專利名稱：Bibac基因文庫混合池的構建方法及其混合池和基因的快速篩選方法
技術領域：
本發明屬于生物技術基因工程技術領域，具體涉及植物基因文庫混合池的構建方法及其混合池，以及植物基因的快速篩選方法。
背景技術：
構建基因文庫是獲得特定基因的重要途徑之一，為適宜人和高等動植物基因組及其復雜功能的研究，常通過人工染色體載體構建基因文庫的方法獲得特定基因，如用雙元細菌人工染色體(binary BAC，BIBAC)構建BIBAC基因文庫。所構建的BIBAC基因文庫均是將供體基因組DNA的克隆貯存在一些文庫保存板中，每一塊文庫保存板通常有M列，每列有16個孔，共有384孔，每個孔用以貯存供體基因組DNA的單克隆菌液，因此，該文庫保存板也稱為384孔板，一個BIBAC基因文庫，根據供體材料的不同，常有幾十，甚至上百個文庫保存板，如云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所構建的藥用野生稻BIBAC基因文庫，有140塊文庫保存板，包含53760個克隆。采用常規的BIBAC基因文庫篩選特異基因， 需要將該基因文庫包含的所有克隆一個一個或幾十個一起進行PCR篩選，再去查找相應的特異基因位置，會造成工作量很大的缺陷和不足。

發明內容
本發明要解決的技術問題是克服現有BIBAC基因文庫利用時存在工作量大的缺陷和不足，其發明目的提供一種BIBAC基因文庫混合池的構建方法，本發明還提供用該方法所構建的基因文庫混合池及其基因的快速篩選方法。為解決以上的技術問題，本發明的技術方案如下 一、BIBAC基因文庫混合池的構建方法，包括如下步驟
(1)一級混合池的構建
待BIBAC基因文庫的文庫保存板中的單克隆菌液完全融化后，將每一塊文庫保存板中每一列中的16個孔內的單克隆菌液合并成一個一級混合池，將一級混合池標記為(X)-y， X為文庫保存板的編號，X=l，2，3，……自然數，y為每一塊文庫保存板中列的編號，y=l， 2,3,……自然數，該一級混合池命名為(X) _y號一級混合池；
(2)二級混合池的構建
將每一塊文庫保存板所對應的一級混合池合并成一個二級混合池，將二級混合池標記為X，X=l，2，3，……自然數，該二級混合池命名為X號二級混合池；X與文庫保存板的編號相同；
(3)三級混合池的構建
按二級混合池編號順序從1號二級混合池開始，每10個二級混合池合并成為一個三級混合池，將三級混合池記為η，η =1，2，3，……自然數，該三級混合池命名為η號三級混合池。
二、一種BIBAC基因文庫混合池，所述的BIBAC基因文庫混合池是按上述技術方案 1所述的BIBAC基因文庫混合池的構建方法構建獲得。三、一種基因的快速篩選方法，包括以下步驟
(1)按上述技術方案1所述的BIBAC基因文庫混合池的構建方法構建一級混合池、二級混合池和三級混合池；
(2)根據目的基因的特異序列或同源基因序列設計引物，并合成該引物；
(3)以步驟(1)所構建的三級混合池為第一步篩選的模板，用步驟(2)所獲得的引物按常規PCR方法進行篩選，得到陽性克隆池；
(4)用步驟(3)所得到陽性克隆池所對應的二級混合池為第二步篩選的模板，按照步驟(3)相同的PCR體系進行篩選，得到陽性克隆池；
(5)用步驟(4)獲得的陽性克隆池所對應的一級混合池作為第三步篩選的模板，按照步驟(3)相同的PCR體系進行篩選，得到陽性克隆池；
(6)對步驟(5)所述的陽性克隆池所對應的16個單克隆，按照步驟(3)相同的PCR體系進行篩選，得到陽性克隆；
(7)，采用目的基因的特異序所設計的引物進行PCR時，如果步驟(3)到步驟(6)各步驟所得到的陽性克隆的片段大小相同，即可認定步驟(6)獲得的陽性克隆為目的基因；采用同源基因序列設計的引物進行PCR時，將步驟(6)得到陽性克隆回收純化，測序、進行blast 比對，以比對結果確定目的基因。與現有技術相比，本發明的有益效果是
1、本發明所述的BIBAC基因文庫混合池的構建方法，構建了一級混合池、二級混合池和三級混合池，能簡明清楚地記錄龐大的基因文庫各級混合池及其克隆的詳細位置，能準確地找到任何單拷貝序列并且可以將其相對應的克隆定位在基因文庫的具體位置，能為利用植物優良基因提供可靠的材料，該方法易掌握。2、用本發明BIBAC基因文庫混合池的構建方法所構建的基因文庫混合池或用本發明的基因的快速篩選方法篩選基因，比用現有的BIBAC基因文庫直接篩選基因可結省大量工作量和大量成本，如實施例中的云南藥用野生稻BIBAC基因文庫包含53760個克隆，1 臺PCR機，按一次能擴增96個單克隆計算，需進行560次PCR，而用本發明BIBAC基因文庫混合池的構建方法所構建的基因文庫混合池或用本發明的基因的快速篩選方法篩選基因， 只需進行4次PCR，節省500次PCR的工作量，大大提高了基因克隆效率。3、所構建的基因文庫混合池還可重復用于多個基因的篩選。


