專利名稱：一種白樺葉片基因組dna提取方法
技術領域：
本發明涉及基因工程技術領域，尤其涉及的是一種高質量白樺葉片基因組DNA提取方法。
背景技術：
高純度基因組DNA是基因組測序、基因克隆、分子雜交、基因文庫構建和分子標記等一系列分子生物學研究的前提。白樺葉片中酚類、多糖、萜類等次生物質含量較高，特別是生長在我國東北白樺，由于要適應東北地區較為嚴酷的地理及氣候環境，體內各種次生物質種類更多、含量更高，會對DNA的提取造成更為嚴重的影響。因此，如何去除這些雜質以獲得高質量的DNA是白樺葉片基因組DNA提取過程中面臨的主要問題，也是對白樺進行分子生物學研究的前提條件。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足提供一種高質量白樺葉片基因組DNA提取方法。本發明的技術方案如下①葉片在加液氮的研缽中研磨至細末后，加入300 U L改良STE溶液，300 y L改良CTAB溶液(改良STE溶液和改良CTAB溶液等體積)和20 y L P —巰基乙醇，混合后震蕩3min ;改良 CTAB 溶液配方2. 5 % (ff/V)CTAB, 150mmol/LTris-Cl (pH8. 0),20mmol/L EDTA(pH8. 0),1. 4mmol/L NaCl ;改良SET溶液配方150mmol/L Tris-Cl(pH8. 0),20mmol/L EDTA(pH8. 0),1. 4mmol/LNaCl ；②常溫5000g離心5min，棄上清；向沉淀中加入加600 y L改良CTAB溶液和20 u L ^ 一疏基乙醇70°C水浴15min后16060g離心5min ；③取上清加入等體積氯仿充分混勻，16060g離心5min,重復此步驟2次；④取上清加入等體積的無水乙醇異丙醇混合液(體積比為2:1)，上下顛倒混合均勻后常溫下靜置3min,6080g離心3min ；⑤倒掉上清液，用70%預冷的乙醇洗滌2 3次，干燥后溶于50 ii L TE或去離子水中；⑥電泳檢測DNA的完整性，A260/280測定DNA濃度和純度。本發明的提取方法方法能提取出高質量白樺葉片基因組DNA，其核心技術包括以下幾個內容1、改良了 CTAB與STE溶液；2、采用常溫下等體積的改良CTAB溶液和STE溶液洗滌經充分研磨的材料2次；3、水浴裂解溫度由65°C提高至70°C ;4、在沉淀DNA時，采用無水乙醇異丙醇(體積比為2:1)混合沉淀劑，低速離心，以降低雜質的沉淀。這種方法能分離出高質量的白樺葉片基因組DNA。


圖1為不同方法提取的白樺DNA電泳結果；1、2泳道為CTAB法提取的DNA ;3、4泳道為SDS法提取的DNA ;5、6泳道方法III提取的DNA電泳；7泳道方法IV (STE洗滌I次)提取的DNA ；8泳道方法V (CTAB洗滌I次)提取的DNA ；圖2為方法IV提取的白樺DNA電泳結果；1.和2泳道為STE和CTAB洗滌混合液洗滌I次后提取的白樺基因組DNA ；3.和4泳道STE和CTAB洗滌混合液洗滌I次后提取的白樺基因組DNA ；5.和6泳道為STE和CTAB洗滌混合液洗滌2次后提取的白樺基因組DNA ；圖3為方法IV提取的白樺DNA EcoR I與MseI酶切電泳結果；1.為白樺葉片基因組DNA;2.白樺葉片基因組DNA被EcoR I酶切后電泳結果；3.白樺葉片基因組DNA被MseI酶電泳切結果；4.標準DNA分子量；5 7泳道為重復；圖4為白樺不同個體葉片基因組DNA的RAH)擴增結果。
具體實施方式

