包含季銨鹽類化合物和siRNA的組合物及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于醫藥生物領域，具體涉及包含季銨鹽類化合物和SiRNA的組合物。
【背景技術】
[0002] 自10多年前RNA干擾（RNA interference，RNAi)技術發現以來，RNAi已經成為 細胞遺傳的關鍵調節器和闡明機體生長、發病機制和衰老的有力工具。siRNA與相關的蛋 白質結合成RNA。RISC通過siRNA的引導識別并降解靶基因的信使RNA(messenger RNA， mRNA)，使特定蛋白的表達受到抑制，進而特異性導致基因沉默。RNAi成功的關鍵在于是否 能將siRNA完整地轉染入靶細胞，與靶基因 mRNA結合，其中siRNA在體內的穩定性具有重 要意義。研究表明：通過對siRNA結構進行化學修飾和對siRNA骨架進行載體修飾是提高 siRNA體內傳遞穩定性的2個重要途徑。
[0003] siRNA發揮作用時具有高度的序列特異性和很強的靶向性。RNAi具有級聯放大 效應，極少量的雙鏈核糖核酸（double-stranded RNA，dsRNA)便可降解比自身濃度大得多 的mRNA，但體內注射siRNA后，復合物必須經過全身循環系統，盡可能避免腎臟腎小球的濾 過，吞噬細胞的吞，血清蛋白吸附和內源性核酸酶的降解，以及網狀內皮系統（RES)的滯 留才能到達靶細胞。siRNA在血清中的穩定性較差，容易被核酸酶RNase降解。靜脈注射 siRNA后，siRNA通過血液循環分布到各大器官，同時經歷消除。siRNA經血管進入組織間質 (外滲），然后橫跨間質到達靶細胞，到達靶細胞后通過內吞攝取。在此過程中，siRNA被內 涵體啟動的內吞小囊泡包埋，必須從內涵體逃逸，釋放到細胞質中，并加載至RISC方能發 揮作用。siRNA的外滲和穿透能力取決于靶組織的物理結構，而它的胞內攝取量還與siRNA 與載體的表面性質有關。將siRNA傳遞到靶部位的最大障礙是內涵體對siRNA和載體的包 埋和溶酶體對siRNA和載體的降解。
[0004] 裸siRNA自身帶負電，分子量大，極性強，很難穿過細胞膜、血管內皮，容易在脾臟 滯留，在生物體內容易被核酸酶降解，半衰期短，轉染效率低，甚至會產生強烈的炎癥反應 等。因此，siRNA的體內穩定性對其療效的發揮至關重要。利用各種載體的協助，將siRNA 通過不同的手段高效地遞送到靶細胞是當前研究的重點。

【發明內容】

[0005] 本發明提供一種包含季銨鹽類化合物和siRNA的組合物，組合物包含siRNA序列 和季銨鹽類化合物或具有季銨鹽類化合物功能的脂質。
[0006] 優選地，所述的組合物還包含磷脂和膽固醇-聚乙二醇中的一種或兩種以上的組 合。
[0007] 優選地，所述的組合物，按照質量份數計算，所述的SiRNAO. 5-3份和季銨鹽類化 合物或具有季銨鹽類化合物功能的脂質1-8份。
[0008] 優選地，所述的組合物，所述的s i RNA序列為HBV s i RNA :
[0009] 正義鏈：[mC] CG [mU] GUG [mC] ACUUCGCUU [mC] A [dT] [dT];
[0010] 反義鏈：UGAAGCGAA⑶G[mC]A[mC]ACGGUC。
[0011] 優選地，所述的組合物，按照質量份數計算，所述的siRNAO. 5-3份，季銨鹽類化合 物或具有季銨鹽類化合物功能的脂質1-5份。
[0012] 優選地，所述的組合物，按照質量份數計算，所述的siRNAO. 5-3份、季銨鹽類化合 物或具有季銨鹽類化合物功能的脂質1-5份，磷脂0-1份和脂質-聚乙二醇3-6份。
[0013] 優選地，所述的組合物，按照質量份數計算，所述的SiRNAl份、季銨鹽類化合物或 具有季銨鹽類化合物功能的脂質1. 5份，磷脂0. 1份和脂質-聚乙二醇4份。
[0014] 優選地，所述的組合物，所述季銨鹽類化合物或具有季銨鹽類化合物功能的脂質 選自三甲基[2,3-(二亞油烯基氧基）丙基]氯化銨、輪環藤寧、DDODMA、DODAP、DSDMA、 DOTAP、DDAB、DC-Chol、DMRIE、DLinDMA、DLenDMA、GL-67、GL-53、GL-89 中的一種或幾種；
[0015] 所述磷脂選自DPPE、DPPC、DPPG、磷脂酰乙醇胺、卵磷脂，磷脂酰肌醇和心肌磷脂中 的一種或幾種；
[0016] 所述脂質-聚乙二醇選自膽固醇-聚乙二醇、雙肉豆蔻酰基甘油聚乙二醇、1，2-二 亞油酰基-順-甘油-3-磷酸乙醇氨、雙棕櫚酰基甘油聚乙二醇和雙硬脂基甘油聚乙二醇 中的一種或幾種。
[0017] 所述季銨鹽類化合物的結構通式如下：
[0018] 其中，R優選為亞油烯基、油烯基、亞油酰基、油酰基、正十二 ，+. 烷基、正十四烷基、正十八烷基；
[0019] 所述季銨鹽類化合物優選為三甲基[2, 3-(二正十六烷氧基）丙基]氯化銨、三甲 基[2, 3-(二正十四烷氧基）丙基]氯化銨、三甲基[2, 3-(二正十二烷氧基）丙基]氯化 銨、三甲基[2, 3-(二油烯基氧基）丙基]氯化銨和三甲基[2, 3-(二油烯基氧基）丙基] 氯化銨中的一種或兩種以上的組合；化合物的制備方法，包括以下各步驟：1)醇與對甲苯 磺酰氯反應生成對甲苯磺酸酯，其中所述醇通式為R〇H，R為C6~24的烷基、C6~24的烯 烴基；
[0020] 2)對甲苯磺酸酯與3_(二甲胺基）_1，2-丙二醇反應生成通式為 化合物；
[0021] 與碘甲烷反應生成通式為 的化合物；

