一種宮膜干細胞庫的構建方法
【專利摘要】本發明提供一種宮膜干細胞庫的構建方法，包括月經血采集、宮膜干細胞分離除菌、擴增及分析檢測、長期保存及定期檢測的步驟。本發明提供了簡便易行的除菌方法，去除細菌等物質的宮膜干細胞通過擴增培養可以獲得大量純度較高的宮膜干細胞，并長期保存，為未來的臨床及科研應用研究提供大量的宮膜干細胞資源。
【專利說明】一種宮膜干細胞庫的構建方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物醫學領域，具體涉及干細胞庫的構建，更具體涉及宮膜干細胞庫的構建。
【背景技術】
[0002]1999年，《Science》將人類胚胎干細胞研究成果評為當年世界十大科技進展之首，2000年，《Time》周刊將其列為20世紀末世界十大科技成就之首，并認為胚胎干細胞和人類基因組將同時成為新世紀最具發展和應用前景的領域。至此干細胞研究成為近年來生物學以及醫學領域中最引人注目的熱點之一。干細胞(stem cells, SC)是一類具有自我復制能力(self-renewing)的多潛能細胞,在一定條件下,它可以分化成多種功能細胞。干細胞(Stem Cell)是一種未充分分化，尚不成熟的細胞，具有再生各種組織器官和人體的潛在功能，改變了人類疾病的應對方法，醫學界稱為“萬用細胞”。目前干細胞來源可分為胚胎干細胞和成體干細胞，但這兩種來源都存在著部分局限性，因此尋找一種克服腫瘤形成的潛在性、標本來源的缺乏及倫理學爭議等弊端的干細胞來源具有重要意義。近年來，美國Musina領導的研究小組從健康女性的月經血中得到分離的干細胞。宮膜干細胞(MenSCs)避免了其他干細胞的不足，成為一種全新的具有重大研究和應用潛力的干細胞。
[0003]然而，經對現有技術文獻的檢索發現，報道的宮膜干細胞的獲取方法中，并沒有人針對分離過程中除菌的方法以及除菌的效果進行報道，不能保證宮膜干細胞分離的成功率，不利于后續過程的進行。
[0004] 本
【發明者】通過摸索，根據細胞與細菌、真菌等的密度差異，通過密度梯度離心以及一定范圍內反復洗滌離心的方法，可以去除細菌、真菌等，進而降低宮膜干細胞染菌的可能性，提高分離的成功率。通過大規模擴增培養可以獲得大量的宮膜干細胞，并長期保存，定期質量檢測，以便為未來的臨床以及科研應用研究提供大量的宮膜干細胞資源。

【發明內容】

[0005]本發明的目的是為了克服宮膜干細胞分離過程中的不足，實現高效的宮膜干細胞分離和長期保存。
[0006]本發明提供一種宮膜干細胞庫的構建方法，包括月經血采集、宮膜干細胞分離除菌、擴增及分析檢測、長期保存及定期檢測的步驟，該方法的特征在于:所述宮膜干細胞分離除菌包括用密度梯度離心或磁珠分選得到單個核細胞，并在密度梯度離心前后多次用緩沖液沖洗去除殘余細菌和雜質，所述密度梯度離心法使用密度為1.077的細胞分離液，300-500Xg, 15°C -25°C離心20-40分鐘，所述緩沖液沖洗中使用的緩沖液為含100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素的PBS。
[0007]本發明的宮膜干細胞庫的構建方法中，月經血的采集包括使用月事杯收集月經血，并保存在月經血保存液中，所述月經血保存液為添加肝素鈉的PBS鹽緩沖溶液或SPB鹽緩沖溶液。[0008]本發明方法中，月經血保存液中還可添加抗菌物質，所述抗菌物質選自兩性霉素、青霉素、頭孢拉定、頭孢唑啉、頭孢羥氨芐、頭孢呋辛、頭孢噻吩、鏈霉素、妥布霉素、四環素、土霉素、玻乙紅霉素、克拉霉素、乙酸螺旋霉素、阿奇霉素、羅紅霉素、紅霉素、克林霉素和林可霉素。月經血保存液中添加的抗菌物質優選兩性霉素、青霉素、鏈霉素。
[0009]本發明方法中的擴增步驟包括將分離所得單個核細胞于α-MEM+10%-20%血清完全細胞培養液中培養48-72小時后，更換新鮮的培養液，以后每3天全換液一次，細胞長滿約80% -90%時，用含EDTA的0.25%胰酶消化，然后進行傳代培養。
