專利名稱：α-淀粉酶混合物和使用所述混合物的方法
α-淀粉酶混合物和使用所述混合物的方法相關申請的交互參考本申請要求2008年9月25日提交的美國臨時專利申請系列號61/100，092和2009 年9月1日提交的美國臨時專利申請系列號61/238，891的優先權，所述每個臨時專利申請以其整體引入作為參考。序列表本文附帶包含SEQ ID NO :1_20的序列表，并將序列表以其整體引入作為參考。 發明領域本文描述了嗜熱脂肪土芽孢桿菌(GecAacillus stearothermophilus) α -淀粉酶和地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis) α-淀粉酶的混合物。本文所描述的α -淀粉酶混合物適合于多種應用例如淀粉液化和糖化、乙醇生產和/或增甜劑生產。
背景技術：
α -淀粉酶(α -1，4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，Ε. C. 3. 2. 1. 1)構成一組催化淀粉及其他線型或分支1，4_糖苷寡糖和多糖水解的酶。淀粉酶可以商業地用于淀粉加工的初始階段(液化)中；用于谷物濕磨工藝中； 用于醇生產中；用作為洗滌劑基質中的清潔劑；在紡織工業中用于淀粉退漿；用在焙烘應用中；用于飲料工業；用于油田的鉆井工藝中；用于再循環紙張的脫墨中和用于動物飼料中。α-淀粉酶分離自多種多樣的細菌、真菌、植物和動物源。許多工業上重要的 α-淀粉酶分離自芽孢桿菌屬的某些物種(Bacillus sp.)，部分因為芽孢桿菌屬分泌淀粉酶到生長培養基中的能力普遍較高。此外，存在α-淀粉酶的混合物或其變體的需要，其可以利用來自至少兩種細菌菌株的至少兩種α-淀粉酶的最佳特性。例如，由于快速的黏性降低特性，分離自嗜熱脂肪芽孢桿菌 (B. stearothermophilus)的α -淀粉酶(AmyS)已經在燃料乙醇應用中使用。燃料乙醇工廠在漿液經歷噴射蒸煮(jet cooking)步驟前具有20-30分鐘的漿化時間，并且必需在這 20-30分鐘內破壞粘度以使漿液無障礙管流。然而，某些α -淀粉酶或其變體不是熱穩定的，因此當隨時間降低漿液的粘度時，它們在次級液化中經歷了更低的DE斜度(DE slope) 和更低的粘度降低，在所述次級液化中漿液可能保持在85-90°C直到90-120分鐘。因此，在工業中存在鑒定和優化淀粉酶和它們的混合物的需要，所述淀粉酶和它們的混合物在多種生產工藝，例如商業化淀粉液化工藝和乙醇生產工藝中是有用的。低粘度淀粉液化物(starch liquefact)在當前的乙醇生產工藝中是有用的。如果發現了使用優化的α-淀粉酶或其變體的混合物來產生作為發酵原料的該低粘度液化物的方法，那么這對本領域將是非常有用的貢獻。此外，如果發現了用來自兩種不同細菌物種的α -淀粉酶或其變體的混合物處理全磨谷物以改善淀粉液化的方法，那么這對本領域也將是非常有用的貢獻。
在制備發酵原料中另外的挑戰是，發現來自嗜熱脂肪芽孢桿菌的α-淀粉酶，例如在水解線性淀粉酶中不太有效，在酵母發酵條件下造成了退變的不溶性殘余淀粉。已經將在酵母發酵肉湯中的高水平殘余淀粉認作為是影響蒸發器結垢的主要因素之一，所述蒸發器結垢影響乙醇工藝生產中下游工藝的運行。因此，如果發現了可以使用優化的α-淀粉酶或其變體的混合物來降低發酵肉湯中的殘余不可溶性淀粉的方法，那么這對本領域也將是有用的貢獻。發明概述描述了在發酵工藝中對全磨谷物的液化方法。方法包括將含有全磨谷物的含水漿液與來自至少兩種不同細菌物種的淀粉液化α-淀粉酶的混合物接觸。在一個實施方案中，本發明包含α -淀粉酶混合物，所述α -淀粉酶混合物包含 (i)使用在SEQ ID NO :2中所示的氨基酸編號系統的，其中替換了 S242處氨基酸的嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶(AmyS)；和(ii)地衣芽孢桿菌α-淀粉酶。混合物可以進一步包含植酸酶。在一個實施方案中，可以使用重量比為大約40%的具有S242替換的AmyS和大約 60%的地衣芽孢桿菌α-淀粉酶。以這種方式，每種酶的優良特性，淀粉液化物的快速粘度降低和熱穩定性，可以分別在發酵醇的方法中得到充分利用。在另一個優選的實施方案中， 具有S242替換的AmyS與地衣芽孢桿菌α -淀粉酶的重量比為10 90，以在制作增甜劑的方法中充分利用酶的特性。在其他的實施方案中，具S242替換的AmyS與地衣芽孢桿菌 α -淀粉酶的重量比可以為 5 95,15 85,20 80,25 75,30 70,50 50,60 40、 70 30,75 25,80 20,85 15,90 10 或者它們的中間值。在另一個實施方案中，可以使用大約1400AAU/g至大約14000AAU/g的具有S242 替換的AmyS和大約8000LU/g至大約19000LU/g地衣芽孢桿菌α -淀粉酶的活度比率。具有S242替換的AmyS與地衣芽孢桿菌α-淀粉酶的比率可以為1400AAU/g 14000LU/g、 2000AAU/g 15000LU/g、2100AAU/g 16000LU/g、1900AAU/g 17000LU/g 或者它們的中間值。在其他實施方案中，地衣芽孢桿菌α-淀粉酶與具有S242替換的AmyS的比率為大約5. 5LU/AAU至大約9. 5LU/AAU。地衣芽孢桿菌α -淀粉酶與具有S242替換的AmyS的活度比率在大約0. 1LU/AAU至大約9. 5LU/AAU的范圍內。例如活度比率可以為0. 1LU/AAU、 0. 