk-NEO，將DNA去磷酸并純化載體帶。將重鏈表達彈夾片段連接入制備的載體中并將連接混合物轉化入大腸桿菌中，通過多種限制性消化檢查方向并篩選具有與輕鏈方向相同的重鏈彈夾的克隆。該質粒命名為pNG3-806.077-CPG2/R6-coexp.-NEO。實施例14(55.1 scFv-CPG2)2融合蛋白的構建美國專利5,665,357中所述的55.1抗體識別CA55.1腫瘤相關抗原，該抗原表達于大多數結腸癌并具在正常結腸組織中僅僅微弱表達或不表達。55.1重輕鏈cDNA序列的測定描述于前述的美國專利的實施例3中。允許用單一pelB前導序列(pICI266)將抗體片段分泌至大腸桿菌周質中的質粒表達載體已于1993年10月11日根據布達佩期條約以許可號NCIMB 40589保藏于國立工業及海洋微生物保藏有限公司(NCIMB)23St Machar Drive，Aberdeen，AB2 1RY，蘇格蘭，英國，按美國專利5,665,357的實施例3.3a中所述修飾此載體以構建pICI1646；按在實例3的進一步子部分中所述用此質粒克隆各種55.1抗體片段，包括命名為pICI1657的55.1 scFv構建體的制備。
用(又稱為pICI-55.1 scFV)的pICI 1657作為構建(55.1ScFv-CPG2)2融合蛋白的起點。用寡核苷酸CME 3270和CME 3272(分別為SEQ ID NOS27與28)以及用質粒pICI1657作為模板DNA而擴增55.1 scFv基因。純化大約790bp的得到的PCR產物帶。類似地，按上面實施例1e中所述將pNG4/A5B7VH-IgG2CH1/CPG2 R6質粒用作標準PCR反應中的模板DNA用寡核苷酸引物CME 3274和CME 3275(分別為SEQ ID NOS29和30)擴增CPG2基因。純化大約1200bp的預期PCR產物條帶。
進行進一步的PCR反應從而將2種純化的PCR反應產物連接(或剪接)起來。使用標準的PCR反應條件，用不同量(0.5到2μl之間)的每種PCR產物但使用25輪循環(而不是通常的15輪循環)，用寡核苷酸CME 3270和CME 3275(SEQ ID NOS27與30)。切下預期大小的(大約2000bp)反應產物，純化并于20μl H2O中洗脫，用限制酶RcoRI消化并加以純化。通過以限制酶EcoRI消化、支磷酸、分離出較大載體帶與較小片段并純化而制備載體pNG4/VHss806.077VH-IgG2CH1/CPG2以接受上面的PCR產物。將類似限制性消化的PCR產物連接入制備的載體中并將連接混合物轉化入大腸桿菌中。從得到的克隆中制備DNA并通過HindIII/NotI限制性消化分析以檢查正確的方向且隨后對適當的克隆測序以確證此融合基因序列。得到多個具有正確序列的克隆并將其中的一個給以質粒命稱pNG4/55.1scFv/CPG2R6。此DNA及融合蛋白的氨基酸序列示于SEQID NOS31與32中。實施例15修飾質粒pNG4/55.1 scFv/CPG2 R6以促進scFv基因交換在構建pNG4/55.1 scFv/CPG2 R6過程中，將獨特的BspEI(AccIII的同裂酶)導入位于抗體與CPG2基因之間的彈性(G4S)3接頭編碼序列中。為了利于克隆其它的scFv構建體，將pNG4/55.1 scFv/CPG2 R6中的CPG2基因3′端的EcoRI位點缺失從而能夠通過EcoRI/BspEI片段克隆在該質粉信號序列后和CPG2基因的5′端在框內插入其它的scFv抗體基因。此修飾通過PCR誘變完成，誘變過程中首先將pNG4/55.1scFv/CPG2 R6用寡核苷酸CME 3903和CME 3906(分別為SEQ IDNOS33和34)加以擴增。其次，用寡核苷酸CME 4040和CME 3905(分別為SEQ ID NOS35和36)再次擴增pNG4/55.1 scFv/CPG2R6。純化大約420bp的第一條預期的PCR產物條帶。類似處理第二個PCR反應并純化大約450bp的預期的PCR產物條帶。
進行進一步的PCR反應以將兩上純化的PCR反應產物連接(或剪接)到一起。使用標準的PCR反應條件，使用不同量的(在0.5到2μl)每種PCR產物但用寡核苷酸CME 3905和CME 3906(SEQ IDNOS36及34)進行15到20個循環。預期大小的(大約840bp)的反應產物進行純化，用限制酶NotI和XbaI進行消化并純化大約460bp的預期片段條帶。
通過以限制酶NotI和XbaI消化、去磷酸并分離較大載體帶與較小片段而將最初的pNG4/55.1 scFv/CPG2 R6制備成接受上面的PCR產物。純化載體知帶并且隨后將類似限制性消化的PCR產物連接入此制備的載體中并將連接混合物轉化入大腸桿菌中。從得到的克隆中制備DNA普通過EcoRI限制性消化分析以檢查此修飾片段的插入并且隨后對適當的克隆測序以證實此序列變化。獲得多個具有正確序列的克隆并將其中的一個克隆給以質粒命名pNG4/55.1scFv/CPG2 R6/delEcoRI。此突變去除了CPG2基因3′的EcoRI位點并同時導入了額外的終止密碼子。達到并包括2個終止密碼子的此融合蛋白基因DNA序列示于SEQ ID NO37中。實施例16806.077 scFv抗體基因的構建用為806.077 VH和VK可變壓基因來源的載體pNG4/VHss806.077VH-IgG2CH1′和pNG3/VKss806.077VK-HuCk-NEO構建806.077 scFv。用寡核苷酸CME3260和CME 3266(分別為SEQ ID NOS39和40)用標準的PCR條件從pNG4/VHss806.077VH-IgG2CH1′質粒中擴增806.077VH基因。用寡核苷酸CME 3262和CME 3267(分別為SEQ ID NOS41與42)從pNG3/VKss806.077VK-HuCk-NEO質粒中擴增806.077VK。純化VH和VK PCR反應產物。
進行進一步的PCR反應從而將這2個純化的PCR反應產物連接(剪接)起來。使用標準的PCR反應條件，使用不同量的(0.5到2μl)每種PCR產物但用兩側寡核苷酸CME 3260和CME 3262(SEQ IDNOS39和41)進行15到25個循環。純化預期大小(大約730bp)的反應產物，用限制酶NcoI和XhoI消化并純化大約720bp的預期片段條帶。
