一種人生理特征基因芯片的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種人生理特征基因芯片，包括步驟：1）提取受檢者樣本DNA；2）對(duì)樣本DNA進(jìn)行目的基因的PCR擴(kuò)增、純化、片段化及熒光素標(biāo)記；3）熒光素標(biāo)記的PCR產(chǎn)物進(jìn)行基因芯片雜交，檢測(cè)目的基因多態(tài)性位點(diǎn)；4）根據(jù)步驟3）得到的基因分型結(jié)果，評(píng)估受檢者的生物學(xué)性狀。通過(guò)相關(guān)基因分型，可以對(duì)受檢者進(jìn)行性格、情感、智商、閱讀、數(shù)學(xué)、飲酒、成癮性、運(yùn)動(dòng)和體質(zhì)等生理特征預(yù)估，從而制訂最科學(xué)的個(gè)體化培養(yǎng)計(jì)劃，提高教育培養(yǎng)成功率。
【專利說(shuō)明】-種人生理特征基因芯片

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及體外診斷技術(shù)和檢測(cè)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種基因芯片，以及包括該 芯片的檢測(cè)人生理特征相關(guān)基因各基因型的寡核苷酸芯片套組和方法。
[0002] 背景
[0003] 通過(guò)比較同卵雙生和異卵雙生孿生子的群體遺傳學(xué)研究表明，人體的生長(zhǎng)發(fā)育以 及大腦各部分功能的發(fā)展與完善受到遺傳因素和環(huán)境因素的影響和制約，其中大約40-50% 受遺傳因素的影響。由于遺傳因素目前人們無(wú)法掌控，而環(huán)境因素卻是人們可以創(chuàng)造和調(diào) 節(jié)，因此可根據(jù)兒童本身的遺傳因素，為其創(chuàng)設(shè)量身定做的外部環(huán)境(包括自然和社會(huì)環(huán) 境)，強(qiáng)化優(yōu)勢(shì)天賦，消除潛在的不良人格，因材施教，進(jìn)行個(gè)性化教育培養(yǎng)。
[0004] 三維人格問(wèn)卷將人格分為三個(gè)相互獨(dú)立的維度，即獵奇性（Novelty-Seeking, NS)、躲避傷害性（Harm-Avoidance，HA)和獎(jiǎng)賞依賴性（Reward-Dependence，RD)，分別與多 巴胺（DA)神經(jīng)遞質(zhì)、5-羥色胺（5-HT)神經(jīng)遞質(zhì)和去甲腎上腺素（NA)神經(jīng)遞質(zhì)有關(guān)。多巴 胺主要與大腦的情欲和感覺(jué)有關(guān)，傳遞興奮及快樂(lè)的信息，也與上癮有關(guān)。腦部多巴胺含量 多，人會(huì)變得極富好奇心，愛(ài)冒險(xiǎn)，積極進(jìn)取。愛(ài)情其實(shí)就是腦里產(chǎn)生大量多巴胺作用的結(jié) 果。所以，吸煙和吸毒都可以增加多巴胺的分泌，使上癮者感到開(kāi)心及興奮。若多巴胺較少 時(shí)，便會(huì)導(dǎo)致優(yōu)柔寡斷而冷漠的個(gè)性，缺乏啟動(dòng)力和積極性。5-羥色胺可以直接影響人的心 理功能和生理功能，比如人的喜怒哀樂(lè)、睡眠、食欲等。血液中5-羥色胺水平低，兒茶酚胺 濃度較高的人脾氣容易急躁，性格比常人剛強(qiáng)、倔犟，遇事好沖動(dòng)。反之，血液中5-羥色胺 濃度較高，兒茶酚胺濃度偏低的人性情比常人溫和，遇事較冷靜，不易產(chǎn)生急躁情緒。與這 些神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)基因的遺傳變異在不同程度上影響了個(gè)體的人格。大腦是一切心理活動(dòng)的 物質(zhì)基礎(chǔ)，大腦結(jié)構(gòu)發(fā)育差異不僅影響個(gè)體的智商，同時(shí)也影響個(gè)體的人格。如BDNF基因 參與與大腦海馬發(fā)育，低BDNF活性的個(gè)體比正常人的大腦海馬的體積要小11%，從而影響 部分記憶功能，并與焦慮、抑郁等相關(guān)。不良性格的人在人際交往、社會(huì)支持度和事業(yè)等方 面，相對(duì)不易獲得成功，嚴(yán)重者甚至存在嚴(yán)重的心理障礙、自殺等精神疾病，關(guān)系到社會(huì)的 穩(wěn)定。另一方面，個(gè)體運(yùn)動(dòng)能力等也受到遺傳因素影響。