2LU/AAU、0. 3LU/AAU、0. 4LU/AAU、0. 5LU/AAUU. OLU/AAUU. 5LU/AAU、2. 0LU/AAU、2. 5LU/ AAU、3. 0LU/AAU、4. 0LU/AAU、5. 0LU/AAU、5. 5LU/AAU、6. 0LU/AAU、6. 5LU/AAU、7. OLU/AAU、 7. 5LU/AAU、8. OLU/AAU、8. 5LU/AAU、9. OLU/AAU、9. 5LU/AAU 或者它們的中間值。AmyS可以包含SEQ ID NO :1或者SEQ ID NO :2的多肽序列，其中替換了 S242 殘基。在一個優選的實施方案中，AmyS包含在SEQ ID NO :4中所述的氨基酸序列，其與 SPEZYME ^ra (SEQ ID NO 2)比較具有S242Q替換。在本文中，將這種酶命名為 "AmyS SM2Q”或者僅為“S242Q”。在另一個實施方案中，AmyS可以選自包含SEQ ID NO :6、 7、8、9、10、11、12、15和16的多肽序列的AmyS酶之一，其中替換了 S242殘基。S242 替換可以是S242A、S242E、S242Q、S242F、S242H或者S242N替換。在一個實施方案中，在S242位置處的氨基酸替換改變了 AmyS的熱穩定性。具有在S242位置處替換的AmyS與在S242位置處沒有替換的AmyS比較，在約80°C至約95°C之間具有更高的熱穩定性。
6
在一個實施方案中，AmyS包含與SEQ ID NO 1的AmyS具有至少60%、70%、80%、 85 %、90 %、95 %、98 %或99 %序列同一性的氨基酸序列，其中AmyS具有α -淀粉酶活性。 AmyS可以包含使用SEQ ID NO 1用于編號，在氨基酸位置349和4 處的半胱氨酸的替換。 AmyS也可以包含N193和/或V416的替換。AmyS還可以包含使用SEQ ID NO :1用于編號， 在氨基酸位置179和180處的缺失。AmyS酶與野生型AmyS比較可以具有改變的氨基酸序列，所述AmyS酶改變了一種或多種酶的特性，例如，底物特異性、底物結合、底物剪切模式、熱穩定性、PH/活性譜、pH/ 穩定性譜、對氧化的穩定性、Ca2+依賴性和/或比活性。例如，與野生型AmyS比較，改變可能導致酶具有降低的Ca2+依賴性和/或改變的pH/活性譜和/或熱穩定性。地衣芽孢桿菌α -淀粉酶可以是純化的野生型酶。地衣芽孢桿菌α -淀粉酶可以具有對野生型序列的選自M15T、H133Y、m88S和A209V的一個或多個氨基酸替換。在一個優選的實施方案中，地衣芽孢桿菌α-淀粉酶包含顯示于SEQ ID Ν0:20中的氨基酸序列，其也稱為SPEZYME FRED。在一個實施方案中，地衣芽孢桿菌α-淀粉酶包含與 SPEZYME FRED(SEQ ID NO 20)具有至少 60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、 97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列。本發明進一步涉及編碼本發明的酶的DNA構建體，涉及制備和純化酶的方法，以及涉及酶在多種工業工藝，例如淀粉液化或者增甜劑生產中的用途在一個方面中，本發明涉及使用α-淀粉酶(AA)活性和植酸水解酶(FTU或者植酸酶)水解可溶性淀粉底物，其中AAU FTU的比率為大約1 15至大約15 1，優選地從1 10至大約10 1。在一個實施方案中，AAU FTU的比率為從1 4至3 1。在另外的實施方案中，AAU FTU的比率為1 1。植酸酶可以是來自任一來源的野生型酶。 植酸水解酶可以是細菌植酸酶或者真菌植酸酶。真菌植酸酶可以是曲霉屬(Aspergillus) 植酸酶或者布丘氏菌屬(Buttiauxella)植酸酶。在一些實施方案中，細菌植酸酶來自大腸桿菌。在一個實施方案中，植酸酶可以包含SEQ ID NO :19的氨基酸序列。提供了用于液化淀粉的方法，包括將上述淀粉酶混合物添加到包含淀粉的溶液中，并液化包含淀粉的溶液。對于該應用，優選的淀粉酶混合物具有大約40% (按AAU/g DS)的具有S242替換的AmyS和大約60% (按LU/g DS)的地衣芽孢桿菌α-淀粉酶的活度比率。可使用用于該應用的其他比率，例如為15 85,20 80,30 70,50 50,60 40、 70 30,80 20 和 85 15。淀粉底物可以獲自玉米、買羅高梁(milo)、黑麥、大麥、小麥、高粱或者燕麥。淀粉的其他來源包括其他谷物、牧草、塊莖和根并且更具體是稻、糠、木薯(cassava)、谷子、馬鈴薯、甘薯和木薯粉(tapioca)。底物可以包括植物材料，例如來自干磨法或濕磨法的顆粒淀粉。該方法可以包括初級和/或次級液化步驟，包括在初級和/或次級液化步驟中添加額外的底物到漿液中。該方法可以包括使用進一步包含植酸水解酶的淀粉酶混合物。也提供了用于糖化液化的淀粉以獲得可發酵糖的方法。在一些實施方案中，該方法還包括在合適的發酵條件下發酵可發酵糖以獲得終產物如醇。通過本方法產生的醇包括例如乙醇和丁醇。在另外的方面中，本發明涉及并不需要添加酸或堿來調節pH的淀粉轉化工藝和/ 或乙醇發酵工藝。一個實施方案涉及無PH調節的液化步驟，其中液化的pH范圍為pH4. 5至PH5. 4，并且并不添加酸中和化學物質到液化工藝步驟中。在另一個實施方案中，液化的 PH為pH4. 8至pH5. 8，并且并不添加酸中和化學物質到液化工藝步驟中。