[0022]
與二氯甲烷或二溴甲烷反應生成所述用于脂質體的化合物。
[0023] 步驟1)中R優選為亞油烯基、油烯基、正十二烷、正十四烷、正十六烷。
[0024] 在具體合成時，上述制備方法的步驟1)為將醇、三乙胺、4-二甲氨基吡啶加入二 氯甲烷中，保持在_5°C以下，攪拌16h，然后將對甲苯磺酰氯滴加于二氯甲烷中溶解，并緩 慢升溫至室溫后，反應15h，檢測無醇后，分離有機相，水相二氯甲烷萃取2次，取有機相干 燥，除去溶劑，得對甲苯磺酸油脂。
[0025] 步驟2)為在氬氣保護下，將氫化鈉與四氫呋喃混合攪拌均勻，然后滴加3_(二甲 胺基）-1，2-丙二醇，再滴加對甲苯磺酸油脂，然后升溫至66°C，微回流反應24h，降至室溫 后抽濾，石油醚萃取濾液、合并水洗有機相、干燥、除去溶劑，得黃色油狀物，然后硅膠柱層 析分離得
[0026] 步驟3)為在
加入碘甲烷，室溫下攪拌反應24h，除去溶劑后，得
[0027] 步驟4)為將
溶于二氯甲烷或二溴甲烷中，加入717樹脂，攪拌反應 72h后抽濾得粗品，硅膠柱層析分離得所述用于脂質體的化合物。
[0028] 本發明的另一技術方案是提供一種包含季銨鹽類化合物和siRNA的組合物的制 備方法，包括以下步驟：
[0029] (1)將所述siRNA序列溶解于水或含有9%蔗糖的水中，得溶液一；
[0030] (2)稱取季銨鹽類化合物或具有季銨鹽類化合物功能的脂質、磷脂、膽固醇、月旨 質-聚乙二醇，并將這些組分溶解于溶劑中得溶液二；
[0031] (3)將溶液一與溶液二相互混合均勻后，于室溫下進行真空抽濾，使其中的溶劑逐 漸蒸發；
[0032] (4)待大部分的溶劑蒸發后，進行均質，得到懸浮液；
[0033] (5)再對懸浮液進行高壓均質、凍干，形成干燥物，即得所述包含季銨鹽類化合物 和siRNA的組合物。
[0034] 優選地，所述的組合物制備方法中，所述溶液一與溶液二的體積比為 1: (0. 25-0.8)〇
[0035] 優選地，所述的組合物制備方法中，所述溶劑為甲醇、乙醇、氯仿、丙酮、乙酸乙酯 中的一種或兩種以上的組合。
[0036] 優選地，所述的組合物制備方法中，所述步驟（3)中，均質后的懸浮液中的顆粒大 小為 40-240nm。
[0037] 本發明的可包含季銨鹽類化合物和siRNA的組合物可提高siRNA治療的藥動學特 征，改變生物分布、胞內攝取量、靶向性和轉染效率，減少不良反應等。
【具體實施方式】
[0038] 實施例1
[0039] 1)將亞油醇（順-9，12-十八（碳）二烯醇）13.358，三乙胺7.788,4-二甲氨基 吡啶0.732g加入0.25L三口燒瓶中，加入二氯甲烷30ml，于-10度低溫循環栗中攪拌，降 至-5度以下，將對甲苯璜酰氯13. 35g溶于二氯甲烷20ml于恒壓滴液漏斗中滴加，保持液 溫-5度，90mins滴畢，5ml二氯甲烷沖洗恒壓滴液漏斗，緩慢升溫，室溫反應15h后，TLC石 油醚：乙酸乙酯5:1監測無亞油醇，分離有機相，水相二氯甲烷萃取2次，取有機相用無水 硫酸鎂干燥，旋蒸脫溶，得無色油狀物20。
[0040] 2) 500ml四口燒瓶中加入氫化鈉 I. 5g，四氫呋喃50ml，攪拌均勻，氬氣保護。將 3_(二甲胺基）-1，2-丙二醇Ig通過恒壓滴液漏斗滴加，IOmins滴畢，滴加對甲苯磺酸亞油 醇脂9g，0. 5h內滴畢，升溫至66度，微回流反應24h，顏色淡黃，降溫后，布氏漏斗抽濾，石 油醚萃取濾液，合并水洗有機相，無水硫酸鎂干燥，旋蒸脫溶，得紅色油狀物l〇g。硅膠柱層 析，洗脫劑二氯甲烷：甲醇10 :1分離得2. 73g淡黃色油狀物。
[0041] 3)將N，N，二甲基-2, 3-(二亞油烯基氧基