以下結合具體實施例，對本發明進行詳細說明。材料白樺葉片取自東北林業大學校園內已達開花結實的白樺，于8月未摘取的成熟葉片，葉片保存在_20°C冰箱。試劑CTAB 溶液(2 % (ff/V)CTAB, IOOmmoI/L Tris-Cl(pH8. 0), 20mmol/LEDTA(pH8. 0),1.4mmol/LNaCl)STE 溶液(IOOmmo 1/L Tris-Cl (pH8. 0),20mmol/L EDTA (pH8. 0)，改良CTAB 溶液(2. 5 % (W/V)CTAB，150mmol/L Tris-Cl (pH8. 0), 20mmol/L EDTA(pH8. 0),1. 4mmol/LNaCl)；改良SET 溶液(150mmol/L Tris-Cl (pH8. 0), 20mmol/L EDTA (pH8. 0),1. 4mmol/LNaCl)；其他試劑40mmol/L疏基乙醇，lOOmmol/L Tris HCI (pH8. 0), 20mmol/LEDTA,10%SDS, IOmo 1/L LiCI (高壓滅菌)，氯仿 / 異戊醇(24 :1)，Tris 飽和酚，5mol/L KAC，TE 緩沖液。EcoRI和MseI酶購自紐英倫公司。其他均為常規國產試劑。主要儀器和設備凝膠成像系統(UVP)，MIKR0120微量臺式高速離心機(Hettich) ,-20°C超低溫冰箱(Harris),-40°C低溫冰箱(海爾公司),超純水儀(Milipore)；DYY-1I1-12B型三恒多用電泳儀(六一儀器廠)，可見紫外分光光度計(ABI);渦旋振蕩器GL-88B (江蘇海門麒麟醫用儀器廠)。1. DNA提取方法方法1:常規的CTAB法參照王關林等的《植物基因工程》。方法I1:SDS法參照顧洪雅的方法。方法III①向1. 5 ii L的無菌離心管加600 U LCTAB裂解液和20 ii L @ -巰基乙醇，65°C浴熱5min。②從-20°C取出材料后加液氮研磨至材料成灰白色，向步驟①中的每個離心管中加約0. 04g材料，劇烈震蕩混勻，65°C浴熱lOmin。③隨后加入1/3體積5mol/L KAC(pH8. 0)，充分混勻。再加入200 u LTris飽和酚(pH9. 5)和300 u L氯仿。輕輕震蕩IOmin。④常溫16060g離心lOmin，取600ii L上清液加入等體積的酚(同上)氯仿(3 1)，輕輕震蕩5min。⑤常溫16060g離心lOmin，取600 ii L上清液加適量無水乙醇，再加入等體積氯仿后震湯5min。⑥常溫16060g離心lOmin，取上清加入2/3體積異丙醇，輕輕混勻3min。⑦常溫6080g離心5min，去上清液后加適量水溶解，加入1/10體積3mol/LNaAC和2. 5倍體積乙醇_20°C沉淀30min。
⑧常溫6080g離心lOmin，去上清液后用70%酒精洗滌2 3次，室溫或真空干燥后加55 u LTE溶解。電泳檢測DNA的完整性，A2607280測定DNA濃度和純度。方法IV:①葉片在加液氮的研缽中研磨至細末后，向1. 5 ii L的無菌離心管加600 U LSTE和20 u 一巰基乙醇混合震蕩3min。常溫5000g離心5min,棄上清；向下層沉淀中加入600 u L CTAB后劇烈振蕩混勻，65°C浴熱IOmin;再加入400 u L Tris飽和酚(pH9. 5)和200 u L氯仿，輕輕振蕩IOmin。②常溫16060g離心lOmin，取600ii L上清液加入等體積的酚(同上)氯仿(3 1)，輕輕震蕩5min。③常溫16060g離心lOmin，取600 ii L上清液加適量無水乙醇，再加入等體積氯仿后震湯5min。