在一個實施方案中，該方法包括將含有顆粒淀粉的磨碎谷物漿液與植酸水解酶和上述的α -淀粉酶混合物在比淀粉凝膠化溫度低0°C至30°C的溫度接觸，升高溫度到凝膠化溫度以上，水解凝膠化的淀粉，并獲得可發酵底物。在另一方面，本發明涉及用于產生可發酵糖的方法，包括a)將磨碎的含有淀粉的材料與水和稀釜餾物混合，其中稀釜餾物是10至70% ν/ν范圍，并且獲得包含淀粉及具有 20至干固體(ds)含量的漿液，b)用植酸酶在液化淀粉之前或與之同時處理該漿液，c)液化該淀粉，d)在步驟b)期間和/或與液化步驟同時地添加上述α-淀粉酶混合物至所述淀粉和e)糖化液化的淀粉以獲得可發酵糖，其中在步驟a)、b)、c)、d)或e)的任意步驟期間不調節PH。在一些實施方案中，將可發酵糖回收和純化或異構化。在其他實施方案中，在液化步驟之前添加植酸酶。在另外的實施方案中，α-淀粉酶混合物隨植酸酶一起添加。又在另外的實施方案中，在液化步驟期間添加或者在糖化步驟期間添加第二份α-淀粉酶混合物劑量。在另外的方面，本發明涉及從含有淀粉的材料中產生醇的方法，包括液化和糖化如上所述的淀粉底物以獲得可發酵糖，并在合適的發酵條件下進一步發酵可發酵糖以獲得醇。在一些實施方案中，糖化和發酵步驟是同時進行的。在一些實施方案中，醇是乙醇或者丁醇。在另外的實施方案中，上述淀粉酶混合物可以用于轉化低粘度液化物成增甜劑例如葡萄糖、高果糖玉米糖漿等。用于該應用的優選的淀粉酶混合物具有大約15% (作為 AAU/g DS)的具有S242替換的AmyS和大約85% (作為LU/g DS)地衣芽孢桿菌α -淀粉酶的活度比率。其他比率可以用于該應用，例如5 95,10 90和20 80以及它們的中間值。用于產生增甜劑的方法可以包括將淀粉底物與上述淀粉酶混合物接觸，液化淀粉底物，并高溫溫育底物以產生包含葡萄糖的產物。溫育步驟可以是次級液化步驟。該溫育步驟可以在約90-100°C例如95°C的溫度進行。可以進行足夠的時間的溫育以使產物包含大約2-14DE的葡萄糖。在一個實施方案中，產物包含大約IODE的葡萄糖。用于產生增甜劑的方法進一步可以包括糖化產物以產生富含葡萄糖的溶液。富含葡萄糖的溶液可以包含 80-99%的葡萄糖。在一個實施方案中，富含葡萄糖的溶液包含大約93-96%的葡萄糖。糖化可以包括將葡萄糖產物與葡糖淀粉酶或者酶混合物例如包含葡糖淀粉酶和支鏈淀粉酶的 OPTIMAX 4060-VHP 接觸。附圖簡述

圖1A-1D顯示了通過比對可以發現的在其他親本SPEZYME )(tra樣α -淀粉酶中相對應的位置。應當指出，SEQ ID NO :4是AmyS S242Q。AmyS S242A、AmyS S242E 分別為所述的SEQ ID NO 3和SEQ ID NO :5。圖 2 顯示了 pHPLT-AmyS 質粒。圖3顯示了 S242文庫變體在95°C熱應激30分鐘后的殘余活性百分比。變體在 P、S、W和Y位置處缺失并通過野生型AmyS ( "wt")替代。SPEZYME )Ctra對照標記為“Ζ”。另一陽性對照，具有Δ 179-180缺失和C末端四個氨基酸截短的AmyS (SEQ IDNO 16)也顯示了( “$”)。SM2A和S242Q比野生型明顯顯示出更高的殘余活性。圖 4A-4I 顯示了 SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO 14 的配對比對。圖5顯示在沒有鈣添加的情況下野生型和淀粉酶變體的熱熔融曲線和熔點。圖6顯示在有鈣的情況下野生型和淀粉酶變體的熱熔融曲線和熔點。圖7顯示SPEZYME )Ctra和兩種變體相對于Liquozyme SC在3個時間點的活性斷面圖。圖8 顯示因 30 μ g 劑量的 α -淀粉酶 Liquozyme SC、SPEZYME Ethyl 或 SPEZYME )(tra的作用所致的谷物粉粘度降低。圖9顯示因30 μ g劑量的α -淀粉酶Liquozyme SC或SPEZYME ^ra或兩種變體(SM2A和S242Q)之一的作用所致的谷物粉粘度降低。圖10 顯示因 20 μ g 劑量的 α -淀粉酶 Liquozyme SC 或SPEZYME )(tra 或兩種變體(SM2A和S242Q)之一的作用所致的谷物粉粘度降低。圖11 顯示用 Liquozyme SC、SPEZYME ^ra 或兩種變體(SM2A 和 S242Q) 之一經過一段時間(0、30、60和90分鐘)處理的全磨谷物的DE進展。圖12 顯示用 Liquozyme SC、SPEZYME )(tra 或兩種變體(SM2A 和 S242Q) 之一經過一段時間(0、30、60和90分鐘)處理的全磨谷物的噴射之后粘度。圖13 顯示用 AmyS S242Q(SEQ ID NO 4)禾PSPEZYME FRED 的混合物以及單獨的每種酶在85-90°C經過一段時間(30、60、90和120分鐘)在分批液化工藝中處理全磨谷物的DE進展。圖14 顯示用 AmyS S242Q(SEQ ID NO 4)禾PSPEZYME FRED 的混合物以及單獨的每種酶在85-90°C經過一段時間(30、60、90和120分鐘)在分批液化工藝中處理全磨谷物的漿液粘度。圖15顯示在SEQ ID NO 20中描述的SPEZYME FRED的氨基酸序列。圖16 顯示來自使用 AmyS S242Q (SEQ ID NO 4)禾PSPEZYME FRED 的混合物的淀粉底物的DE進展。發明詳述提供了親本嗜熱脂肪芽孢桿菌α -淀粉酶的變體和來自地衣芽孢桿菌的熱穩定性α-淀粉酶的混合物。