[0010]本發明方法中的分析檢測步驟包括無菌性檢測、流式細胞儀檢測、核型檢測和分化能力檢測。
[0011]本發明方法中的長期保存步驟包括將細胞以IX IO6至IX IO7細胞/ml的密度重懸在含細胞培養液、DMSO和血清的細胞凍存液中，采用程序降溫盒在_80°C冰箱中過夜進行程序降溫法保存，然后轉移到_196°C液氮中長期保存。
[0012]在長期保存過程中，進行定期檢測，包括細胞復蘇后進行細胞活性檢測、無菌性檢測、流式細胞儀檢測和分化能力檢測。
[0013]細胞活性檢測每隔12個月進行一次，將細胞復蘇后用臺盼藍染色檢測細胞存活率。
[0014]流式細胞儀檢測包括細胞表面抗原⑶14、⑶29、⑶44、⑶45、⑶90、HLA的檢測。
[0015]分化能力檢測包括成骨分化能力、成脂分化能力和成軟骨分化能力的檢測。
[0016]本發明的宮膜干細胞庫的構建方法中，擴增后的分析檢測和長期保存過程中的定期檢測都要進行無菌性檢測，包·括真菌的檢測和細菌的檢測。
[0017]本發明的一個【具體實施方式】包括以下步驟:
[0018]1、月經血的收集
[0019]利用月事杯收集月經血，保存在月經血保存液(含肝素鈉的PBS鹽緩沖溶液或SPB鹽緩沖溶液)中，于4°C條件下運送到GMP車間。
[0020]2、宮膜干細胞的分離和除菌
[0021]利用密度梯度離心或磁珠分選方法收集單個核細胞(PBMC)，通過多次PBS緩沖液反復沖洗，去除殘留的細菌等物質。
[0022]3、宮膜干細胞的擴增
[0023]將分離得到的單個核細胞在α -ΜΕΜ+10%-20%血清完全細胞培養液中培養，48-72小時后更換新鮮的培養液。以后每3天全換液一次，細胞長滿約80%-90%時，用0.25%胰酶(含EDTA)消化，傳代。
[0024]4、宮膜干細胞的檢測
[0025]將傳代的細胞進行無菌性檢測，流式細胞儀檢測，成骨分化檢測等一系列檢測。
[0026]5、宮膜干細胞的凍存
[0027]將傳代后的宮膜干細胞通過程序降溫法保存，即將細胞以1父106_至1父107細胞/ml的密度重懸在含細胞培養液、DMSO和血清的細胞凍存液中，采用程序降溫盒在_80°C冰箱中過夜，然后轉移到_196°C液氮中長期保存。
[0028]6、宮膜干細胞的定期檢測
[0029]每隔一定的時間(例如:12個月)，將宮膜干細胞復蘇，進行細胞活率、無菌性、流式細胞儀、分化能力等各項檢測，對保存的宮膜干細胞的質量進行監控。
[0030]發明人經過研究開發，提供了簡便易行的除菌方法，在獲得月經血樣本后，經過密度梯度離心、磁珠分選等方法得到單個核細胞(PBMC)，再通過多次PBS洗滌離心的方法去除殘余的細菌等物質，以提高獲得無菌的宮膜干細胞的成功率。通過擴增培養可以獲得大量純度較高的宮膜干細胞，并長期保存，定期質量檢測，以便為未來的臨床及科研應用研究提供大量的宮膜干細胞資源。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0031]圖1為本發明實施例的人宮膜干細胞的獲取方法及干細胞庫的構建方法流程圖。
[0032]圖2為本發明實施例的人宮膜干細胞的生長曲線示意圖。
[0033]圖3為本發明實施例的人宮膜干細胞流式檢測結果示意圖。
具體實施例
[0034]以下用實施例對本發明的技術方案作進一步闡述。本【技術領域】普通技術人員應當認識到，這些實驗例僅僅用于舉例說明本發明而不對本發明的范圍構成任何限制，對本發明所作的任何改變，只要不違背本發明的精神實質，都將落在權利要求范圍內。
[0035]實施例中的操作都國家認證的GMP車間中進行。操作流程見圖1。
[0036]實施例1、月經血的采集
[0037]供者簽署知情同意書后，將利用月事杯收集到的5ml_15ml月經血保存在等體積的月經血保存液(PBS，并添加100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素)中，4°C的條件下48小時內運送到國家認證的GMP車間。