[0005] 在兒童教育培養(yǎng)上，年紀(jì)越小可塑性越強(qiáng)，良好的人格越容易培養(yǎng)。利用人類行為 遺傳學(xué)的研究進(jìn)展，通過(guò)檢測(cè)生物學(xué)性狀相關(guān)基因，即可判斷兒童最初的潛能，以正確的 撫養(yǎng)方式對(duì)孩子的先天弱點(diǎn)進(jìn)行"基因治療"，對(duì)孩子的先天優(yōu)點(diǎn)進(jìn)行強(qiáng)化。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 1.發(fā)明目的：
[0007] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種人生物學(xué)性狀基因檢測(cè)芯片，能有效地檢測(cè) 生物學(xué)性狀相關(guān)基因的多態(tài)性，從而使家長(zhǎng)、教師及心理醫(yī)生能及時(shí)了解孩子性格、情感、 智商、音樂(lè)、運(yùn)動(dòng)和體質(zhì)等相關(guān)遺傳信息，預(yù)測(cè)兒童最初的性格和潛能，并根據(jù)兒童所具有 的遺傳特性，創(chuàng)造合適的生活環(huán)境，制定針對(duì)性的教育計(jì)劃，制定合理的個(gè)性化培養(yǎng)方案， 充分發(fā)揮兒童的優(yōu)勢(shì)天賦，取長(zhǎng)補(bǔ)短，因材施教，培養(yǎng)兒童健康成長(zhǎng)。為此，本發(fā)明還要提供 應(yīng)用該芯片檢測(cè)人生物學(xué)性狀相關(guān)基因多態(tài)性的方法。
[0008] 為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0009] 在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種人生物學(xué)性狀遺傳學(xué)檢測(cè)芯片，包括固相載體 和探針，所述探針與待測(cè)的人生物學(xué)性狀遺傳學(xué)相關(guān)基因的核苷酸序列和/或其互補(bǔ)序列 進(jìn)行雜交。
[0010] 本發(fā)明中所述固相載體可選用領(lǐng)域周知的載體，只要所述載體與所述反應(yīng)物相 容，不會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果就可以。優(yōu)選的，本發(fā)明所述固相載體選材為玻片、硅片、硝酸纖維素 膜、尼龍膜和高分子材料中的一種或它們的任意組合。
[0011] 所述待測(cè)人生物學(xué)性狀遺傳學(xué)相關(guān)多態(tài)性包括rs2770296、rs2350780、 rs2061174、rs4680、rsl042713、rs2242446、rsl799971、rs6265、rsl3212041、rs429358、 MAOA G941T、rsl800955、rsl815739、rs671、rsl695、rs7412、rs2143340、rs363449 和 MSTN C66493737T。
[0012] 所述探針可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合體、PNA或其衍生物。所述探針的長(zhǎng)度沒(méi) 有限制，只要能完成與目的核苷酸序列特異性結(jié)合。由于不同的探針長(zhǎng)度對(duì)雜交效率、信號(hào) 特異性有不同的影響，所述探針的長(zhǎng)度通常至少是14個(gè)堿基對(duì)，最長(zhǎng)一般不超過(guò)30個(gè)堿基 對(duì)，與目的核苷酸序列互補(bǔ)的長(zhǎng)度以15-25個(gè)堿基對(duì)之間的為最佳。所述探針的自身互補(bǔ) 序列最好少于6個(gè)堿基對(duì)，以免影響雜交效率。