在一個優選的實施方案中，α-淀粉酶混合物含有按活性為AAU/g DS的至少大約50%的嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶變體酶。優選的范圍是按活性為AAU/ g DS的大約10%至大約90%的嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶變體酶。在一個尤其優選的實施方案中，將使用大約10%至大約70% (按AAU/g DS)的嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶和大約30%至大約90% (按LU/g DS)的地衣芽孢桿菌α-淀粉酶的活度比率，以使每一菌株的優良特性，即淀粉液化物的快速粘度降低和熱穩定性，分別得以利用。親本嗜熱脂肪芽孢桿菌α -淀粉酶的變體和來自地衣芽孢桿菌的熱穩定性α -淀粉酶的混合物具有與加工淀粉液化物有關的其他有利的特性，例如DS水平、ρΗ、鈣含量、以及液化和蒸煮溫度。例如，在某些實施方案中，DS水平的范圍可以為大約32%至大約40%， 或者更高。在另一方面，淀粉液化物中的PH的范圍可以為大約ρΗ5. 5至大約ρΗ6.0。鈣水平的范圍可以多達大約IOppm添加的鈣。Tjet的范圍可以為大約100°C至大約110°C，而Th。ld 的范圍可以為大約85°C至大約95°C。這些工藝可以包括淀粉液化至產生增甜劑例如葡萄糖糖漿，例如高果糖玉米糖漿。盡管這些工藝更特別地應用于增甜劑的生產，但是在一些實施方案中，該工藝可以應用于發酵原料的生產。因此，如下更詳細的說明，產生為發酵原料的液化物可以用于發酵工藝中以產生有用的終產物，包括乙醇和丁醇。在一些方面，本發明依賴于遺傳工程和分子生物學領域中使用的常規技術和方法。以下資源包括對根據本發明有用的一般方法學的描述Sambrook等人，MOLE⑶LAR CLONING :A LABORATORY MANUAL(第二 版，1989) ；Kreigler，GENE TRANSFER AND EXPRESSION ；A LABORATORY MANUAL (1990)和 Ausubel 等人編著，CURRENT PROTOCOLS IN MOLE⑶LAR BIOLOGY(1994)。這些通用參考文獻提供了本領域技術人員已知的定義和方法。 然而，不意圖使本發明限于所描述的任何具體方法、方案和試劑，因而這些可以變動。除非本文另外定義，本文中所用的全部技術術語及科學術語具有與本發明所屬領域的技術人員通常理解的相同意義。Singleton等人，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY，第 2 版，John Wiley and Sons, New York(1994)；以及 Hale 和 Markham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY(1991)向技術人員提供了本發明中所使用的眾多術語的通用字典。盡管可以在實施或檢驗本發明中使用與本文中所述的那些方法和材料相似或等同的任意方法和材料，然而描述了優選的方法和材料。現在本發明將僅通過引用的方式使用以下定義和實施例進行詳細的說明。通過引用的方式明確并入全部專利和出版物，包括此類專利和出版物中公開的全部序列，作為參考。數字范圍包括定義該范圍的數字在內。除非另外說明，分別將核酸序列從左至右以5’至3’方向顯示；將氨基酸序列從左至右以氨基至羧基方向顯示。本文中提供的標題不限制本發明的多個方面或實施方案，可以將其以整體引入本說明書，作為參考。定義如本文中所用，術語“淀粉”指包含植物的復雜多糖碳水化合物的任意物質，其包含具有式(C6HltlO5)x的直鏈淀粉和支鏈淀粉，其中X可以是任意數字。具體而言，該術語指來自包括但不限于谷物、牧草、塊莖和根并且更具體地來自小麥、大麥、玉米、黑麥、燕麥、高梁、買羅高梁、稻、高粱、糠、木薯(cassava)、谷子、馬鈴薯、甘薯和木薯粉(tapioca)的任一基于植物物質的直鏈淀粉和/或支鏈淀粉。術語“α-淀粉酶(例如EC 3. 2. 1. 1類)”指催化α _1，4_糖苷鍵水解的酶。也已經將這些酶描述為在含有1，4- α -連接的D-葡萄糖單位的多糖中實現1，4- α -D糖苷鍵的外切水解或者內切水解的那些酶。用于描述這種酶的另一術語是“糖原酶”。示例性酶包括α-1，4-葡聚糖4-葡聚糖水化酶(alpha-l，4_glucan 4-glucanohydrase)葡聚糖水解 Sl (glucanohydrolase)。當涉及細胞、核酸、蛋白質或載體使用時，術語“重組”指通過導入異源核苷酸或蛋白質或者改變天然核苷酸或蛋白質而被修飾的細胞、核酸、蛋白質或載體，或從如此修飾的細胞衍生的細胞。因而，例如，重組細胞表達在該細胞的天然(非重組)形式中不存在的基因或可以表達本來異常表達、低表達或根本不表達的天然基因。
10