④常溫16060g離心lOmin，取上清加入2/3體積異丙醇，輕輕混勻3min。⑤常溫6080g離心5min，去上清液后加適量水溶解，加入1/10體積3mol/LNaAC和2. 5倍體積乙醇_20°C沉淀30min。⑥常溫6080g離心lOmin，去上清液后用70%酒精洗滌2 3次，室溫或真空干燥后加55 u LTE溶解。電泳檢測DNA的完整性，A2607280測定DNA濃度和純度。方法V :①葉片在加液氮的研缽中研磨至細末后，向1. 5 ii L的無菌離心管加600 U LCTAB溶液和20 IiLP—巰基乙醇混合震蕩3min。常溫5000g離心5min,棄上清；向下層沉淀中加入600 u L CTAB后劇烈振蕩混勻，65°C浴熱IOmin;再加入400 u L Tris飽和酚(pH9. 5)和200 u L氯仿，輕輕振蕩IOmin。②常溫16060g離心lOmin，取600ii L上清液加入等體積的酚(同上)氯仿(3
1)，輕輕震蕩5min。③常溫16060g離心IOmin,取600 u L上清液加等體積氯仿后震蕩5min。④常溫16060g離心lOmin，取上清加入2/3體積異丙醇，輕輕混勻3min。⑤常溫6080g離心5min，去上清液后加適量水溶解，加入1/10體積3mol/LNaAC和
2.5倍體積乙醇_20°C沉淀30min。⑥常溫6080g離心lOmin，去上清液后用70%酒精洗滌2 3次，室溫或真空干燥后加55 ii LTE溶解。電泳檢測DNA的完整性，A26Q/■測定DNA濃度和純度。VII方法V1:①葉片在加液氮的研缽中研磨至細末后，分別用STE和CTAB溶液(等體積)與20 u L^-巰基乙醇混合震蕩3min。常溫5000g離心5min，棄上清。重復此步驟f 2次。②常溫5000g離心5min，棄上清。向沉淀中加入加600 y L改良的CTAB溶液和20 u L ^ -疏基乙醇70°C水浴15min后16060g離心5min。③取上清加入等體積氯仿充分混勻，16060g離心5min,重復此步驟2次。④取上清加入等體積無水乙醇異丙醇(體積比為2:1)，上下顛倒混合均勻后常溫靜置3min,6080g離心3min。⑤倒掉上清液，用70%預冷的乙醇洗滌2 3次，干燥后溶于50 ii L TE或去離子水
中。 ⑥電泳檢測DNA的完整性，A260/280測定DNA濃度和純度。方法vn①葉片在加液氮的研缽中研磨至細末后，加入300 U L改良STE溶液、300 y L改良CTAB溶液(改良STE溶液和改良CTAB溶液等體積)和20 y L P —巰基乙醇，混合震蕩3min。②常溫5000g離心5min，棄上清。向沉淀中加入加600 y L改良的CTAB溶液和20 u L ^ 一疏基乙醇70°C水浴15min后16060g離心5min。③取上清加入等體積氯仿充分混勻，16060g離心5min,重復此步驟2次。④取上清加入等體積無水乙醇異丙醇(體積比為2:1)，上下顛倒混合均勻后常溫下靜置3min,6080g離心3min。⑤倒掉上清液，用70%預冷的乙醇洗滌2 3次，干燥后溶于50 ii L TE或去離子水中。⑥電泳檢測DNA的完整性，A260/280測定DNA濃度和純度。方法VDI①葉片在加液氮的研缽中研磨至細末后，分別用改良STE和CTAB溶液(等體積)與20 u 一巰基乙醇混合震蕩3min。常溫5000g離心5min,棄上清。重復此步驟I次。②常溫5000g離心5min，棄上清。向沉淀中加入加600 y L改良的CTAB溶液和20 u L ^ 一疏基乙醇70°C水浴15min后16060g離心5min。