圖1為雙元細菌人工染色體BIBAC2質粒載體物理圖。圖2是一級混合池和二級混合池的構建示意圖，圖中(X) -1 (X) -24，表示第X 塊文庫保存板中的M個一級混合池，X表示M個一級混合池合并成的一個二級混合池。圖3是三級混合池的構建示意圖，圖中1 10表示1號二級混合池至10號二級混合池共10個二級混合池合并構建1個三級混合池，1表示1號三級混合池。圖4是本發明實施列3對14個三級混合池進行)Ca21基因篩選的瓊脂糖電泳檢測結果，圖中M為DL2000 Marker,泳道1是1號三級混合池；泳道2是2號三級混合池；泳道3是3號三級混合池；泳道4是4號三級混合池；泳道5是5號三級混合池；泳道6是6 號三級混合池；泳道7是7號三級混合池；泳道8是8號三級混合池；泳道9是9號三級混合池；泳道10是10號三級混合池；泳道11是11號三級混合池；泳道12是12號三級混合池；泳道13是13號三級混合池；泳道14是14號三級混合池，其中14號三級混合池是陽性克隆池。圖5是本發明實施列3對二級混合池進行)Ca21基因篩選的瓊脂糖電泳檢測結果， 圖中M為DL2000 Marker,泳道1是1；34 二級混合池；泳道2是135 二級混合池；泳道3是 136 二級混合池；泳道4是137 二級混合池，其中134號二級混合池是陽性克隆池。圖6是本發明實施列3對一級混合池進行)Ca21基因篩選的瓊脂糖電泳檢測結果， 圖中M為DL2000 Marker，泳道1是(1；34)_1號一級混合池；泳道2是(1；34)_2號一級混合池；泳道3是(1；34)-3號一級混合池；泳道4是(1；34)-4號一級混合池，其中(1；34)_4號一級混合池是陽性克隆池。圖7是本發明實施列3對(134) _4 —級混合池所對應的16個單克隆進行)Ca21基因篩選的瓊脂糖電泳檢測結果，圖中M為DL2000 Marker,泳道1至16分別是第1個孔至第 16個孔中單克隆的電泳檢測結果，其中泳道4，泳道8，泳道15是陽性克隆。
具體實施例方式
藥用野生稻、Oryza officinalis Watt.)由于獨立起源和進化，具有其它藥用野生稻不具有的結實率高等重要的特意優良性狀，這些優良性狀都是水稻育種的寶貴資源，是本領域常用的材料，以下實施例以云南藥用野生稻為供體材料對本發明做進一步描述，但不夠成限制本發明。當然也可用其它供體植物材料按本發明方法構建基因文庫文庫混合池和用本發明基因的快速篩選方法對基因進行快速篩選。實施例1云南藥用野生稻BIBAC基因文庫的構建
云南藥用野生稻BIBAC基因文庫的構建是按照常規的BIBAC基因文庫的構建方法構建的。還可參照“云南藥用野生稻BIBAC文庫的構建及分析”(作者侯思名等，湖南農業大學學報(自然科學版)第37卷第1期2011年2月，17-21)構建。用現有的常規方法構建的云南藥用野生稻BIBAC基因文庫的克隆載體是雙元細菌人工染色體BIBAC2，大小為23. 5kb,具有單克隆酶切位點BamHI，如圖1所示，對卡那霉素(Km)具有抗性，具有feci 基因，當載體有外源片段插入，可以在含5%的蔗糖和卡那霉素(50mg/L)的LB培養基中生長；該云南藥用野生稻BIBAC基因文庫包括53760個克隆， 平均插入片段76 kb,保存在140塊文庫保存板中，每塊文庫保存板有M列，每列有16個孔，即每塊文庫保存板有384個孔用以貯存克隆菌液，用X表示文庫保存板的編號，X=l，2， 3，……140自然數；從第1塊文庫保存板開始，依次，命名為第1塊文庫保存板，第2塊文庫保存板，第3塊文庫保存板，第4塊文庫保存板，第5塊文庫保存板，……到第140塊文庫保存板，其基因文庫庫容相當于云南藥用野生稻基因組的5. 86倍。實施例2 BIBAC基因文庫混合池的構建方法及其混合池
將實施例1構建的云南藥用野生稻BIBAC基因文庫，按以下步驟構建BIBAC基因文庫混合池
(1) 一級混合池的構建