通過標準的克隆技術在存在的XhoI和EcoRI限制性位點之間插入從2個寡核苷酸CME 3143和CME 3145(SEQ ID NOS45和46)制備的雙鏈DNA彈夾而進一步修飾pICI1657質粒(又稱為pICI 55.1scFv)從而構建載體pICI 266-55.1 scFvtag/his(得到的55.1 scFvtag/his基因的DNA序列示于SEQ ID NO47中)。通過以限制酶NcoI和XhoI消化、去磷酸并分離較大的載體帶與較小的片段而接受上面的PCR產物。純化此載體帶并且隨后將類似限制性消化的PCR產物連接入制備的載體中并將連接混合物轉化入大腸桿菌中。從獲得的克隆中制備DNA并通過EcoRI限制性消化分析檢查此修飾片段的插入并且隨后對適當的克隆進行測序以證實此序列變化。得到多個具有正確序列的克隆并將其中一個給以質粒命名pICI266/806IscFvtag/his(又稱為pICI266.806VH/VLssFvtag/his)。806I scFvtag/his基因的DNA與蛋白序列示于(SEQ ID NOS25與26中)。實施例17(806.077 scFv-CPG2)2融合蛋白的構建將pICI266/806 IscFvtag/his質粒用作806scFv的來源。用寡核苷酸CME 3907和CME 3908(SEQ ID NOS48和49)擴增此基因并純化預期大小的條帶。然后用限制酶EcoRI和BspEI消化此片段后純化大約760bp的預期片段條帶。
通過用限制酶EcoRI和BspEI消化上述片段，去磷酸并分離較大載體與較小片段而制備pNG4/55.1 scFv/CPG2 R6/del EcoRI質粒。純化載體帶并隨后將類似地限制性消化的片段連接入制備的載體中并將連接混合物轉化入大腸桿菌中。從得到的克隆中制備DNA并通過EcoRI限制性消化分析以檢查修飾片段的插入。隨后將適當的克隆測序以確證此基因序列。得到多個具有正確序列的克隆并將其中一個給以質粒命名pNG4/806 IscFv/CPG2 R6/del EcoRI。此融合蛋白基因806 IscFv/CPG2R6的DNA和蛋白序列示于(SEQ ID NOS50與51中)。實施例18共轉染，抗體-CPG2融合蛋白的暫時表達如實施例1f中所述，可用給定的標準條件轉染編碼其它融合蛋白變異體的質粒以獲得其編碼的融合蛋白在COS7細胞中的暫時表達。，在(Fab-CPG2)2融合蛋白的情況，可同時共轉染適當的質粒或轉染共表達蛋白。類似地，也可通過相同的方法軌染(scFv-CPG2)2融合蛋白的單一表面質粒。在每種情況下，在每次轉染中使用最多共4mgDNA。實施例19蛋白表達的基因開關如實施例1j中所述，緊密控制但可誘導的基因開關系統如“TET開”或“TET關”(Grossen，M.等(1995)科學2681766-1769)或蛻皮素/muristerone A(No.D.等(1996)PNAS 933346-3351)可用于表達融合蛋白。可用實施例5中所述的適當方法與克隆策略進行需要IRES序列的抗體Fab-酶融合表達。如果此融合蛋白產物為單一多肽鏈如scFv-酶構建體可以使用將適當的基因彈夾插入到可開關的表達載體中。實施例20分泌抗體酶融合蛋白的COS7細胞特性的測定可按實施例1g中所述分析COS7細胞上清物質中抗體融合蛋白的存在。類似地可按前面實施例1h中所述用表達的融合蛋白與CPG2前體藥物與體外細胞毒性分析中。基于HPLC的酶活性分析可顯示CPG2酶活性存在于細胞上清中并可用抗CPG2報告抗體進行抗-CEAELISA檢測以證實與二價A5B7抗體分子以相同的水平結合蛋白并且同時證明抗體-CPG2融合蛋白(不僅僅為抗體成分)結合CEA。
同時用2種報告抗體分析的Western印跡分析清楚地顯示預期大小的融合蛋白亞單位。由于CPG2僅已知在二聚化狀態的顯示出酶活性并且因為僅僅抗體酶融合蛋白的存在，故表明該融合蛋白(在SDS/PAGE條件下所見到的)在“天然”緩沖條件中通過天然CPG2二聚化機制二聚化以形成二聚化的抗體酶融合蛋白分子。此外，此分子同時顯示出CPG2酶促活性和CEA抗原結合特性，這與單獨的酶或抗體比較在融合蛋白方面中沒有顯著不同。從細胞毒性分析中獲得的結果可證明抗體-酶融合蛋白(與前體藥物一起)與相當水平的A5B7 F(ab′)2-CPG2綴合物(與相同二前體藥物)相比導致至少相同二細胞殺傷并在分析結束時得到更少數目的細胞。由于細胞殺傷(高于基本對照水平)僅可在此前體藥物被CPG2酶轉移成活性藥物時發生(并且由于沖洗這些細胞以去除未結合的蛋白，當加入前體藥物時僅僅結合細胞的酶將會保持)。因此，該實驗可證明與常規的A5B7 F(ab)2-CPG2綴合物相比至少有更大程度的細胞殺傷數量的(A5B7-CPG2 R6)2融合蛋白保持結合(可能由于更多的前體藥物至藥物的轉換)發生。實施例21重組腫瘤細胞表達的抗體酶融合蛋白特性體外及體內的測定可按實施例4中所述構建表達融合蛋白的腫瘤細胞系。
可用實施例7中所述的技術顯示融合蛋白質在表達抗體酶融合蛋白的重組LoVo腫瘤細胞表面上的滯留。可按實施例8中所述證明前體藥物(由CPG2轉換成活性藥物)通過抗體CPG2融合蛋白基因對轉雜的培養LoVo腫瘤細胞的選擇性殺傷。可按實施例9中所述在無胸腺小鼠中建立表達抗體酶融合蛋白的LoVo腫瘤的異體移植。也可按實施例10中所述測定腫瘤導體移植樣品中的酶活性。
按實施例11中所述測定血漿樣品中的酶活性。可用實施例12中所述的方法評估PGP前體藥物在表達抗體CPG2融合蛋白LoVo腫瘤中的抗腫瘤活性。
這些實驗結果可用于顯示CEA陽性腫瘤細胞系分泌的抗體-CPG2融合蛋白(通過CEA)結合到細胞表面上而由CEA陰性腫瘤表達的相同蛋白沒有顯示出這種結合。
這些結果可證明表達抗體-CPG2融合蛋白的轉染細胞可將PGP前體藥物轉換成更為活性的藥物而未轉染的LoVo細胞不能夠轉換前體藥物。因此，與未轉染的LoVo細胞相比，就細胞殺傷而言轉染的LoVo細胞對PGP前體藥物的敏感性要高100倍，因此證明用抗體-酶融合蛋白基因轉染腫瘤細胞可導致前體藥物對腫瘤選擇性細胞殺傷。
通過與僅僅用制備緩沖液處理的情況相比PGP處理的腫瘤體積減小并且與制備緩沖液處理的腫瘤相比，PGP處理的腫瘤要花費顯著更長的時間達到其最初體積的4倍來判斷，施用PGP至從重組LoVo細胞或重組LoVo/母本LoVo細胞混合物建立的LoVo腫瘤可導致明顯的抗腫瘤效應。相反，施用PGP至從未轉染細胞建立的LoVo腫瘤中沒有導致明顯的抗腫瘤活性。