[0013] 本發(fā)明檢測(cè)芯片的探針為DNA，包括：⑴與待測(cè)rs2770296雜交的（a)SEQ ID N0:l?SEQIDN0:2所示序列，（b)SEQIDN0:l?SEQIDN0:2所示序列中每條序列的 互補(bǔ)鏈，（c)與SEQ ID NO: 1?SEQ ID NO: 2所示的序列中每條序列有至少70%同源性的 序列；
[0014] (2)與待測(cè)rs2350780 雜交的（a)SEQIDN0:3?SEQIDN0:4所示序列，（b)SEQ ID N0:3?SEQ ID N0:4所示序列中每條序列的互補(bǔ)鏈，（c)與SEQ ID N0:3?SEQ ID N0:4所示的序列中每條序列有至少70%同源性的序列；
[0015] (3)與待測(cè) rs2061174 雜交的（a)SEQ ID N0:5 ?SEQ ID N0:6 所示序列，（b) SEQ ID N0:5?SEQ ID N0:6所示序列中每條序列的互補(bǔ)鏈，（c)與SEQ ID N0:5?SEQ ID N0:6所示的序列中每條序列有至少70%同源性的序列；
[0016] ⑷與待測(cè)rs4680 雜交的（a)SEQIDN0:7?SEQIDN0:8所示序列，（b)SEQID N0:7?SEQ ID N0:8所示序列中每條序列的互補(bǔ)鏈，（c)與SEQ ID N0:7?SEQ ID N0:8 所示的序列中每條序列有至少70%同源性的序列；
[0017] (5)與待測(cè) rsl042713 雜交的（a)SEQ ID N0:9 ?SEQ ID N0:10 所示序列，（b) SEQ ID N0:9?SEQ ID NO: 10所示序列中每條序列的互補(bǔ)鏈，（c)與SEQ ID N0:9?SEQ ID NO: 10所示的序列中每條序列有至少70%同源性的序列；
[0018] (6)與待測(cè)rs224244 6 雜交的（a)SEQIDN0:ll?SEQIDN0:12所示序列，（b) SEQ ID N0:11?SEQ ID N0:12所示序列中每條序列的互補(bǔ)鏈，（c)與SEQ ID N0:11?SEQ ID NO: 12所示的序列中每條序列有至少70%同源性的序列；
[0019] (7)與待測(cè)rsl799971 雜交的（a)SEQIDN0:13?SEQIDN0:14所示序列，（b) SEQ ID N0:13?SEQ ID N0:14所示序列中每條序列的互補(bǔ)鏈，（c)與SEQ ID N0:13?SEQ ID NO: 14所示的序列中每條序列有至少70%同源性的序列；
[0020] (8)與待測(cè)rs6265 雜交的（a)SEQIDN0:15?SEQIDN0:16所示序列，（b)SEQ ID NO: 15?SEQ ID NO: 16所示序列中每條序列的互補(bǔ)鏈，（c)與SEQ ID NO: 15?SEQ ID NO: 16所示的序列中每條序列有至少70%同源性的序列；
[0021] (9)與待測(cè)rsl3212041 雜交的（a)SEQIDN0:17?SEQIDN0:18所示序列，（b) SEQ ID N0:17?SEQ ID N0:18所示序列中每條序列的互補(bǔ)鏈，（c)與SEQ ID N0:17?SEQ ID NO: 18所示的序列中每條序列有至少70%同源性的序列；
[0022] (10)與待測(cè) rs429358 雜交的（a)SEQ ID N0:19 ?SEQ ID N0:20 所示序列，（b) SEQ ID N0:19?SEQ ID N0:20所示序列中每條序列的互補(bǔ)鏈，（c)與SEQ ID N0:19?SEQ ID N0:20所示的序列中每條序列有至少70%同源性的序列；