[0038]實施例2、宮膜干細胞的分離
[0039]將5ml月經血混合液直接放在IOOmm的平皿中，補加5ml a -MEM (含20%的血清)，在37°C、5%C02的條件下靜置培養。48小時后，更換IOml新鮮培養液。對棄除的上清液進行無菌性檢測(見表1)。
[0040]表1對宮膜干細胞的無菌性檢測
【權利要求】
1.一種宮膜干細胞庫的構建方法，包括月經血采集、宮膜干細胞分離除菌、擴增及分析檢測、長期保存及定期檢測的步驟，其特征在于:所述宮膜干細胞分離除菌包括用密度梯度離心或磁珠分選得到單個核細胞，并在密度梯度離心前后多次用緩沖液沖洗去除殘余細菌和雜質，所述密度梯度離心法使用密度為1.077的細胞分離液，300-500 X g，15°C -25°C離心20-40分鐘，所述緩沖液沖洗中使用的緩沖液為含100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素的PBS。
2.如權利要求1所述的宮膜干細胞庫的構建方法，其中所述月經血采集包括使用月事杯收集月經血，并保存在月經血保存液中，所述月經血保存液為添加肝素鈉的PBS鹽緩沖溶液或SPB鹽緩沖溶液。
3.如權利要求2所述的宮膜干細胞庫的構建方法，其中所述月經血保存液中還添加抗囷物質，所述抗囷物質選自兩性霉素、青霉素、鏈霉素。
4.如權利要求1所述的宮膜干細胞庫的構建方法，其中所述擴增步驟包括將分離所得單個核細胞于α -ΜΕΜ+10%-20%血清完全細胞 培養液或無血清培養液中培養48-72小時后，更換新鮮的培養液，以后每3天全換液一次，細胞長滿約80%-90%時，用含EDTA的0.25%胰酶消化，然后進行傳代培養。
5.如權利要求1所述的宮膜干細胞庫的構建方法，其中所述分析檢測步驟包括無菌性檢測、流式細胞儀檢測和分化能力檢測。
6.如權利要求1所述的宮膜干細胞庫的構建方法，其中所述長期保存的步驟包括將細胞以IX IO6至IX IO7細胞/ml的密度重懸在含細胞培養液、DMSO和血清的細胞凍存液中，采用程序降溫盒在_80°C冰箱中過夜進行程序降溫法保存，然后轉移到_196°C液氮中長期保存。
7.如權利要求1所述的宮膜干細胞庫的構建方法，其中所述定期檢測的步驟包括細胞復蘇后進行細胞活性檢測、無菌性檢測、流式細胞儀檢測和分化能力檢測。
8.如權利要求7所述的宮膜干細胞庫的構建方法，其中所述細胞活性檢測每隔12個月進行一次，將細胞復蘇后用臺盼藍染色檢測細胞存活率。
9.如權利要求5或7所述的宮膜干細胞庫的構建方法，其中所述流式細胞儀檢測包括細胞表面抗原⑶14、⑶29、⑶44、⑶45、⑶90、HLA的檢測。
10.如權利要求5或7所述的宮膜干細胞庫的構建方法，其中所述分化能力檢測包括成骨分化能力、成脂分化能力和成軟骨分化能力的檢測。
11.如權利要求1所述的方法，還包括:細胞收獲之后，檢測合格后凍存于管內，并填寫細胞的詳細信息，包括供者姓名、細胞代數、細胞培養液成分和濃度、細胞接種密度，凍存液成分和凍存日期，完整記錄每一樣本的真實冷凍狀況，將信息準確無誤地掃描入數據管理系統，完成細胞庫信息錄入和構建。
12.如權利要求11所述的方法，還包括:細胞凍存信息錄入完畢后，自動化系統根據液氮情況自動尋找空缺位置，將細胞凍存于相應的空格中。
13.如權利要求12所述的方法，凍存空間具有良好的衛生環境，包括潔凈區，通風，采光環境，并符合國家相關文件規定并定期從凍存環境中取出細胞進行復蘇檢測活性等指標。
【文檔編號】C40B50/06GK103849944SQ201210514551
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2012年12月5日 優先權日:2012年12月5日
【發明者】劉召青, 陳彥田, 齊瀚實 申請人:上海坤愛生物科技有限公司