①待云南藥用野生稻BIBAC基因文庫的文庫保存板中的單克隆菌液完全融化后，將每一塊文庫保存板中，每一列中16個孔的單克隆菌液合并成一個一級混合池，每一塊文庫保存板有M列，共合并成M —個一級混合池，具體操作是用最大量程為10 μ 1的移液槍分別吸取文庫保存板的1列中的16個孔中單克隆菌液10 μ 1，合加在一個已裝有1.5ml培養基的離心管中，所述的培養基與構建的云南藥用野生稻BIBAC基因文庫所采用的培養基及培養條件均相同，具體是所述的培養基是1.0%胰蛋白胨，0.5%酵母膏，1.0% NaCl, 360mmol/LK2HP04, 132mmol/LKH2PO4, 17mmol/L, Na citrate 4mmol/L MgSO4 · 7H20，68 mmol /L (NH4)2S04，每次在吸取1個孔中的單克隆菌液之前先用移液槍將沉淀在板底的菌體重懸后再吸取菌液，每個單克隆菌液用一個無菌移液槍頭；將所建成的一級混合池放入 37°C恒溫搖床中培養6 他(培養條件)；所述的百分數為質量分數；
②將收集了的每一列的混合菌液離心管標記為(X)_y，X為文庫保存板的編號，X=l， 2,3,……140自然數;y為每一塊文庫保存板中列的編號，y=l，2，3，4，5，6，7，8，9，10，ll， 12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24 ；即每一塊文庫保存板有24個一級混合池(如圖2)，一級混合池命名為(X) -y號一級混合池；因云南藥用野生稻BIBAC基因文庫有140 塊文庫保存板，所以構成3360個一級混合池(140XM=3360)；
以下以第1塊文庫保存板，第2塊文庫保存板，第3塊文庫保存板，第140塊文庫保存板為例，更具體地說明該文庫保存板中每一列16個孔的單克隆菌液合并在一個離心管中， 該離心管的標記即一級混合池的標記 第1塊文庫保存板
第1塊文庫保存板第1列中16個孔的單克隆菌液合并的離心管記為(1)_1，命名為
-1號一級混合池，以下類推；(1) -2第1塊文庫保存板第2列中16個孔的單克隆菌液合并的離心售;標記為(1)-2，第1塊文庫保存板第3列中16個孔的單克隆菌液合并的離心售;標記為(1)-3，第1塊文庫保存板第4列中16個孔的單克隆菌液合并的離心售;標記為(1)-4，第1塊文庫保存板第5列中16個孔的單克隆菌液合并的離心售;標記為(1)-5，第1塊文庫保存板第6列中16個孔的單克隆菌液合并的離心售;標記為(1)-6，第1塊文庫保存板第7列中16個孔的單克隆菌液合并的離心售;標記為(1)-7，第1塊文庫保存板第8列中16個孔的單克隆菌液合并的離心售;標記為(1)-8，第1塊文庫保存板第9列中16個孔的單克隆菌液合并的離心售;標記為(1)-9，第1塊文庫保存板第10列中16個孔的單克隆菌液合并的離心<蒙標記為(1)-10第1塊文庫保存板第11列中16個孔的單克隆菌液合并的離心<蒙標記為(1)-11第1塊文庫保存板第12列中16個孔的單克隆菌液合并的離心-蒙標記為(1)-12第1塊文庫保存板第13列中16個孔的單克隆菌液合并的離心-蒙標記為(1)-13第1塊文庫保存板第14列中16個孔的單克隆菌液合并的離心-蒙標記為(1)-14第1塊文庫保存板第15列中16個孔的單克隆菌液合并的離心-蒙標記為(1)-15第1塊文庫保存板第16列中16個孔的單克隆菌液合并的離心-蒙標記為(1)-16第1塊文庫保存板第17列中16個孔的單克隆菌液合并的離心-蒙標記為(1)-17第1塊文庫保存板第18列中16個孔的單克隆菌液合并的離心-蒙標記為(1)-18第1塊文庫保存板第19列中16個孔的單克隆菌液合并的離心-蒙標記為(1)-19第1塊文庫保存板第20列中16個孔的單克隆菌液合并的離心-蒙標記為(1)-20第1塊文庫保存板第21列中16個孔的單克隆菌液合并的離心管標記為(1)-21， 第1塊文庫保存板第22列中16個孔的單克隆菌液合并的離心管標記為(1)-22， 第1塊文庫保存板第23列中16個孔的單克隆菌液合并的離心管標記為(1)-23， 第1塊文庫保存板第M列中16個孔的單克隆菌液合并的離心管標記為(1) -24 ； 分別命名為(1) -1號一級混合池，(1)-2號一級混合池，(1)-3號一級混合池，(1)-4 號一級混合池，(1)-5號一級混合池，(1)-6號一級混合池，(1)-7號一級混合池，(1)-8號一級混合池，(1) -9號一級混合池，(1) -10號一級混合池，(1) -11號一級混合池，(1) -12 號一級混合池，(1) -13號一級混合池，(1) -14號一級混合池，(1) -15號一級混合池， (1)-6號一級混合池，(1) -17號一級混合池，(1) -18號一級混合池，(1) -19號一級混合池，(1) -20號一級混合池，(1)-21號一級混合池，(1)-22號一級混合池，(1) -23號一級混合池，(1)-24號一級混合池，以下類推； 第2塊文庫保存板