類似的研究可用于證明于適當的基因轉換載體中轉移至從未轉染的母本LoVo細胞制備的LoVo腫瘤中的抗體酶基因當與PGP前體藥物聯合使用時可導致顯著的抗腫瘤活性。因此，將未轉染的LoVo細胞注射至無胸腺裸鼠(每只小鼠1×107個腫瘤細胞)中且一旦腫瘤為5-7mm的直徑，將含有抗體-酶融合蛋白基因的載體注射至腫瘤內。使抗體-酶融合蛋白表達并結合至LoVo腫瘤細胞上1-7天后，按前述施用PGP前體藥物。這與接受制備緩沖液而不是PGP前體藥物的對照小鼠相比得到了顯著的抗腫瘤活性。實施例22(鼠A5B7 Fab-CPG2)2融合蛋白的制備基本上按國際專利申請WO 97/42329(Zeneca有限公司，1997年11月13日公開)的實施例48(d)部分中所述通過將在其C-端通過彈性的(G4S)3肽接頭連接至CPG2上的A5B7輕鏈及A5B7 Fd基因克隆至pee14共表達載體中而由COS-7和CHO細胞表達(鼠A5B7 fab-CPG2)2。
從(國際專利申請WO 96/20011(Zeneca有限公司)的參考實施例5的g部分中所述的)pAF8中分離鼠A5B7輕鏈。用EcoRI切割質粒pAF8并通過于1％瓊脂糖凝膠上的電泳分離得到的732bp的片段。將此片段克隆入用EcoRI類似切割的pEE14(由Bebbington在方法酶學方法指南(1991)2，136-145中所述)中并用得到的質粒轉化大腸桿菌菌株DH5α。將轉化的細胞鋪板于含氨芐青霉素(100μg/ml)的L-瓊脂上。通過DNA序列分析(SEQ ID NO57)證實含有具有正確序列與方向質粒的克隆并將該質粒命名為pEE14/A5B7muVkmnCk。編碼的信號序列(氨基酸殘基1到22)和鼠輕鏈(氨基酸殘基23到235)的氨基酸序列示于SEQ ID NO58中。
從CPG2基因的R6變異體(實施例1d)和pAF1中的鼠A5B7 Fd序列(描述于國際專利申請WO 96/20011(Zeneca有限公司)參考實施例5中d部分中所述)中制備鼠Fd-CPG2基因。用寡核苷酸SEQ IDNOS53和54對pAF1進行PCR反應得到247bp的片段。此片段用HindIII和BamHI切割并克隆入類似的pUC19中。得到的質粒用于轉化大腸桿菌DH5α菌株。將轉化的細胞鋪盤于含氨芐青霉素(100μg/ml)的L瓊脂上。將含有具有正確序列質粒的克隆命名為pUC19/muCH1/NcoI-AccIII(Fd)。用寡核苷酸SEQ ID NOS55和56對pNG/VKss/CPG2/R6-neo(實施例1)的第二次PCR得到265bp的片段，用HindIII與EcoRI切割并克隆入類似上述切割的pUC19中以得到質粒pUC19/muCH1-接頭-CPG2/AccIII-SacII。用HindIII和AccIII切割質粒pUC19/muCH1/NcoI-AccIII(Fd)并通過于1％瓊脂糖凝膠上電泳而分離出258bp的片段。將此片段克隆入HindIII與AccIII切割的pUC19/muCH1-接頭-CPG2/AccIII-SacII中以得到質粒pUC19/muCH1-接頭-CPG2/AccIII-SacI。通過用SacII和EcoRI切割之而以pNG/VKss/CPG2/R6-neo中分離956bp的片段。將該片段克隆入SacII和EcoRI切割的pUC19/muCH1-接頭-RC/CPG2(R6)。通過從pAF1中分離HindIII到NcoI片段的498bp的片段并將之克隆入HindIII與NcoI切割的pUC19/muCH1-接頭-RC/CPG2(R6)中而制備完整的基因構建體。將得到的質粒用于轉化大腸桿菌DH5α菌株。將轉化的細胞鋪盤于含有氨芐青霉素(100μg/ml)的L-瓊脂上。含有具有正確序列與方向質粒的克隆通過DNA序列分析(SEQ ID NO59)加以證實將將此質粒命名為pUC19/muA5B7-RC/CPG2(R6)。編碼的信號序列(氨基酸殘基1到19)與鼠Fd-接頭-CPG2(氨基酸殘基20到647)的氨基酸序列示于SEQ ID NO60中作為選擇，可通過全基因合成獲取實施例1中所述的CPG2基因序列并按實施例1d中所轉變為R6變異體。在該情況中，SEQ ID NO59中位置933的堿基C變為G、SEQ ID NO60的氨基酸序列保持不變。
為了在pEE14載體中的表達，將該基因首先克隆入pEE6(此為pee6.hCMV的衍生物stephems和Cockett，1989，核酸研究17，7110，其中的hCMV啟動子上游的HindIII位點已轉換成BglII位點)。質粒pUC19/muA5B7-RC/CPG2(R6)用HindIII和EcoRI切割并通過在1％的瓊脂糖凝膠上電泳而分離1974bp的片段。將此克隆入大腸桿菌DH5α中HinDIII和EcoRI切割的pEE6中以得到質粒pEE6/muA5B7-RC/CPG2(R6)。通過首先以Bgl值和BamHI切割pEE6/muA5B7-RC/CPG2(R6)。并于1％瓊脂糖凝膠上分離4300bp的片段而制備pEE114共表達載體。將此片段克隆入BglII和BamHI切割的pEE14/A5B7muCK中。將得到的質粒用于轉化大胸桿菌DH5α菌株，將轉化的細胞鋪盤于含氨基卡青霉素(100μg/ml)的L瓊脂上。通過DNA序列分析證實含有具有正確序列與方向質粒的克隆并將此質粒命名為pEE14/muA5B7-RC/CPG2(R6)。
為了(鼠A5B7 Fab-CPG2)2的表達，用質粒pEE14/muA5B7-RC/CPG2(R6)轉染COS-7或XHO細胞，此操作按1997年11月13日公開的Zenoca有限公司的國際專利申請WO 97/42329的實施例48中所述進行。按實施例1中所述分析COS細胞上清和CHO克隆上清中的活性并且顯示具有CEA結合和CPG2酶活性。實施例23藥物組合物下面說明含有可與適當的前體藥物聯合用于治療的本發明基因構建體的代表性藥物劑量形式。
用于腸道外或直接注射入腫瘤組織中的無菌水溶液，含有107-1011個包括實施例1中所述基因構建體的腺病毒顆粒。3-7天后，將3個1g劑量的前體藥物以小時為間隔作為無菌液而施用。前體藥物選自N-(4-[N，N-雙(2-碘乙基)氨基]苯氧羰基)-L-谷氨酸，N-(4-[N，N-雙(2-氯乙基)氨基]-苯氧羰基)-L-谷氨酸-γ-(3，5-二羧基)酰基苯胺或N-(4-[N，N-雙(2-氯乙基)氨基]-苯氧羰基)-L-谷氨酸或其藥物上可接受的鹽。