③取上清加入等體積氯仿充分混勻，16060g離心5min,重復此步驟2次。④取上清加入等體積無水乙醇異丙醇(體積比為2:1)，上下顛倒混合均勻后常溫下靜置3min,6080g離心3min。⑤倒掉上清液，用70%預冷的乙醇洗滌2 3次，干燥后溶于50 ii L TE或去離子水中。⑥電泳檢測DNA的完整性，A260/280測定DNA濃度和純度。2. DNA質量檢測2.1DNA完整性檢測在0. 8%的瓊脂糖凝膠中，于5V/cm電壓下電泳，檢測總DNA的完整性。2. 2DNA純度檢測通過紫外分光光度測定260nm/280nm比值判斷總DNA的純度。2. 3DNA酶切檢測白樺葉片基因組DNA EcoRI單酶解，反應體積20ii L :DNA800ng，酶2U，EcoR IBuffer 2u L0 酶解條件37°C，反應 2h。
白樺葉片基因組DNA MseI單酶解，反應體積20 ii L :DNA800ng，酶2U，MseI Buffer2uL0酶解條件37°C，反應2h。白樺葉片基因組DNA 雙酶切體系2. 9 ii L DNA(50ng/ u L), 5 u L 10XBuffer,
0.5u LlOO X BSA, 0. 8u L MseI (I OU/ u L), 0. 4 u L EcoRI (20U/ u L)，加離子水至 50 y L 去。酶解產物點樣于1. 5%的瓊脂糖凝膠上電泳、觀察并拍照。2. 4白樺葉片基因組DNA PCR擴增檢測
擴增體系(20ii L) :1. 2 ii LMg2+ (25mmol/L)，0. 4 ii LdNTPs (2. 5mmol/L)，0.4iiLRAPD$*(50pmol/iiL)，liiLTaq DNA 聚合酶(IU/y L)，I y 模板 DNA (40ng/U L), 2 u LlO XPCRbuffer0 擴增程序94°C 4min，然后進入下列循環94°C 45s, 56°C 45s,72°C 80s, 35個循環；72°C 7min。PCR儀為MJ-9600。擴增產物在2%的瓊脂糖凝膠上120V電泳2h，UVP凝膠成像系統拍照。3.結果與分析3.1CTAB法、SDS法、方法II1、方法IV和方法V提取的DNA電泳檢測結果分別取2 U L DNA樣品，在0. 8%的瓊脂糖凝膠上用高電場(5V/cm)電泳法檢測其DNA的完整性。結果表明，常規CATB法(圖1中1、2泳道)、SDS法(圖1中3、4泳道)，方法III提取的DNA (圖1中5、6泳道);方法IV (STE溶液洗滌I次)提取的DNA (圖1中7泳道)，方法V (CTAB溶液洗滌I次)提取的DNA (圖1中8泳道)提取白樺基因組DNA時多糖污染嚴重，樣孔中EB吸收明顯，而且有大量的降解RNA的存在。此外，此圖為電泳l:30h后的圖譜，可以看出，DNA沒有離開樣孔，說明DNA已與多糖等次生物質相結合，在電場中無法遷移。因此,常規的CTAB、SDS法，方法II1、方法IV和方法V和均不適應富含較高多糖和次生物質的白樣葉片基因組DNA提取。3. 2方法V1、VII和VDI的白樺DNA完整性和純度的檢測圖2中I和2泳道為方法VI提取的白樺葉片基因組DNA電泳結果，其DNA仍然在點樣孔附近，說明DNA中仍含有多糖或其也次生代謝物質。圖2中3和4泳道為方法VII提取的白樺葉片基因組DNA電泳結果，其電泳后DNA條帶正齊，說明提以的DNA完整、無降解，而且將葉片中的RNA已完合去除，但點樣孔仍然有發亮的現象，說明提取的DNA中仍含有少量的多糖或次生代謝物質。