[0023] (11)與待測(cè) ΜΑ0Α G941T 雜交的（a)SEQ ID N0:21 ?SEQ ID N0:22 所示序列， (b)SEQ ID N0:21?SEQ ID N0:22所示序列中每條序列的互補(bǔ)鏈，（c)與SEQ ID N0:21? SEQ ID N0:22所示的序列中每條序列有至少70%同源性的序列。
[0024] (12)與待測(cè)rsl800955 雜交的（a)SEQIDN0:23?SEQIDN0:24所示序列，（b) SEQ ID N0:23?SEQ ID N0:24所示序列中每條序列的互補(bǔ)鏈，（c)與SEQ ID N0:23? SEQ ID N0:24所示的序列中每條序列有至少70%同源性的序列。
[0025] (13)與待測(cè)rsl815739 雜交的（a)SEQIDN0:25?SEQIDN0:26所示序列，（b) SEQ ID N0:25?SEQ ID N0:26所示序列中每條序列的互補(bǔ)鏈，（c)與SEQ ID N0:25?SEQ ID N0:26所示的序列中每條序列有至少70%同源性的序列。
[0026] (14)與待測(cè) rs671 雜交的（a)SEQ ID N0:27 ?SEQ ID N0:28 所示序列，（b)SEQ ID NO: 27?SEQ ID NO: 28所示序列中每條序列的互補(bǔ)鏈，（c)與SEQ ID NO: 27?SEQ ID N0:28所示的序列中每條序列有至少70%同源性的序列。
[0027] (15)與待測(cè)rsl695 雜交的（a)SEQIDN0:29?SEQIDN0:30所示序列，（b)SEQ ID N0:29?SEQ ID N0:30所示序列中每條序列的互補(bǔ)鏈，（c)與SEQ ID N0:29?SEQ ID N0:30所示的序列中每條序列有至少70%同源性的序列。
[0028] (16)與待測(cè)rs7412雜交的（a)SEQIDN0:31?SEQIDN0:32所示序列，（b)SEQ ID N0:31?SEQ ID N0:32所示序列中每條序列的互補(bǔ)鏈，（c)與SEQ ID N0:31?SEQ ID N0:32所示的序列中每條序列有至少70%同源性的序列。
[0029] (17)與待測(cè)rs2143340 雜交的（a)SEQIDN0:33?SEQIDN0:34所示序列，（b) SEQ ID N0:33?SEQ ID N0:34所示序列中每條序列的互補(bǔ)鏈，（c)與SEQ ID N0:33?SEQ ID N0:34所示的序列中每條序列有至少70%同源性的序列。
[0030] (18)與待測(cè) rs363449 雜交的（a)SEQ ID N0:35 ?SEQ ID N0:36 所示序列，（b) SEQ ID N0:35?SEQ ID N0:36所示序列中每條序列的互補(bǔ)鏈，（c)與SEQ ID N0:35?SEQ ID N0:36所示的序列中每條序列有至少70%同源性的序列。
[0031] (19)與待測(cè) MSTN C66493737T 雜交的（a)SEQ ID N0:37 ?SEQ ID N0:38 所示 序列，（b) SEQ ID NO: 37?SEQ ID NO: 38所示序列中每條序列的互補(bǔ)鏈，（c)與SEQ ID N0:37?SEQ ID N0:38所示的序列中每條序列有至少70%同源性的序列。
[0032] 優(yōu)選的，本發(fā)明檢測(cè)芯片的探針選自SEQ ID N0:1?SEQ ID N0:38所示序列。
[0033] 所述探針序列可包含1?10個(gè)錯(cuò)配堿基，較佳地，可包含1?5個(gè)錯(cuò)配堿基，更佳 地，可包含1?2個(gè)錯(cuò)配堿基。
[0034] 本發(fā)明檢測(cè)芯片還包括至少一種對(duì)照探針，所述對(duì)照探針選自：陰性對(duì)照探針、 陽(yáng)性對(duì)照探針、雜交對(duì)照探針和固定化對(duì)照探針。