序列表(1)一般信息(i)申請人(A)名稱Zeneca有限公司(B)街道15 Stanhope Gate(C)城市倫敦(D)聯邦英格蘭(E)國家英國(F)郵編(ZIP)W1Y 6LN(G)電話0171 304 5000(H)電傳0171 304 5151(I)電報0171 304 2042(ii)發明題目化合物(iii)序列數目60(iv)計算機可讀形式(A)介質類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟件專利發布#1.0，#1.30版本(EPO)(iv)優先申請數據(A)申請號GB 9709421.3(B)提交日期1997年5月10日(2)SEQ ID NO1信息(i)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO1GGGAATTCCT CGAGGAGCTC C 21(2)SEQ ID NO2信息(i)序列特征(A)長度27個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO2CCGGGGAGCT CCTCGAGGAA TTCCCGC 27(2)SEQ ID NO3信息(i)序列特征(A)長度18個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO3CAGAAGCGCG ACAACGTG 18(2)SEQ ID NO4信息(i)序列特征(A)長度39個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO4CGAGGCCTTG CCGGTGATCT GGACCTGCAC GTAGGCGAT 39(2)SEQ ID NO5信息(i)序列特征(A)長度63個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO5GGGGATGATG TTCGAGACCT GGCCGGCCTT GGCGATGGTC CACTGGAAGC GCAGGTTCTT 60CGC63(2)SEQ ID NO6信息(i)序列特征(A)長度18個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID 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(D)拓撲學線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO52GAATTCGCCG CCACTATGGA TTTTCAAGTG CAGATTTTCA GCTTCCTGCT AATCAGTGCT 60TCAGTCATAA TGTCCAGAGG ACAAACTGTT CTCTCCCAGT CTCCAGCAAT CCTGTCTGCA 120TCTCCAGGGG AGAAGGTCAC AATGACTTGC AGGGCCAGCT CAAGTGTAAC TTACATTCAC 180TGGTACCAGC AGAAGCCAGG TTCCTCCCCC AAATCCTGGA TTTATGCCAC ATCCAACCTG 240GCTTCTGGAG TCCCTGCTCG CTTCAGTGGC AGTGGGTCTG GGACCTCTTA CTCTCTCACA 300ATCAGCAGAG TGGAGGCTGA AGATGCTGCC ACTTATTACT GCCAACATTG GAGTAGTAAA 360CCACCGACGT TCGGTGGAGG CACCAAGCTC GAGATCAAAC GGACTGTGGC TGCACCATCT 420GTCTTCATCT TCCCGCCATC TGATGAGCAG TTGAAATCTG GAACTGCCTC TGTTGTGTGC 480CTGCTGAATA ACTTCTATCC CAGAGAGGCC AAAGTACAGT GGAAGGTGGA TAACGCCCTC 540CAATCGGGTA ACTCCCAGGA GAGTGTCACA GAGCAGGACA GCAAGGACAG CACCTACAGC 600CTCAGCAGCA CCCTGACGCT GAGCAAAGCA GACTACGAGA AACACAAAGT CTACGCCTGC 660GAAGTCACCC ATCAGGGCCT GAGTTCGCCC GTCACAAAGA GCTTCAACAG GGGAGAGTGT 720TAATAGGAGC TCGGATCCAG ATCTGAGCTC CTGTAGACGT CGACATTAAT TCCGGTTATT 780TTCCACCATA TTGCCGTCTT TTGGCAATGT GAGGGCCCGG AAACCTGGCC CTGTCTTCTT 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NO54GCCACGGATC CCGCCACCTC CGGAGCCACC ACCGCCACAA TCCCTGGGCA CAATTTTCTT 60G 61(2)SEQ ID NO55信息(i)序列特征(A)長度94個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO55GCCCAGGAAG CTTGGCGGTG GTGGCTCCGG AGGTGGCGGT AGCGGTGGCG GGGGTTCCCA 60GAAGCGCGAC AACGTGCTGT TCCAGGCAGC TACC 94(2)SEQ ID NO56信息(i)序列特征(A)長度51個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO56ATGTGCGAAT TCAGCAGCAG GTTCTTGCCG CCGCGGCCCT TGATCTTGCC C 51(2)SEQ ID NO57信息(i)序列特征(A)長度732個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型其它核酸(ix)特征(A)名字/關鍵CDS(B)位置16..720(xi)序列描述SEQ ID NO57GAATTCGCCG CCACC ATG GAT TTT CAA GTG CAG ATT TTC AGC TTC CTG CTA51Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu1 5 10ATC AGT GCT TCA GTC ATA ATG TCC AGA GGA CAA ACT GTT CTC TCC CAG 99Ile