術語“蛋白質”和“多肽”在本文可互換地使用。本文中使用氨基酸殘基的常規單字母或三字母代碼。“信號序列”意指與蛋白質的氨基端部分結合的氨基酸序列，所述氨基酸序列促進該蛋白質的成熟形式分泌到細胞外。信號序列的定義是功能性的。胞外蛋白的成熟形式缺少在分泌過程期間被切除的信號序列。“基因”指參與產生多肽的DNA區段并包括在編碼區之前及之后的區域以及各個編碼區段(外顯子)之間的間插序列(內含子)。術語“核酸”包括DNA、RNA、它們的單鏈或雙鏈和化學修飾物。術語“核酸”和“多核苷酸”在本文可互換地使用。因為遺傳密碼是簡并的，所以多個密碼子可以用于編碼特定的氨基酸，并且本發明包括編碼特定氨基酸序列的多核苷酸。“載體”指設計的將核酸導入一種或多種細胞類型的核苷酸序列。載體包括克隆載體、表達載體、穿梭載體、質粒、噬菌體顆粒、盒等。如本文中所用的“表達載體”意指包含與適宜調控序列有效連接的DNA序列的DNA 構建體，其中所述的調控序列能夠實現該DNA在合適宿主中的表達。此類調控序列可以包括實現轉錄的啟動子、控制轉錄的任選操縱基因序列、編碼mRNA上的合適核糖體結合位點的序列、增強子和控制轉錄及翻譯終止的序列。“啟動子”是參與結合RNA聚合酶以啟動基因轉錄的調節序列。啟動子可以是誘導型啟動子或組成型啟動子。在本發明中使用的優選的啟動子是誘導型啟動子里氏木霉 (Trichoderma reesei)cbhl0“在轉錄調控下”是本領域熟知的術語，指多核苷酸序列通常是DNA序列的轉錄取決于與其有效連接的元件，所述元件有助于轉錄的起始或者促進轉錄。“在翻譯調控下”是本領域熟知的術語，指在mRNA已經形成后發生的調節過程。如本文中所用，當描述蛋白質和編碼它們的基因時，用于該基因的術語一般用斜體(例如，編碼amyL(地衣芽孢桿菌AA)的基因可以表示為amyL)。用于蛋白質的術語一般不用斜體并且首字母通常大寫(例如，由amyL基因編碼的蛋白質可以表示為AmyL或 amyL)。術語“衍生的”包括術語“源自”、“獲得”或“從......可獲得”和“從......分離”。術語“有效連接的”指這樣的接近，其中諸元件處在允許它們功能性地聯系的排列中。例如，如果一個啟動子能夠控制序列的轉錄，則該啟動子與此編碼序列有效連接。術語“選擇標記”指這樣的基因，該基因能夠在宿主中表達并允許容易地選擇含有導入了核酸或載體的那些宿主。選擇標記的例子包括但不限于抗微生物物質(例如潮霉素、博來霉素或氯霉素)和/或賦予宿主細胞代謝優勢如營養優勢的基因。多核苷酸或多肽與另一個序列具有某個序列同一性百分數(例如80%、85%、 90%、95%或99% )意指當比對時，在比較的這兩個序列中堿基或氨基酸殘基是相同的時的百分數。可以使用本領域已知的任意合適軟件程序例如⑶RRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. Μ.等人(編著)1987，附錄30，第7. 7. 18部分)中描述的那些軟件程序確定這種比對結果和同源性或同一性百分數。優選的程序包括Vector NTI Advance 9. 0(lnvitrogen Corp. Carlsbad, CA)、GCG Pileup、FASTA (Pearson 等人(1988)Proc.Natl, Acad. Sci USA 85:2444-2448)和 BLAST(BLAST Manual，Altschul 等人，Natl Cent. Biotechnol. Inf.，Natl Lib. Med. (NCIB NLM NIH)，Bethesda, Md.和 Altschul 等人， (1997)NAR25 :3389-3402)程序。另一種優選的比對程序是優選地使用默認參數的ALIGN Plus (Scientific and Educational Software，PA)。可使用的另一種序列軟件程序是在序列軟件包6. 0版(Sequence Software Package Version6. 0)(威斯康星州麥迪遜威斯康辛大學Genetics Computer Group)中可獲得的TFASTA數據搜索程序。本領域技術人員會認識到由本發明包括的序列也可以通過嚴格的雜交條件下與所例舉的amyS序列(例如WO 06/0(^643的SEQ ID NO 5)雜交的能力進行定義。當單鏈形式的核酸可以在適宜的溫度和溶液離子強度條件下與另一種核酸復性時，則該核酸可與另一種核酸序列是可雜交的。雜交和洗滌條件是本領域熟知的(見，例如上文的 Sambrook (1989)，尤其第9和11章)。在一些實施方案中，嚴格條件對應于65°C的Tm和 0. 1XSSC,0. 1% SDS。“宿主菌株”或“宿主細胞”意指用于表達載體或DNA構建體的合適宿主，所述表達載體或DNA構建體包含編碼根據本發明的變體α-淀粉酶的多核苷酸。具體而言，宿主菌株優選地是細菌細胞。在本發明的一個優選的實施方案中，“宿主細胞”意指從微生物株特別是芽孢桿菌屬的某些物種的細胞產生的細胞和原生質體。術語“培養”指在合適的條件下在液體或者固體培養基中培育微生物細胞群體。在一個實施方案中，培養指將含有淀粉底物的顆粒淀粉發酵性生物轉化成終產物(一般在容器或反應器中)。發酵是由微生物酶促地和厭氧地分解有機物質以產生更簡單的有機化合物。盡管發酵在厭氧的條件下進行，然而意圖該術語應當不限于嚴格厭氧條件，因為發酵也在氧存在下發生。術語“接觸”指將分別的酶放置在足夠靠近各自的底物的地方以使酶能轉化底物成終產物。本領域技術人員將會理解，酶與各自的底物的混合溶液可以實現接觸。術語“酶轉化”一般指通過酶作用修飾底物。如本文中所用的該術語也指通過酶的作用修飾淀粉底物。如本文中所用，術語“糖化”指淀粉經酶轉化成葡萄糖或者其他低分子量多糖。術語“凝膠化”意指增溶淀粉分子，通過蒸煮以形成粘性混懸液。術語“液化”指淀粉轉化中水解凝膠化淀粉以產生低分子量可溶性糊精的階段。術語“聚合程度(DP) ”指給定糖中脫水吡喃葡萄糖單元的數目(n)。DPI的例子是單糖類，如葡萄糖和果糖。DP2的例子是二糖類，如麥芽糖和蔗糖。DP > 3指具有大于3的聚合程度的聚合物。術語“終產物”或“目的終產物”指從淀粉底物以酶方式轉化而來的任一碳源來源的分子產物。如本文中所用，術語“酶單位”指在測定法的條件下每給定的時間量產生給定的產物量的酶的量。