第2塊文庫保存板第1列中16個孔的單克隆菌液合并的離心管記為(2) -1， 第2塊文庫保存板第2列中16個孔的單克隆菌液合并的離心管標記為(2) -2， 第2塊文庫保存板第3列中16個孔的單克隆菌液合并的離心管標記為(2) -3， 第2塊文庫保存板第4列中16個孔的單克隆菌液合并的離心管標記為(2) -4， 第2塊文庫保存板第5列中16個孔的單克隆菌液合并的離心管標記為(2) -5， 第2塊文庫保存板第6列中16個孔的單克隆菌液合并的離心管標記為(2) -6， 第2塊文庫保存板第7列中16個孔的單克隆菌液合并的離心管標記為(2) -7， 第2塊文庫保存板第8列中16個孔的單克隆菌液合并的離心管標記為(2) -8， 第2塊文庫保存板第9列中16個孔的單克隆菌液合并的離心管標記為(2) -9，
第2塊文庫保存板第10列中16個孔的單克隆菌液合并的離f標記為(2)-10,第2塊文庫保存板第11列中16個孔的單克隆菌液合并的離f標記為(2)-11,第2塊文庫保存板第12列中16個孔的單克隆菌液合并的離f標記為(2)-12，第2塊文庫保存板第13列中16個孔的單克隆菌液合并的離f標記為(2)-13，第2塊文庫保存板第14列中16個孔的單克隆菌液合并的離f標記為(2)-14，第2塊文庫保存板第15列中16個孔的單克隆菌液合并的離f標記為(2)-15，第2塊文庫保存板第16列中16個孔的單克隆菌液合并的離f標記為(2)-16，第2塊文庫保存板第17列中16個孔的單克隆菌液合并的離f標記為(2)-17，第2塊文庫保存板第18列中16個孔的單克隆菌液合并的離f標記為(2)-18，第2塊文庫保存板第19列中16個孔的單克隆菌液合并的離f標記為(2)-19，第2塊文庫保存板第20列中16個孔的單克隆菌液合并的離f標記為(2)-20，第2塊文庫保存板第21列中16個孔的單克隆菌液合并的離f標記為(2)-21，第2塊文庫保存板第22列中16個孔的單克隆菌液合并的離f標記為(2)-22，第2塊文庫保存板第23列中16個孔的單克隆菌液合并的離f標記為(2)-23，第2塊文庫保存板第24列中16個孔的單克隆菌液合并的離f標記為(2)—24
第3塊文庫保存板
第3塊文庫保存板第1列中16個孔的單克隆菌液合并的離心管記為(3)-1， 第3塊文庫保存板第2列中16個孔的單克隆菌液合并的離心管標記為(3) -2，第3塊文庫保存板第3列中16個孔的單克隆菌液合并的離心管標記為(3) -3 第3塊文庫保存板第4列中16個孔的單克隆菌液合并的離心管標記為(3) -4 第3塊文庫保存板第5列中16個孔的單克隆菌液合并的離心管標記為(3) -5 第3塊文庫保存板第6列中16個孔的單克隆菌液合并的離心管標記為(3) -6 第3塊文庫保存板第7列中16個孔的單克隆菌液合并的離心管標記為(3) -7 第3塊文庫保存板第8列中16個孔的單克隆菌液合并的離心管標記為(3) -8 第3塊文庫保存板第9列中16個孔的單克隆菌液合并的離心管標記為(3) -9
第3塊文庫保存板第10列中16個孔的單克隆菌液合并的離f標記為(3)-10,第3塊文庫保存板第11列中16個孔的單克隆菌液合并的離f標記為(3)-11,第3塊文庫保存板第12列中16個孔的單克隆菌液合并的離f標記為(3)-12，第3塊文庫保存板第13列中16個孔的單克隆菌液合并的離f標記為(3)-13，第3塊文庫保存板第14列中16個孔的單克隆菌液合并的離f標記為(3)-14，第3塊文庫保存板第15列中16個孔的單克隆菌液合并的離f標記為(3)-15，第3塊文庫保存板第16列中16個孔的單克隆菌液合并的離f標記為(3)-16，第3塊文庫保存板第17列中16個孔的單克隆菌液合并的離f標記為(3)-17，第3塊文庫保存板第18列中16個孔的單克隆菌液合并的離f標記為(3)-18，第3塊文庫保存板第19列中16個孔的單克隆菌液合并的離f標記為(3)-19，第3塊文庫保存板第20列中16個孔的單克隆菌液合并的離f標記為(3)-20，第3塊文庫保存板第21列中16個孔的單克隆菌液合并的離f標記為(3)-21，第3塊文庫保存板第22列中16個孔的單克隆菌液合并的離f標記為(3)-22，第3塊文庫保存板第23列中16個孔的單克隆菌液合并的離f標記為(3)-23，第3塊文庫保存板第24列中16個孔的單克隆菌液合并的離f標記為(3)-24