[0035] 所述探針可通過(guò)連接臂固定于固相載體上。連接臂可以為探針形成雙鏈的部分提 供一個(gè)自由的空間以減少空間位阻，有助于雜交反應(yīng)的進(jìn)行[AfanassievV, HanemannV, Wolf1 S. Preparation of DNA and protein micro arrays on glass slides coated with an agarose film. Nucleic Acids Res. 2000， 28: e66; USA Patent No. 5556752]。連 接臂越長(zhǎng)，雜交效率越高。典型的連接臂包括15?30個(gè)功能基團(tuán)長(zhǎng)度。連接臂可以選用 適當(dāng)形式的功能基團(tuán)，如Poly T (A、C或G)、C原子或聚乙烯乙二醇與Poly T (A、C或G) 的嵌合體、聚乙醇、聚酷、聚氨、聚硫酸酷和其組合物。
[0036] 所述探針或連接臂通過(guò)連接分子固定于固相載體上。探針固定到載體上可以通過(guò) C-C鍵實(shí)現(xiàn)，例如，聚三氟氯乙烯表面；或更好的用硅氧烷鍵(玻璃或二氧化硅作支持物時(shí) 使用）。娃氧燒鍵鍵合可以通過(guò)支持物和連接分子的二氣甲娃燒基或二燒氧基甲娃燒基等 基團(tuán)反應(yīng)完成。氣基燒基娃燒、輕基燒基娃燒、2 -輕乙基一氣丙基二乙氧基娃燒、輕乙基 一氨丙基三乙氧基硅烷或輕丙基三乙氧基硅烷都是很有用的表面吸附基團(tuán)。
[0037] 所述探針可以被修飾，修飾方法可以是5' -NH2修飾、5' -SH修飾、5' -Poly T (A、 C或G)修飾、5' -生物素修飾、3' -NH2修飾、3' -SH修飾、3' -Poly T (A、C或G)修飾和 3' -生物素修飾等。
[0038] 所述探針可以有一條或幾條，甚至全部都是經(jīng)過(guò)標(biāo)記的，所述標(biāo)記包括熒光素標(biāo) 記、生物素標(biāo)記、放射性元素標(biāo)記、酶標(biāo)記和熒光共振能量轉(zhuǎn)移標(biāo)記。
[0039] 在本發(fā)明的另一方面，提供了一種應(yīng)用上述芯片對(duì)人生物學(xué)性狀進(jìn)行遺傳學(xué)檢測(cè) 的方法，包括如下步驟：
[0040] (1)在固相載體表面點(diǎn)載與待測(cè)人生物學(xué)性狀相關(guān)基因多態(tài)性的核苷酸序列和/ 或其互補(bǔ)序列進(jìn)行雜交的探針；
[0041] (2)抽提待測(cè)樣品的核酸；
[0042] (3)制備待測(cè)人生物學(xué)性狀相關(guān)基因的目的核苷酸序列；
[0043] (4)標(biāo)記步驟⑶的目的核苷酸序列；
[0044] (5)在適于與步驟（1)所述的點(diǎn)載在固相載體上的探針進(jìn)行雜交的條件下，加入 經(jīng)標(biāo)記的目的核苷酸序列，并使其反應(yīng)足夠時(shí)間；
[0045] (6)檢測(cè)雜交反應(yīng)的結(jié)果。
[0046] (7)將步驟（6)中的基因分型結(jié)果導(dǎo)入人生物學(xué)性狀分析軟件進(jìn)行受檢者生物學(xué) 性狀分析。
[0047] 在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種應(yīng)用上述芯片對(duì)人生物學(xué)性狀進(jìn)行基因多態(tài) 性檢測(cè)的方法，包括如下步驟：
[0048] (1)標(biāo)記與待測(cè)生物學(xué)性狀相關(guān)基因多態(tài)性的核苷酸序列和/或其互補(bǔ)序列進(jìn)行 雜交的探針；
[0049] (2)抽提待測(cè)樣品的核酸；
[0050] (3)制備待測(cè)生物學(xué)性狀相關(guān)基因多態(tài)性的目的核苷酸序列；
[0051] (4)在固相載體表面點(diǎn)載步驟（3)所述的目的核苷酸序列；
[0052] (5)在適于與步驟（4)所述的點(diǎn)載在固相載體上的目的核苷酸序列進(jìn)行雜交的條 件下，加入經(jīng)標(biāo)記的探針，并使其反應(yīng)足夠時(shí)間；