Ser Ala Ser Val Ile Met Ser Arg Gly Gln Thr Val Leu Ser Gln15 20 25TCT CCA GCA ATC CTG TCT GCA TCT CCA GGG GAG AAG GTC ACA ATG ACT147Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr30 35 40TGC AGG GCC AGC TCA AGT GTA ACT TAC ATT CAC TGG TAC CAG CAG AAG195Cys Arg 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(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型其它核酸(ix)特征(A)名字/關鍵CDS(B)位置16..1956(xi)序列描述SEQ ID NO59AAGCTTGCCG CCACC ATG AAG TTG TGG CTG AAC TGG ATT TTC CTT GTA ACA 51Met Lys Leu Trp Leu Asn Trp Ile Phe Leu Val Thr1 5 10CTT TTA AAT GGT ATC CAG TGT GAG GTG AAG CTG GTG GAG TCT GGA GGA99Leu Leu Asn Gly Ile Gln Cys Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly15 20 25GGC TTG GTA CAG CCT GGG GGT TCT CTG AGA CTC TCC TGT GCA ACT TCT 147Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser30 35 40GGG TTC ACC TTC ACT GAT TAC TAC ATG AAC TGG GTC CGC CAG CCT CCA 195Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro45 50 55 60GGA AAG GCA CTT GAG TGG TTG GGT TTT ATT GGA AAC AAA GCT AAT GGT 243Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Gly Phe Ile Gly Asn Lys Ala Asn Gly65 70 75TAC ACA ACA GAG TAC AGT GCA TCT GTG AAG GGT CGG TTC ACC ATC TCC 291Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser80 85 90AGA GAT AAA TCC CAA AGC ATC CTC TAT CTT CAA ATG AAC ACC CTG AGA 339Arg Asp Lys Ser Gln Ser Ile Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg95 100 105GCT GAG GAC AGT GCC ACT TAT TAC TGT ACA AGA GAT AGG GGG CTA CGG 387Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Thr Arg Asp Arg Gly Leu Arg110 115 120TTC TAC TTT GAC TAC TGG GGC CAA GGC ACC ACT CTC ACA GTC TCC TCA 435Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser125 130 135 140GCC AAA ACG ACA CCC CCA TCT GTC TAT CCA CTG GCC CCT GGA TCT GCT 483Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala145 150 155GCC CAA ACT AAC TCC ATG GTG ACC CTG GGA TGC CTG GTC AAG GGC TAT 531Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr160 165 170TTC CCT GAG CCA GTG ACA GTG ACC TGG AAC TCT GGA TCT CTG TCC AGC 579Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser175 180 185GGT GTG CAC ACC TTC CCA GCT GTC CTG CAG TCT GAC CTC TAC ACT CTG627Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu190 195 200AGC AGC TCA GTG ACT GTC CCC TCC AGC ACC TGG CCC AGC GAG ACC GTC675Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val205 210 215 220ACC TGC AAC GTT GCC CAC CCG GCC AGC AGC ACC AAG GTG GAC AAG AAA723Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys225230 235ATT GTG CCC AGG GAT TGT GGC GGT GGT GGC TCC GGA GGT GGC GGT AGC771Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser240 245 250GGT GGC GGG GGT TCC CAG AAG CGC GAC AAC GTG CTG TTC CAG GCA GCT819Gly Gly Gly Gly Ser Gln Lys Arg Asp Asn Val Leu Phe Gln Ala Ala255 