圖2中5和6泳道為方法VDI提取的白樺葉片基因組DNA電泳結果，其電泳后DNA條帶正齊，說明提以的DNA完整、無降解，而且將葉片中的RNA已完合去除，而且點樣孔非常干凈，說明提取的DNA中已完全去除了多糖或次生代謝物質。方法IV提取的白樺葉片基因組DNA電泳結果如圖2中5飛泳道所示，點樣孔較干凈，說明方法IV中用SET多次洗滌對于去除多糖效果明顯。同時，也可以明顯看出，方法珊提取的DNA電泳條帶亮度較弱，說明有SET多次洗滌時，也造成了 DNA的大量丟失。5飛泳道對應DNA的0D26Q/0D28Q分別為1. 82和1. 84，表明提取的DNA中沒有蛋白質或其他物質的污染，符合分子生物學研究所要求的質量標準，說明改造后的方法較為適合提取富含多糖的白樺葉片基因組DNA。3. 3方法VDI的提取的DNA的酶切驗證為了進一步驗證圖2中5、6泳道對應的方法提取的DNA的質量，進行了 EcoR和MseI單酶切和雙酶切實驗，酶切后電泳結果如圖3所示。結果表明，不論是單酶切還是雙酶切，酶切后的DNA均呈彌散狀，酶切效果較好，說明DNA純度較高，完全可以進行后續的分子生的學操作。3. 4方法VDI的提取的DNA的RAPD擴增驗證以方法VI提取不同纖維長度的白樺個體葉片基因組DNA材料，用篩選出的多態性高的引物進行擴增分析，擴增產物電泳結果如圖4，結果表明，不同纖維長度個體擴增結果均較好，說明提取的DNA分子完全可來進行分子標記等分子生物實驗研究。
應當理解的是，對本領域普通技術人員來說，可以根據上述說明加以改進或變換，而所有這些改進和變換都應屬于本發明所附權利要求的保護范圍。
權利要求
1. 一種白樺葉片基因組DNA提取方法，其特征在于，包括以下步驟①葉片在加液氮的研缽中研磨至細末后，加入300μ L改良STE溶液，300 μ L改良CTAB 溶液和20 μ Li3 —巰基乙醇，混合后震蕩3min ;改良CTAB溶液配方2. 5 % (W/V) CTAB， 150mmol/L Tris-Cl (pH8. 0),20mmol/L EDTA (pH8. 0),1. 4mmol/L NaCl ;改良 SET 溶液配方150mmol/L Tris-Cl (pH8. 0),20mmol/L EDTA (pH8. 0),1. 4mmol/L NaCl ；②常溫5000g離心5min，棄上清；向沉淀中加入加600μ L改良CTAB溶液和20 μ L β — 巰基乙醇70°C水浴15min后16060g離心5min ；③取上清加入等體積氯仿充分混勻，16060g離心5min,重復此步驟1 2次；④取上清加入等體積的無水乙醇異丙醇混合液,無水乙醇異丙醇的體積比為2:1， 上下顛倒混合均勻后常溫下靜置3min，6080g離心3min ；⑤倒掉上清液，用70%預冷的乙醇洗滌2 3次，干燥后溶于50μ L TE或去離子水中；⑥電泳檢測DNA的完整性，Α260/280測定DNA濃度和純度。
全文摘要
本發明公開了一種白樺葉片基因組DNA提取方法，改良了CTAB與STE溶液；采用常溫下等體積的改良CTAB溶液和STE溶液洗滌充分研磨的材料2次；水浴裂解溫度由65℃提高至70℃；在沉淀DNA時，采用無水乙醇:異丙醇(體積比為2:1)混合沉淀劑，低速離心，以降低雜質的沉淀。這種方法能分離出高質量的白樺葉片基因組DNA。
文檔編號C12N15/10GK103013985SQ20131001627
公開日2013年4月3日 申請日期2013年1月17日 優先權日2013年1月17日
發明者魏志剛, 楊傳平, 張力杰, 曲贊霜, 候聰 申請人:東北林業大學