依此類推，到第140塊文庫保存板時，合并單克隆菌液的離心管標記是 第140塊文庫保存板第1列中16個孔的單克隆菌液合并的離心管記為(140)-1， 第140塊文庫保存板第2列中16個孔的單克隆菌液合并的離心管標記為(140)-2， 第140塊文庫保存板第3列中16個孔的單克隆菌液合并的離心管標記為(140)-3， 第140塊文庫保存板第4列中16個孔的單克隆菌液合并的離心管標記為(140)-4， 第140塊文庫保存板第5列中16個孔的單克隆菌液合并的離心管標記為(140)-5， 第140塊文庫保存板第6列中16個孔的單克隆菌液合并的離心管標記為(140)-6， 第140塊文庫保存板第7列中16個孔的單克隆菌液合并的離心管標記為(140)-7， 第140塊文庫保存板第8列中16個孔的單克隆菌液合并的離心管標記為(140)-8， 第140塊文庫保存板第9列中16個孔的單克隆菌液合并的離心管標記為(140)-9， 第140塊文庫保存板第10列中16個孔的單克隆菌液合并的離心管標記為(140)-10 第140塊文庫保存板第11列中16個孔的單克隆菌液合并的離心管標記為(140)-11 第140塊文庫保存板第12列中16個孔的單克隆菌液合并的離心管標記為(140)-12 第140塊文庫保存板第13列中16個孔的單克隆菌液合并的離心管標記為(140)-13 第140塊文庫保存板第14列中16個孔的單克隆菌液合并的離心管標記為(140)-14 第140塊文庫保存板第15列中16個孔的單克隆菌液合并的離心管標記為(140)-15 第140塊文庫保存板第16列中16個孔的單克隆菌液合并的離心管標記為(140)-16庫保存板第17列中16個孔的單克隆菌液合并的離心管標記為(140)-17， 第140塊文庫保存板第18列中16個孔的單克隆菌液合并的離心管標記為(140)-18， 第140塊文庫保存板第19列中16個孔的單克隆菌液合并的離心管標記為(140)-19， 第140塊文庫保存板第20列中16個孔的單克隆菌液合并的離心管標記為(140)-20， 第140塊文庫保存板第21列中16個孔的單克隆菌液合并的離心管標記為(140)-21， 第140塊文庫保存板第22列中16個孔的單克隆菌液合并的離心管標記為(140)-22， 第140塊文庫保存板第23列中16個孔的單克隆菌液合并的離心管標記為(140)-23， 第140塊文庫保存板第M列中16個孔的單克隆菌液合并的離心管標記為(140)-24 ； (2) 二級混合池的構建
對步驟(1)的一級混合池再進行組合，將每一塊文庫保存板所對應的M個一級混合池合并成一個二級混合池(圖2)，具體操作是從第1文庫保存板開始，依次，將每一文庫保存板所對應的M個一級混合池中的混合菌液分別用最大量程為200 μ 1移液槍吸取50 μ 1 混合菌液，合加在一個空的1. 5ml離心管中，將離心管標記為X，X為文庫保存板的編號， X=l，2，3，……自然數，該混合池命名為X號二級混合池；每次吸取一個一級混合池的混合菌液之前，先用該移液槍充分混勻，并且每次更換無菌移液槍頭；將構建成的二級混合池放入37°C恒溫搖床中培養6 他；因每一塊文庫保存板所對應的M個一級混合池合并成一個二級混合池，云南藥用野生稻BIBAC基因文庫有140塊文庫保存板，所以構成140個二級混合池，即二級混合池的數為X，X=云南藥用野生稻BIBAC基因文庫的文庫保存板數；
以下以第1塊文庫保存板，第2塊文庫保存板，第3塊文庫保存板，第140塊文庫保存板為例，更具體地說明各文庫保存板所對應的M個一級混合池合并成一個二級混合池及其標記
第1塊文庫保存板所對應的M個一級混合池分別是(I)-I號一級混合池，(1)-2號一級混合池，(1)-3號一級混合池，(1)-4號一級混合池，(1)-5號一級混合池，(1)-6號一級混合池，(1)-7號一級混合池，(1)-8號一級混合池，(1)-9號一級混合池，(I)-IO號一級混合池，(I)-Il號一級混合池，(1)-12號一級混合池，(1)-13號一級混合池，(1)-14號一級混合池，(1)-15號一級混合池，(1)-16號一級混合池，(1)-17號一級混合池，(1)-18號一級混合池，(1)-19號一級混合池，(1)-20號一級混合池，(1)-21號一級混合池，(1)-22 號一級混合池，(1) -23號一級混合池，(1)-24號一級混合池；將這M個一級混合池按上述方法合并后的二級混合池標記是1，X=I ；命名為1號二級混合池