260 265ACC GAC GAG CAG CCG GCC GTG ATC AAG ACG CTG GAG AAG CTG GTC AAC867Thr Asp Glu Gln Pro Ala Val Ile Lys Thr Leu Glu Lys Leu Val Asn270 275 280ATC GAG ACC GGC ACC GGT GAC GCC GAG GGC ATC GCC GCT GCG GGC AAC915Ile Glu Thr Gly Thr Gly Asp Ala Glu Gly Ile Ala Ala Ala Gly Asn285 290 295 300TTC CTC GAG GCC GAG CTC AAG AAC CTC GGC TTC ACG GTC ACG CGA AGC963Phe Leu Glu Ala Glu Leu Lys Asn Leu Gly Phe Thr Val Thr Arg Ser305 310 315AAG TCG GCC GGC CTG GTG GTG GGC GAC AAC ATC GTG GGC AAG ATC AAG 1011Lys Ser Ala Gly Leu Val Val Gly Asp Asn Ile Val Gly Lys Ile Lys320 325 330GGC CGC GGC GGC AAG AAC CTG CTG CTG ATG TCG CAC ATG GAC ACC GTC 1059Gly Arg Gly Gly Lys Asn Leu Leu Leu Met Ser His Met Asp Thr Val335 340 345TAC CTC AAG GGC ATT CTC GCG AAG GCC CCG TTC CGC GTC GAA GGC GAC 1107Tyr Leu Lys Gly Ile Leu Ala Lys Ala Pro Phe Arg Val Glu Gly Asp350 355 360AAG GCC TAC GGC CCG GGC ATC GCC GAC GAC AAG GGC GGC AAC GCG GTC 1155Lys Ala Tyr Gly Pro Gly Ile Ala Asp Asp Lys Gly Gly Asn Ala Val365 370 375 380ATC CTG CAC ACG CTC AAG CTG CTG AAG GAA TAC GGC GTG CGC GAC TAC 1203Ile Leu His Thr Leu Lys Leu Leu Lys Glu Tyr Gly Val Arg Asp Tyr385 390 395GGC ACC ATC ACC GTG CTG TTC AAC ACC GAC GAG GAA AAG GGT TCC TTC 1251Gly Thr Ile Thr Val Leu Phe Asn Thr Asp Glu Glu Lys Gly Ser Phe400 405 410GGC TCG CGC GAC CTG ATC CAG GAA GAA GCC AAG CTG GCC GAC TAC GTG 1299Gly Ser Arg Asp Leu Ile Gln Glu Glu Ala Lys Leu Ala Asp Tyr Val415 420 425CTC TCC TTC GAG CCC ACC AGC GCA GGC GAC GAA AAA CTC TCG CTG GGC 1347Leu Ser Phe Glu Pro Thr Ser Ala Gly Asp Glu Lys Leu Ser Leu Gly430 435 440ACC TCG GGC ATC GCC TAC GTG CAG GTC AAC ATC ACC GGC AAG GCC TCG 1395Thr Ser Gly Ile Ala Tyr Val Gln Val Asn Ile Thr Gly Lys Ala Ser445 450 455 460CAT GCC GGC GCC GCG CCC GAG CTG GGC GTG AAC GCG CTG GTC GAG GCT 1443His Ala Gly Ala Ala Pro Glu Leu Gly Val Asn Ala Leu Val Glu Ala465 470 475TCC GAC CTC GTG CTG CGC ACG ATG AAC ATC GAC GAC AAG GCG AAG AAC 1491Ser Asp Leu Val Leu Arg Thr Met Asn Ile Asp Asp Lys Ala Lys Asn480 485 490CTG CGC TTC AAC TGG ACC ATC GCC AAG GCC GGC AAC GTC TCG AAC ATC 1539Leu Arg Phe Asn Trp Thr Ile Ala Lys Ala Gly Asn Val Ser Asn Ile495 500 505ATC CCC GCC AGC GCC ACG CTG AAC GCC GAC GTG CGC TAC GCG CGC AAC 1587Ile Pro Ala Ser Ala Thr Leu Asn Ala Asp Val Arg Tyr Ala Arg Asn510 515 520GAG GAC TTC GAC GCC GCC ATG AAG ACG CTG GAA GAG CGC GCG CAG CAG 1635Glu Asp Phe Asp Ala Ala Met Lys Thr Leu Glu Glu Arg Ala Gln Gln525 530 535 540AAG AAG CTG CCC GAG GCC GAC GTG AAG GTG ATC GTC ACG CGC GGC CGC 1683Lys Lys Leu Pro Glu Ala Asp Val Lys Val Ile Val Thr Arg Gly Arg545 550 555CCG GCC TTC AAT GCC GGC GAA GGC GGC AAG AAG CTG GTC GAC AAG GCG 1731Pro Ala Phe Asn Ala Gly Glu Gly Gly Lys Lys Leu Val Asp Lys Ala560 565 570GTG GCC TAC TAC AAG GAA GCC GGC GGC ACG CTG GGC GTG GAA GAG