[0053] (6)檢測(cè)雜交反應(yīng)的結(jié)果。
[0054] (7)將步驟（6)中的基因分型結(jié)果導(dǎo)入人生物學(xué)性狀分析軟件進(jìn)行受檢者生物學(xué) 性狀分析。
[0055] 所述目的核苷酸序列的制備可包括擴(kuò)增的步驟，用分離的靶樣本中含核酸的細(xì)胞 直接擴(kuò)增，也可用抽提的靶核酸直接擴(kuò)增。如用磁珠從全血中分離白細(xì)胞，直接用分離的白 細(xì)胞或用全血抽提的核酸作模板，擴(kuò)增目的核酸序列。擴(kuò)增得到的單鏈或雙鏈的DNA或RNA 可含有熒光或生物素標(biāo)記，標(biāo)記的DNA或RNA可不經(jīng)純化直接用于雜交。與本發(fā)明中所述 芯片雜交的優(yōu)選靶核苷酸分子是單鏈核酸分子，雙鏈核酸分子經(jīng)過(guò)變性等處理后也于本發(fā) 明所述芯片雜交。
[0056] 目的核苷酸序列可使用任何適當(dāng)?shù)臄U(kuò)增方法進(jìn)行富集，如：聚合酶鏈反應(yīng) (polymerase chain reaction, PCR),多重 PCR,連接酶鏈反應(yīng)（ligase chain reaction, LCR)，滾環(huán)擴(kuò)增（rolling cycle amplification，RCA)，基于核酸序列的擴(kuò)增（nucleic acid sequence-based amplification, NASBA),鏈置換擴(kuò)增（strand displacement amplification, SDA)和轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增（transcription medicated amplification, TMA) 等。
[0057] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，目的核苷酸序列的制備采用PCR擴(kuò)增方法，該方法所 用引物含有SEQ ID N0:39?SEQ ID N0:78所示序列的核苷酸鏈或其互補(bǔ)鏈。
[0058] 所述探針或目的核苷酸序列都適合用于標(biāo)記。探針在合成引入標(biāo)記，目的核苷酸 序列可以在擴(kuò)增中引入標(biāo)記，或者擴(kuò)增后用合適的方法引入標(biāo)記。
[0059] 合適的標(biāo)記包括熒光標(biāo)記、放射性同位素標(biāo)記、發(fā)色團(tuán)、發(fā)光體、FRET、酶、生物素 或有特殊結(jié)合配體的配基。
[0060] 本發(fā)明方法的雜交可在任何適當(dāng)?shù)臏囟认逻M(jìn)行，如25°C?65°C，所述雜交時(shí)間為 2分鐘?18小時(shí)。可以改變雜交條件以提高或降低雜交的嚴(yán)謹(jǐn)程度、雜交特異性。
[0061] 本發(fā)明生物學(xué)性狀基因芯片及其檢測(cè)套組和方法，使家長(zhǎng)、教師及心理醫(yī)生及時(shí) 掌握兒童大量遺傳信息，從而可以結(jié)合兒童實(shí)際情況，制定個(gè)體化的教育培養(yǎng)方案，充分發(fā) 揮兒童的優(yōu)勢(shì)天賦，取長(zhǎng)補(bǔ)短，因材施教，培養(yǎng)兒童健康成長(zhǎng)。同時(shí)對(duì)于心理疾病患者，也可 為臨床心理醫(yī)生提供用藥參考。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0062] 圖1是本發(fā)明的實(shí)施例1中多重PCR擴(kuò)增后的電泳檢測(cè)結(jié)果圖；
[0063] 圖2是本發(fā)明的實(shí)施例1中PCR產(chǎn)物片段化后的電泳檢測(cè)結(jié)果圖；