第2塊文庫保存板所對應的M個一級混合池分別是(2)-1號一級混合池，(2)-2號一級混合池，(2)-3號一級混合池，(2)-4號一級混合池，(2)-5號一級混合池，(2)-6號一級混合池，(2)-7號一級混合池，(2)-8號一級混合池，(2)-9號一級混合池，(2)-10號一級混合池，(2)-11號一級混合池，(2)-12號一級混合池，(2)-13號一級混合池，(2)-14號一級混合池，(2)-15號一級混合池，(2)-16號一級混合池，(2)-17號一級混合池，(2)-18號一級混合池，(2)-19號一級混合池，(2)-20號一級混合池，(2)-21號一級混合池，(2)-22 號一級混合池，(2) -23號一級混合池，(2) -24號一級混合池；將這M個一級混合池按上述方法合并后的二級混合池的標記是2，X=2 ；命名為2號二級混合池；
第3塊文庫保存板所對應的M個一級混合池分別是(3) -1號一級混合池，(3) -3號一級混合池，(3) -4號一級混合池，(3) -5號一級混合池，(3) -6號一級混合池，(3) -7號一級混合池，(3)-8號一級混合池，(3)-9號一級混合池，(3)-10號一級混合池，(3)-11 號一級混合池，(3) -12號一級混合池，(3) -13號一級混合池，(3) -14號一級混合池， (3) -15號一級混合池，(3) -16號一級混合池，(3) -17號一級混合池，(3) -18號一級混合池，(3) -19號一級混合池，(3) -20號一級混合池，(3) -21號一級混合池，(3) -22號一級混合池，(3) -23號一級混合池，(3) -24號一級混合池；將這M個一級混合池按上述方法合并后的二級混合池的標記是3，X=3 ；命名為3號二級混合池；
依此類推，到第140塊文庫保存板時，第140塊文庫保存板所對應的M個一級混合池分別是(140) -1號一級混合池，(140) -2號一級混合池，(140) -3號一級混合池，(140) -4 號一級混合池，(140) -5號一級混合池，(140) -6號一級混合池，(140) -7號一級混合池， (140) -8號一級混合池，(140) -9號一級混合池，(140) -10號一級混合池，(140) -11號一級混合池，(140) -12號一級混合池，(140) -13號一級混合池，(140) -14號一級混合池， (140)-15號一級混合池，(140)-16號一級混合池，(140)-17號一級混合池，(140)-18號一級混合池，(140) -19號一級混合池，(140) -20號一級混合池，(140) -21號一級混合池， (140) -22號一級混合池，(140) -23號一級混合池，(140) -24號一級混合池；將這M個一級混合池按上述方法合并后的二級混合池的標記是140，X=140 ；命名為140號二級混合池；
(3)三級混合池的構建
按步驟(2)的二級混合池編號順序從1號二級混合池開始，每10個二級混合池合并成為一個三級混合池(圖3)，將每10個二級混合池中混合菌液分別用最大量程為200 μ 1移液槍吸取100 μ 1混合菌液，合加在一個空的1. 5mL離心管中，將離心管標記為1，即n=l，該混合池命名為1號三級混合池，共構成X/10個三級混合池，X與文庫保存板的編號相同，云南藥用野生稻BIBAC基因文庫有140塊文庫保存板，即X=140，X/10=140/10=14，所以構成 14個三級混合池；
以下從1號二級混合池開始，將1號二級混合池至10號二級混合池的10個二級混合池合并成一個三級混合池，依次，至140號二級混合池的合并及標記如下
將1號二級混合池，2號二級混合池，3號二級混合池，4號二級混合池，5號二級混合池，6號二級混合池，7號二級混合池，8號二級混合池，9號二級混合池和10號二級混合池共10個二級混合池按上述方法合并成一個三級混合池，其離心管標記為1，n=l，該混合池命名為1號三級混合池；
將11號二級混合池，12號二級混合池，13號二級混合池，14號二級混合池，15號二級混合池，16號二級混合池，17號二級混合池，18號二級混合池，19號二級混合池和20號二級混合池共10個二級混合池按上述方法合并成一個三級混合池，其離心管標記為2，n=2, 該混合池命名為2號三級混合池；