CGC 1779Val Ala Tyr Tyr Lys Glu Ala Gly Gly Thr Leu Gly Val Glu Glu Arg575 580 585ACC GGC GGC GGC ACC GAC GCG GCC TAC GCC GCG CTC TCA GGC AAG CCA 1827Thr Gly Gly Gly Thr Asp Ala Ala Tyr Ala Ala Leu Ser Gly Lys Pro590 595 600GTG ATC GAG AGC CTG GGC CTG CCG GGC TTC GGC TAC CAC AGC GAC AAG 1875Val Ile Glu Ser Leu Gly Leu Pro Gly Phe Gly Tyr His Ser Asp Lys605 610 615 620GCC GAG TAC GTG GAC ATC AGC GCG ATT CCG CGC CGC CTG TAC ATG GCT 1923Ala Glu Tyr Val Asp Ile Ser Ala Ile Pro Arg Arg Leu Tyr Met Ala625 630 635GCG CGC CTG ATC ATG GAT CTG GGC GCC GGC AAG TGATAAGAAT TCCTCGAG 1974Ala Arg Leu Ile Met Asp Leu Gly Ala Gly Lys640 645(2)SEQ ID NO60信息(i)序列特征(A)長度647個氨基酸(B)類型氨基酸
(D)拓撲學線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO60Met Lys Leu Trp Leu Asn Trp Ile Phe Leu Val Thr Leu Leu Asn Gly1 5 10 15Ile Gln Cys Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln20 25 30Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe35 40 45Thr Asp Tyr Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu50 55 60Glu Trp Leu Gly Phe Ile Gly Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu65 70 75 80Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ser85 90 95Gln Ser Ile Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Ser100 105 110Ala Thr Tyr Tyr Cys Thr Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp115 120 125Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr130 135 140Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn145 150 155 160Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro165 170 175Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr180 185 190Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val195 200 205Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val210 215 220Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg225 230 235 240Asp Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly245 250 255Ser Gln Lys Arg Asp Asn Val Leu Phe Gln Ala Ala Thr Asp Glu Gln260 265 270Pro Ala Val Ile Lys Thr Leu Glu Lys Leu Val Asn Ile Glu Thr Gly275 280 285Thr Gly Asp Ala Glu Gly Ile Ala Ala Ala Gly Asn Phe Leu Glu Ala290 295 300Glu Leu Lys Asn Leu Gly Phe Thr Val Thr Arg Ser Lys Ser Ala Gly305 310 315 320Leu Val Val Gly Asp Asn Ile Val Gly Lys Ile Lys Gly Arg Gly Gly325 330 335Lys Asn Leu Leu Leu Met Ser His Met Asp Thr Val Tyr Leu Lys Gly340 345 350Ile Leu Ala Lys Ala Pro Phe Arg Val Glu Gly Asp Lys Ala Tyr Gly355 360 365Pro Gly Ile Ala Asp Asp Lys Gly Gly Asn Ala Val Ile Leu His Thr370 375 380Leu Lys Leu Leu Lys Glu Tyr Gly Val Arg Asp Tyr Gly Thr Ile Thr385 390 395 400Val Leu Phe Asn Thr Asp Glu Glu Lys Gly Ser Phe Gly Ser Arg Asp405 410 415Leu Ile Gln Glu Glu Ala Lys Leu Ala Asp Tyr Val Leu Ser Phe Glu420 425 430Pro Thr Ser Ala Gly Asp Glu Lys Leu Ser Leu Gly Thr Ser Gly Ile435 440 445Ala Tyr