在一些實施方案中，酶單位指在特定的測定法條件下每分鐘產生1微摩爾的產物的酶的量。例如，在一個實施方案中，術語“葡糖淀粉酶活性單位” (GAU)定義為在pH 4. 2和60°C的測定法條件下每小時從可溶性淀粉底物ds)產生Ig葡糖糖所需的酶的量。α -淀粉酶活性(AAU)通過淀粉水解的速率測定，其反映為分光光度測量的碘著色能力降低的速率。細菌α-淀粉酶活性的一個AAU是在標準條件下每分鐘水解IOmg的淀粉所需的酶的量。α -淀粉酶活性也可以測定為可溶性淀粉單位(SSU)，并且基于酶樣品的等份試樣在pH 4.2、50°C水解可溶性馬鈴薯淀粉底物0%此)的程度。還原糖含量使用如在 Miller, G. L. (1959)Anal. Chem. 31 :426-428 中所述的 DNS 方法測量。以Liquefon單位(LU)表示的α -淀粉酶活性根據在USP 5，958，739中公開的方法測量。簡言之，該測定方法使用對硝基苯麥芽七糖苷作為底物，該底物具有化學封閉的非還原性末端糖。對硝基苯釋放的速率與α-淀粉酶活性成比例并在410nm監測釋放。對比標準對照計算活性。如本文中所用，術語“干固體含量”(ds)指基于干重量的以％表示的漿液總固體。 術語“漿液”指含有不溶性固體的含水混合物。術語“殘余淀粉”指含淀粉的底物發酵后組合物中留下的任何殘留(可溶性或不可溶性)淀粉。如本文中所用，“再循環步驟”指糖化醪組分的再循環，所述糖化醪組分可以包括殘余淀粉、酶和/或微生物至包含淀粉的發酵底物。術語“糖化醪(mash) ”指水中用來產生發酵產物如醇的可發酵碳源(碳水化合物) 的混合物。在一些實施方案中，術語“發酵醪(beer)”和“糖化醪”可互換地使用。術語“釜餾物”意指未發酵的固體與水的混合物，其是從發酵的糖化醪去除醇后的殘余物。術語“蒸餾器干酒糟(distillers dried grain ;DDG) ”和“具有可溶物的蒸餾器干酒糟(distillers dried grain with solubles ；DDGS) ”指谷物發酵的有用副產物。如本文中所用，“產乙醇微生物”指具有將糖或者寡糖轉化成乙醇的能力的微生物。產乙醇微生物因其表達單獨地或共同將糖轉化成乙醇的一種或多種酶的能力而具有產乙醇性。如本文中所用，“乙醇生產者”或“產乙醇微生物”指能夠從己糖或戊糖產生乙醇的任何生物或細胞。通常，產乙醇細胞含有醇脫氫酶和丙酮酸脫羧酶。產乙醇微生物的例子包括真菌微生物如酵母。優選的酵母包括酵母屬(Saccharomyces)菌株，特別是釀酒酵母 (S. cerevisiae)菌株。就多核苷酸或蛋白質而言，術語“異源的”指不天然存在于宿主細胞中的多核苷酸或蛋白質。在一些實施方案中，該蛋白質是商業重要的工業用蛋白質。該術語意圖包括由天然存在的基因、突變基因和/或合成基因編碼的蛋白質。就多核苷酸或蛋白質而言，術語“內源的”指天然存在于宿主細胞中的多核苷酸或蛋白質。如本文中所用，術語“回收的”、“分離的”和“分開的”指從與其天然關聯的至少一種組分中移出的化合物、蛋白質、細胞、核酸或者氨基酸。如本文中所用，術語“轉化的”、“穩定轉化的”和“轉基因的”就細胞而言使用時， 意指該細胞具有整合到其基因組中作為經多個世代仍保留的附加型質粒的非天然(例如異源的)核酸序列。如本文中所用，術語“表達”指基于基因的核酸序列產生多肽的過程。該過程包括
13轉錄和翻譯。在核酸序列插入細胞中的上下文中，術語“導入”意指“轉染”、“轉化”或“轉導”并且包括對核酸序列摻入真核或原核細胞的談及，其中所述核酸序列可以摻入該細胞的基因組(例如，染色體、質粒、質體或線粒體DNA)，被轉化成自主復制子或瞬時表達(例如，轉染的 mRNA)。如本文中所用，術語“比活性”意指一種酶單位，其定義為在特定條件下每單位時間由酶制備物轉換成產物的底物的摩爾數。比活性表示為單位(U)/mg的蛋白質。術語“產量”指使用本發明的方法所產生的終產物或目的終產物的量。在一些優選的實施方案中，該產量大于使用本領域已知方法所產生的產量。在一些實施方案中，該術語指終產物的體積，并且在其他實施方案中，該術語指終產物的濃度。“ATCC”指位于弗吉尼亞州Manassas 20108的美國典型培養物保藏中心(ATCC)。“NRRL”指美國伊利諾伊州皮奧里亞縣，國家農業應用研究中心，農業研究培養物保藏中心(并且以前稱為USDA北部地區研究實驗室)。“一個”、“一種”和“該”包括復數稱謂，除非上下文另外清楚地說明并非如此。如本文中所用術語“包含”及其關聯詞以其包含……在內的意義使用；即，等同于術語“包括”及其對應的關聯詞。命名在本說明書和權利要求書中，使用氨基酸殘基的常規單字母或三字母代碼。出于引用方便，本發明的α-淀粉酶變體由以下命名描述原始氨基酸位置替換的氨基酸根據這種命名，例如將第242位置處用丙氨酸替換絲氨酸顯示為Ser242Ala 或 S242A將第30位置處的丙氨酸缺失顯示為Ala30*或 A30*或 ΔΑ30并且將額外氨基酸殘基如賴氨酸的插入顯示為