將21號二級混合池，22號二級混合池，23號二級混合池，M號二級混合池，25號二級混合池J6號二級混合池，27號二級混合池，觀號二級混合池，四號二級混合池和30號二級混合池共10個二級混合池按上述方法合并成一個三級混合池，其離心管標記為3，n=3, 該混合池命名為3號三級混合池；
將31號二級混合池，32號二級混合池，33號二級混合池，34號二級混合池，35號二級混合池，36號二級混合池，37號二級混合池，38號二級混合池，39號二級混合池和40號二級混合池共10個二級混合池按上述方法合并成一個三級混合池，其離心管標記為4，n=4, 該混合池命名為4號三級混合池；
將41號二級混合池，42號二級混合池，43號二級混合池，44號二級混合池，45號二級混合池，46號二級混合池，47號二級混合池，48號二級混合池，49號二級混合池和50號二級混合池共10個二級混合池按上述方法合并成一個三級混合池，其離心管標記為5，n=5, 該混合池命名為5號三級混合池；
將51號二級混合池，52號二級混合池，53號二級混合池，54號二級混合池，55號二級混合池，56號二級混合池，57號二級混合池，58號二級混合池，59號二級混合池和60號二級混合池共10個二級混合池按上述方法合并成一個三級混合池，其離心管標記為6，n=6, 該混合池命名為6號三級混合池；
將61號二級混合池，62號二級混合池，63號二級混合池，64號二級混合池，65號二級混合池，66號二級混合池，67號二級混合池，68號二級混合池，69號二級混合池和70號二級混合池共10個二級混合池按上述方法合并成一個三級混合池，其離心管標記為7，n=7, 該混合池命名為7號三級混合池；
將71號二級混合池，72號二級混合池，73號二級混合池，74號二級混合池，75號二級混合池，76號二級混合池，77號二級混合池，78號二級混合池，79號二級混合池和80號二級混合池共10個二級混合池按上述方法合并成一個三級混合池，其離心管標記為8，n=8, 該混合池命名為8號三級混合池；
將81號二級混合池，82號二級混合池，83號二級混合池，84號二級混合池，85號二級混合池，86號二級混合池，87號二級混合池，88號二級混合池，89號二級混合池和90號二級混合池共10個二級混合池按上述方法合并成一個三級混合池，其離心管標記為9，n=9, 該混合池命名為9號三級混合池；
將91號二級混合池，92號二級混合池，93號二級混合池，94號二級混合池，95號二級混合池，96號二級混合池，97號二級混合池，98號二級混合池，99號二級混合池和100號二級混合池共10個二級混合池按上述方法合并成一個三級混合池，其離心管標記為10， n=10，該混合池命名為10號三級混合池；
將101號二級混合池，102號二級混合池，103號二級混合池，104號二級混合池，105號二級混合池，106號二級混合池，107號二級混合池，108號二級混合池，109號二級混合池和 110號二級混合池共10個二級混合池按上述方法合并成一個三級混合池，其離心管標記為 11，n=ll，該混合池命名為11號三級混合池；
將111號二級混合池，112號二級混合池，113號二級混合池，114號二級混合池，115號二級混合池，116號二級混合池，117號二級混合池，118號二級混合池，119號二級混合池和 120號二級混合池共10個二級混合池按上述方法合并成一個三級混合池，其離心管標記為 12，n=12，該混合池命名為12號三級混合池；
將121號二級混合池，122號二級混合池，123號二級混合池，124號二級混合池，125 號二級混合池，126號二級混合池，127號二級混合池，128號二級混合池，129號二級混合池和130號二級混合池共10個二級混合池按上述方法合并成一個三級混合池，其離心管標記為13，n=13，該混合池命名為13號三級混合池；
將131號二級混合池，132號二級混合池，133號二級混合池，134號二級混合池，135號二級混合池，136號二級混合池，137號二級混合池，138號二級混合池，139號二級混合池和 140號二級混合池共10個二級混合池按上述方法合并成一個三級混合池，其離心管標記為 14，n=14，該混合池命名為14號三級混合池。按上述方法所構建的混合池為本發明所述的BIBAC基因文庫混合池。實施例3 —種基因的快速篩選的方法
本實施列以篩選抗白葉枯病基因)(a21為例，闡述本發明所述的一種基因的快速篩選的方法，其步驟如下
(1)、按實施例2構建云南藥用野生稻BIBAC基因文庫一級混合池、二級混合池和三級混合池；