Val Gln Val Asn Ile Thr Gly Lys Ala Ser His Ala Gly Ala450 455 460Ala Pro Glu Leu Gly Val Asn Ala Leu Val Glu Ala Ser Asp Leu Val465 470 475 480Leu Arg Thr Met Asn Ile Asp Asp Lys Ala Lys Asn Leu Arg Phe Asn485 490 495Trp Thr Ile Ala Lys Ala Gly Asn Val Ser Asn Ile Ile Pro Ala Ser500 505 510Ala Thr Leu Asn Ala Asp Val Arg Tyr Ala Arg Asn Glu Asp Phe Asp515 520 525Ala Ala Met Lys Thr Leu Glu Glu Arg Ala Gln Gln Lys Lys Leu Pro530 535 540Glu Ala Asp Val Lys Val Ile Val Thr Arg Gly Arg Pro Ala Phe Asn545 550 555 560Ala Gly Glu Gly Gly Lys Lys Leu Val Asp Lys Ala Val Ala Tyr Tyr565 570 575Lys Glu Ala Gly Gly Thr Leu Gly Val Glu Glu Arg Thr Gly Gly Gly580 585 590Thr Asp Ala Ala Tyr Ala Ala Leu Ser Gly Lys Pro Va1 Ile Glu Ser595 600 605Leu Gly Leu Pro Gly Phe Gly Tyr His Ser Asp Lys Ala Glu Tyr Val610 615 620Asp Ile Ser Ala Ile Pro Arg Arg Leu Tyr Met Ala Ala Arg Leu Ile625 630 635 640Met Asp Leu Gly Ala Gly Lys64權利要求
1.編碼細胞靶向部分和異源前體藥物活化酶用作哺乳動物宿主中藥物的基因構建體，其中的基因構建體能夠表達細胞靶向部分和異源前體藥物活化酶作為哺乳動物宿主細胞中的綴合物并且其中的綴合物被導向離開此細胞，之后選擇性定位于由細胞靶向部分所識別的細胞表面抗原上。
2.根據權利要求1的用作藥物的基因構建體，其中的細胞靶向部分為抗體。
3.根據權利要求2的用作藥物的基因構建體，其中的抗體為選自抗體A5B7或806.077抗體的抗CEA抗體。
4.根據前面任一權利要求的用作藥物的基因構建體，其中的異源前體藥物活化酶為羧肽酶。
5.根據權利要求4的用作藥物的基因構建體，其中的羧肽酶為CPG2。
6.根據權利要求5的用作藥物的基因構建體，其中的CPG2具有突變的多肽糖基化位點從而阻止或減少在哺乳動物細胞中表達時的糖基化。
7.根據權利要求5-6中任意一個權利要求的用作藥物的基因構建體，其中的抗體-酶CPG2綴合物為融合蛋白，其中的酶通過抗體重鏈或輕鏈融合至該抗體的C-末端，由此該編碼綴合物表達時的二聚化可通過CPG2上的二聚化區域發生。
8.根據權利要求7用作藥物的基因構建體，其中的融合蛋白通過將抗體Fab重鏈的C-末端連接至CPG2分子的N-末端以形成Fab-CPG2而形成，由此兩個Fab-CPG2分子表達時經過CPG2二聚化以形成(Fab-CPG2)2綴合物。
9.根據權利要求4的用作藥物的基因構建體，其中的羧肽酶選自[D253K]HCPB，[G251T，D253K]HCPB或[A248S，G251T，D253K]HCPB。
10.根據前面任一權利要求的用作藥物的基因構建體，其包括含有啟動子與控制元件的轉錄調節序列，此調節序列包括遺傳開關以控制該基因構建體的表達。
11.根據權利要求10的用作藥物的基因構建體，其中的轉錄調節序列包括受四環素或蛻皮素存在而調節的遺傳開關控制元件。
12.根據權利要求10或11的用作藥物的基因構建體，其中的啟動子依賴于細胞類型并且選自下面的啟動子癌胚抗原(CEA)；α-胚胎蛋白(AFP)；酪氨酸羥化酶；乙酰膽堿轉移酶；神經元特異性烯醇化酶；胰島素；膠質細胞原纖維酸性蛋白；HER-2/neu；c-erbB2；和N-myc。
13.根據前面任一權利要求的用作藥物的基因構建體，其被包裹于腺病毒中用于轉移至哺乳動物宿主中。
14.權利要求1-12中任一權利要求中定義的基因構建體在制備用于哺乳動物宿主中癌癥治療的藥物中的用途。
15.用于哺乳動物宿主中匹配的二組分系統，其中的組分包括(i)包括權利要求1-13中任一權利要求中定義基因構建體的第一種組分和；(ii)包括可由第一種組分編碼的異源酶轉換成細胞毒性藥物前體藥物的第二種組分。
16.根據權利要求15的匹配的二組分系統，其中第一種組分包括編碼異源酶CPG2的基因；并且第二種組分前體藥物選自N-(4-[N，N-雙(2-碘乙基)氨基]苯氧羰基)-L-谷氨酸，N-(4-[N，N-雙(2-氯乙基)氨基]-苯氧羰基)-L-谷氨酸-γ-(3，5-二羧基)酰基苯胺或N-(4-[N，N-雙(2-氯乙基)氨基]-苯氧羰基)-L-谷氨酸或其藥物上可接受的鹽。
17.用于將細胞毒性藥物轉移至一定位點的方法，包括施用含有權利要求1-13中任一權利要求中定義的基因構建體的第一種組分至宿主；然后施用第二種組分至宿主中，該組分包括可由第一種組分編碼的異源酶轉換成細胞毒性藥物的前體藥物。
18.根據權利要求17的方法，其中的第一種組分包括編碼異源酶CPG2的基因；并且第二種組分前體藥物選自N-(4-[N，N-雙(2-碘乙基)氨基]苯氧羰基)-L-谷氨酸，N-(4-[N，N-雙(2-氯乙基)氨基]-苯氧羰基)-L-谷氨酸-γ-(3，5-二羧基)酰基苯胺或N-(4-[N，N-雙(2-氯乙基)氨基]-苯氧羰基)-L-谷氨酸或其藥物上可接受的鹽。
全文摘要
本發明提供一種基因構建體,該構建體編碼細胞靶向部分和異源性前體藥物活化酶而用作哺乳動物中的藥物,其中的基因構建體能夠表達細胞靶向部分和酶而作為哺乳動物宿主靶細胞中的綴合物并且其中的綴合物注定要離開此細胞然后選擇性定位于由該細胞靶向部分所識別的細胞表面抗原上。
文檔編號A61K38/46GK1255163SQ98804929
公開日2000年5月31日 申請日期1998年5月5日 優先權日1997年5月10日
發明者S·C·埃默里, D·C·布拉凱 申請人:曾尼卡有限公司