Ala30AlaLys 或 A30AK氨基酸殘基連續區段(如氨基酸殘基30-3 的缺失顯示為(30-33) *或 Δ (Α30-Ν33)。在特定α-淀粉酶與其他α-淀粉酶相比含有“缺失”并且在該位置內產生插入的情況下，對于在第36位置插入天冬氨酸而言，這表示為*36Asp 或 *36D多個突變由加號隔開，即Ala30Asp+Glu34Ser 或 A30N+E34S代表在30和34位置中將丙氨酸和谷氨酸分別替換為天冬酰胺和絲氨酸的突變。當可以在一個給定位置插入一個或多個備選氨基酸殘基時，它表示為A30N, E 或者，A30N 或 A30E。另外，當本文中鑒定到適合修飾的位置而未指出任何具體的修飾時，應當理解任意氨基酸殘基可以替換該位置內存在的氨基酸殘基。因而，例如，當提到修飾在第30位置處的丙氨酸，但不具體說明時，應當理解該丙氨酸可以缺失或替換為任何其他氨基酸，即，以下任一氨基酸R、N、D、A、C、Q、E、G、H、I、L、K、Μ、F、P、S、Τ、W、Y、V。另外，“Α30Χ”意指以下的任一替換A30R、A30N、A30D、A30C、A30Q、A30E、A30G、 A30H、A30I、A30L、A30K、A30M、A30F、A30P、A30S、A30T、A30W、A30Y 或 A30V ；或簡寫為A30R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、V。如果用于編號的親本酶已經在該位置處具有建議替換的所討論氨基酸殘基，則使用以下的命名在例如一個N或V存在于野生型中的情況下，為“X30N”或“X30N，V”。因此，其意為其他相應的親本酶在位置30被替換成“Asn”或“Val ”。氨基酸殘基的特征帶電荷的氨基酸Asp、Glu、Arg、Lys、His帶負電荷的氨基酸(負電荷最多的殘基排在首位)Asp、Glu帶正電荷的氨基酸(正電荷最多的殘基排在首位)Arg、Lys、His中性氨基酸Gly、Ala、Val、Leu、lie、Phe> Tyr> Trp、Met、Cys> Asn、Gin、Ser> Thr> Pro疏水性氨基酸殘基(疏水性最強的殘基排在最后)Gly、Ala、Val、Pro、Met、Leu、lie、Tyr、Phe、Trp，親水性氨基酸(親水性最強的殘基排在最后)Thr、Ser、Cys、Gin、Asn0α-淀粉酶該淀粉酶混合物包含AmyS α -淀粉酶和地衣芽孢桿菌α -淀粉酶。AmyS酶可以包含SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2的多肽序列，其中替換了 S242。在一個優選的實施方案中，AmyS包含在SEQ ID NO :4中所述的氨基酸序列，也稱為“AmyS S242Q”或“SM2Q”，其與 SPEZYME )(tra(SEQ ID NO 2)比較具有S242Q替換。在另一個實施方案中，AmyS可以選自包含SEQ ID NO :6、7、8、9、10、11、12、15和16的多肽序列的AmyS酶之一，其中替換 T S242殘基。S242 替換可以是S242A、S242E、S242Q、S242F、S242H或者S242N替換。在一個實施方案中，在S242位置處的氨基酸替換改變了 AmyS的熱穩定性。具有在S242位置處替換的AmyS與不具有S242替換的AmyS比較，可以具有在大約80°C至大約95°C之間的更高的熱穩定性。在一個實施方案中，AmyS包含具有與SEQ ID NO :1的AmyS至少60 %、70 %、 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或者99%序列同一性的氨基酸序列，其中AmyS具有α-淀粉酶活性。使用SEQ ID NO :1用于編號，AmyS可以包含在氨基酸349和似8處的半胱氨酸的替換。AmyS也可以包含W93和/或V416的替換。使用SEQ ID N0:1的編號， AmyS也可以包含氨基酸179和180的缺失。與野生型AmyS比較，具有改變的氨基酸序列的AmyS酶改變了酶的一種或多種特性，例如，底物特異性、底物結合、底物剪切模式、熱穩定性、PH/活性譜、pH/穩定性譜、對氧化的穩定性、Ca2+依賴性和/或比活性。例如，與野生型AmyS比較，改變可能導致酶具有降低的Ca2+依賴性和/或改變的pH/活性譜和/或熱穩定性。由芽孢桿菌屬某些物種產生的多種α -淀粉酶在氨基酸水平是高度同源(同一) 的。可以在下表1中找到多種已知芽孢桿菌α-淀粉酶的同一性百分數。表1同一性百分數
權利要求
1.α-淀粉酶混合物，其包含(i)嗜熱脂肪芽孢桿菌(B.stearothermophiIus) α -淀粉酶(AmyS)，其使用在SEQ ID NO 2中所示的氨基酸編號系統，其中替換了 S242位置處的氨基酸；和(ii)地衣芽孢桿菌(B.Iicheniformis) α -淀粉酶。
2.權利要求1中所述的α-淀粉酶混合物，其進一步包含植酸酶。
3.權利要求1中所述的α-淀粉酶混合物，其中所述混合物包含重量比為大約40%的具有S242替換的AmyS和大約60%的地衣芽孢桿菌α -淀粉酶。
4.權利要求1中所述的α-淀粉酶混合物，其中具有S242替換的AmyS與地衣芽孢桿菌α-淀粉酶的重量比為10 90。
5.權利要求1中所述的α-淀粉酶混合物，進一步地其包含大約1400AAU/g至大約 14000AAU/g的具有S242替換的AmyS和大約8000LU/g至大約19000LU/g地衣芽孢桿菌 α-淀粉酶的活度比率。
6.權利要求1中所述的α-淀粉酶混合物，其中所述AmyS包含SEQIDNO :1或SEQ ID NO 2的多肽序列。
7.權利要求1中所述的α-淀粉酶混合物，其中所述AmyS包含SEQ IDNO 4的多肽序列。
8.權利要求1中所述的α-淀粉酶混合物，其中所述AmyS選自包含SEQID NO :6、7、 8、9、10、11、12、15和16的多肽序列的AmyS酶之一。
9.權利要求1、6、7或8中任一項所述的α-淀粉酶混合物，其中所述S242替換是 S242A、S242E、S242Q、S242F、S242H 或 S242N 替換。