(2)、根據抗白葉枯病基因)Ca21的序列設計引物，并合成該引物
根據在Genbank查找抗白葉枯病基因辦21的序列設計特異引物，所述的特異引物的堿基序列是
5 ‘ -AGACGCGGAAGGGTGGTTCCCGGA-3‘； 5 ‘ -AGACGCGGTAATCGAAAGATGAAA-3‘ 上述引物對委托上海生工生物工程技術服務有限公司合成；
(3)以步驟(1)所構建的三級混合池為第一步篩選的模板，用步驟(2)所獲得的引物按常規PCR方法進行篩選，得到陽性克隆池；
所述的第一步篩選的模板分別是云南藥用野生稻BIBAC基因文庫混合池的如下14個三級混合池
1號三級混合池；2號三級混合池；3號三級混合池；4號三級混合池；5號三級混合池； 6號三級混合池；7號三級混合池；8號三級混合池；9號三級混合池；10號三級混合池；11 號三級混合池；12號三級混合池；13號三級混合池；14號三級混合池。經試驗，確定最佳PCR反應體系和反應條件如表1，PCR反應總體系為20 μ 1 ；
權利要求
1.BIBAC基因文庫混合池的構建方法，包括如下步驟(1)一級混合池的構建待BIBAC基因文庫的文庫保存板中的單克隆菌液完全融化后，將每一塊文庫保存板中每一列中的16個孔內的單克隆菌液合并成一個一級混合池，將一級混合池標記為(X)-y， X為文庫保存板的編號，X=l，2，3，……自然數，y為每一塊文庫保存板中列的編號，y=l， 2,3,……自然數，該一級混合池命名為(X) _y號一級混合池；(2)二級混合池的構建將每一塊文庫保存板所對應的一級混合池合并成一個二級混合池，將二級混合池標記為X，X=l，2，3，……自然數，該二級混合池命名為X號二級混合池；X與文庫保存板的編號相同；(3)三級混合池的構建按二級混合池編號順序從1號二級混合池開始，每10個二級混合池合并成為一個三級混合池，將三級混合池記為η，η =1,2,3,……自然數，該三級混合池命名為η號三級混合池。
2.—種BIBAC基因文庫混合池，所述的BIBAC基因文庫混合池是按權利要求1所述的 BIBAC基因文庫混合池的構建方法構建獲得。
3.一種基因的快速篩選方法，包括以下步驟(1)按上述技術方案1所述的BIBAC基因文庫混合池的構建方法構建一級混合池、二級混合池和三級混合池；(2)根據目的基因的特異序列或同源基因序列設計引物，并合成該引物；(3)以步驟(1)所構建的三級混合池為第一步篩選的模板，用步驟(2)所獲得的引物按常規PCR方法進行篩選，得到陽性克隆池；(4)用步驟(3)所得到陽性克隆池所對應的二級混合池為第二步篩選的模板，按照步驟(3)相同的PCR體系進行篩選，得到陽性克隆池；(5)用步驟(4)獲得的陽性克隆池所對應的一級混合池作為第三步篩選的模板，按照步驟(3)相同的PCR體系進行篩選，得到陽性克隆池；(6)對步驟(5)所述的陽性克隆池所對應的16個單克隆，按照步驟(3)相同的PCR體系進行篩選，得到陽性克隆；(7)，采用目的基因的特異序所設計的引物進行PCR時，如果步驟(3)到步驟(6)各步驟所得到的陽性克隆的片段大小相同，即可認定步驟(6)獲得的陽性克隆為目的基因；采用同源基因序列設計的引物進行PCR時，將步驟(6)得到陽性克隆回收純化，測序、進行blast 比對，以比對結果確定目的基因。
全文摘要
本發明公開了BIBAC基因文庫混合池的構建方法及其混合池和基因的快速篩選方法，BIBAC基因文庫混合池的構建是將每一塊文庫保存板中每一列中的16個孔內的單克隆菌液合并成一個一級混合池；將每一塊文庫保存板所對應的一級混合池合并成一個二級混合池；每10個二級混合池合并成為一個三級混合池。基因的快速篩選方法是以三級混合池為第一步篩選的模板，用設計的引物進行PCR，篩選得到陽性克隆池；然后逐一以得到陽性克隆池所對應的混合池為篩選的模板，最后得到陽性克隆；根據各步驟所得到的陽性克隆的片段大小或測序比對，確定目的基因。所構建混合池能準確地找到任何單拷貝序列，基因的快速篩選方法可節省大量工作量和大量成本。
文檔編號C40B50/06GK102443854SQ201110256870
公開日2012年5月9日 申請日期2011年9月2日 優先權日2011年9月2日
發明者付堅, 余騰瓊, 侯思名, 張敦宇, 張薇, 李娥賢, 李定琴, 李維蛟, 殷富有, 王玲仙, 程在全, 蔣聰, 郭怡卿, 鐘巧芳, 陳玲, 黃興奇 申請人:云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所