10.權利要求1、6、7或8中任一項所述的α-淀粉酶混合物，其中所述具有在S242位置處替換的AmyS與在S242位置處沒有替換的AmyS比較在約80°C至約95°C之間具有更高的熱穩定性。
11.權利要求1中所述的α-淀粉酶混合物，其中所述AmyS包含與SEQIDΝ0:1的 AmyS具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述AmyS具有α-淀粉酶活性。
12.權利要求1中所述的α-淀粉酶混合物，其中所述地衣芽孢桿菌α-淀粉酶包含純化的野生型酶。
13.權利要求1中所述的α-淀粉酶混合物，其中所述地衣芽孢桿菌α-淀粉酶包含野生型序列的選自M15T、H133Y、N188S和A209V的一個或多個氨基酸替換。
14.權利要求1中所述的α-淀粉酶混合物，其中所述地衣芽孢桿菌α-淀粉酶包含在 SEQ ID NO 20中所示的氨基酸序列。
15.權利要求1中所述的α-淀粉酶混合物，其中所述地衣芽孢桿菌α-淀粉酶包含與 SEQ ID NO :20 具有至少 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99%序列同一性的氨基酸序列。
16.用于液化淀粉的方法，其包括添加權利要求1所述的淀粉酶混合物到包含淀粉的溶液中，并液化包含淀粉的溶液以形成漿液。
17.權利要求16所述的方法，其中所述淀粉酶混合物具有大約40%(作為AAU/g DS)的具有S242替換的AmyS和大約60% (作為LU/g DS)的地衣芽孢桿菌α -淀粉酶的活度比率。
18.權利要求16所述的方法，其中所述淀粉獲自植物材料、谷物、買羅高梁、黑麥、大麥、小麥、高粱、燕麥、稻、糠、木薯、谷子、馬鈴薯、甘薯或木薯粉。
19.權利要求18所述的方法，其中所述淀粉是來自干磨法或濕磨法的顆粒淀粉。
20.權利要求16所述的方法，其進一步包括初級和/或次級液化步驟，包括在初級和/ 或次級液化步驟中添加額外的底物到漿液中。
21.權利要求16所述的方法，其進一步包括添加植酸水解酶。
22.權利要求16所述的方法，其進一步包括糖化所述液化的淀粉以獲得可發酵糖。
23.權利要求22所述的方法，其進一步包括在合適的發酵條件下發酵可發酵糖以獲得醇終產物。
24.權利要求23所述的方法，其中所述醇終產物是乙醇或丁醇。
25.權利要求16所述的方法，其中所述液化的ρΗ范圍為ρΗ4.5至ρΗ5. 4，并且不添加酸中和化學物質到該液化工藝步驟中。
26.權利要求16所述的方法，其中所述液化的ρΗ范圍為ρΗ4.8至ρΗ5. 8，并且不添加酸中和化學物質到該液化工藝步驟中。
27.獲得可發酵底物的方法，包括將含有顆粒淀粉的磨碎谷物漿液與植酸水解酶和權利要求1所述的α-淀粉酶混合物在比淀粉凝膠化溫度低0°C至30°C的溫度接觸，升高溫度高于凝膠化溫度，水解凝膠化的淀粉，和獲得可發酵底物。
28.生產可發酵糖的方法，包括(a)將磨碎的含有淀粉的材料與水和稀釜餾物混合，其中所述稀釜餾物是在10至70% ν/ν范圍，和獲得包含淀粉及具有20至50% w/w干固體(ds)含量的漿液，(b)用植酸酶在液化淀粉之前或在液化淀粉的同時處理所述漿液，(c)液化所述淀粉，(d)在步驟(b)期間和/或與液化步驟同時地添加權利要求1所述的α-淀粉酶混合物至所述淀粉，和(e)糖化所述液化的淀粉以獲得可發酵糖，其中在步驟(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的任一步驟期間不調節ρΗ。
29.權利要求觀所述的方法，其中所述可發酵糖是回收的和純化的或異構化的。
30.權利要求觀所述的方法，其中在液化步驟之前添加所述植酸酶。
31.權利要求觀所述的方法，其中將所述α-淀粉酶混合物隨所述植酸酶一起添加。
32.權利要求觀所述的方法，其中在液化步驟期間添加或者在糖化步驟期間添加第二份α -淀粉酶混合物劑量。
33.用于生產葡萄糖的方法，包括將淀粉底物與權利要求1所述的淀粉酶混合物接觸，液化所述淀粉底物，和高溫溫育所述底物以產生包含葡萄糖的產物。
34.權利要求33所述的方法，其中所述溫育步驟是次級液化步驟。
35.權利要求33所述的方法，其中所述溫育步驟在大約90-100°C的溫度進行。
36.權利要求33所述的方法，其中進行足夠時間的溫育以使產物包含大約2-14DE的葡萄糖。
37.權利要求36所述的方法，其中進行足夠時間的溫育以使產物包含大約IODE的葡萄糖。
38.權利要求33所述的方法，進一步包括糖化所述產物以產生富含葡萄糖的溶液。
39.權利要求38所述的方法，其中所述富含葡萄糖的溶液包含80-99%的葡萄糖。
40.權利要求39所述的方法，其中所述富含葡萄糖的溶液包含約93-96%的葡萄糖。
41.權利要求38所述的方法，其中所述糖化包括將所述葡萄糖產物與葡糖淀粉酶或者包含葡糖淀粉酶和支鏈淀粉酶的酶混合物接觸。
全文摘要
本發明涉及α-淀粉酶混合物，包括其中替換了S242位置處的氨基酸的嗜熱脂肪芽孢桿菌(B.stearothermophilus)α-淀粉酶(AmyS)和地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)α-淀粉酶。本發明也涉及使用α-淀粉酶混合物用于淀粉液化和糖化、乙醇生產和增甜劑生產的方法。
文檔編號C11D3/386GK102224234SQ200980147153
公開日2011年10月19日 申請日期2009年9月11日 優先權日2008年9月25日
發明者B·A·保爾森, J·舍蒂, V·夏爾馬 申請人:丹尼斯科美國公司