[0064] 圖3是本發(fā)明實(shí)施例1的人生物學(xué)性狀遺傳學(xué)檢測(cè)芯片的雜交結(jié)果圖； 圖4是本發(fā)明實(shí)施例1的電泳檢測(cè)基因缺失結(jié)果圖。

【具體實(shí)施方式】
[0065] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。
[0066] 實(shí)施例1反向雜交
[0067] 1.基因芯片的制備
[0068] (1)探針溶解
[0069] 將SEQ ID NO: 1?SEQ ID NO: 38所示序列探針的每條探針用TE溶液稀釋，終濃 度為10 mM。將濃度為10 mM的探針與濃度為200 mM的PBS溶液于384孔板中等體積混 合，以粘膠片封好384孔板，室溫下振蕩2分鐘，離心，-20°C保存，以備點(diǎn)樣使用。
[0070] ⑵點(diǎn)樣
[0071] 將預(yù)先設(shè)計(jì)并合成好的探針通過(guò)接觸式點(diǎn)樣或噴墨式點(diǎn)樣點(diǎn)載到玻片、硅片等材 質(zhì)的固相載體片基上。片基米用Cell Associates CSS-100醒基片基，GeneMachine公司 的Ominigrid 100型號(hào)的點(diǎn)樣儀，在濕度：65 - 75%(以FullMoon片基為準(zhǔn))，溫度為25°C 的條件下點(diǎn)樣，點(diǎn)樣完畢后，放置半小時(shí)后，將芯片取出，室溫干燥保存。
[0072] 2.待測(cè)樣品的處理和標(biāo)記
[0073] (1)人基因組DNA抽提及目的基因的擴(kuò)增
[0074] 采用 FlexiGene DNA Kit (250) (QIAGEN，Cat. No. 51206)試劑盒抽提人外周 血中基因組DNA。取lul進(jìn)行電泳（1%瓊脂糖凝膠，0. 5XTBE，EB，80MV，1. 5小時(shí)電泳)，在 FR-200紫外與可見(jiàn)分析裝置上拍攝照片，并對(duì)照marker (Lambda DNA/EcoRI+HindIII)進(jìn) 行定量。
[0075] 用 rs2770296 的引物（SEQ ID N0:39、40)、rs2350780 的引物（SEQ ID N0:41、 42)、rs2061174 的引物（SEQ ID N0:43、44)、rs4680 的引物（SEQ ID N0:45、46)、rsl042713 的引物（SEQ ID N0:47 ?48)、rs2242446 的引物（SEQ ID N0:49、50)、rsl799971 的引 物（SEQ ID N0:51、52)、rs6265 的引物（SEQ ID N0:53、54)、rsl3212041 的引物（SEQ ID N0:55、56)、rs429358 的引物（SEQIDN0:57、58)、MA0AG941T的引物（SEQIDN0:59、 60)、rsl800955 的引物（SEQ ID N0:61、62)、rsl815739 的引物（SEQ ID N0:63、64)、rs671 的引物（SEQ ID N0:65、66)、rsl695 的引物（SEQ ID N0:67、68)、rs7412 的引物（SEQ ID N0:69、70)、rs2143340 的引物（SEQ ID N0:71、72)、rs363449 的引物（SEQ ID N0:73、74) 和MSTN C66493737T的引物（SEQ ID N0:75?76)進(jìn)行目的核苷酸序列的擴(kuò)增。PCR擴(kuò) 增用30 μ?反應(yīng)體系進(jìn)行，反應(yīng)體系是0. 3 mM dNTP、10 mM Tris-HCl、50 mM KC1、2 mM MgC12、20% Q solution (Qiagen)、上游和下游引物的濃度 0.16 μΜ、基因組 DNA 10ng，Taq 酶 0.6 U (Takara)。應(yīng)用 Touch-down PCR 反應(yīng)程序[Don RH, Cox PT, Wainwright BJ, Baker K, Mattick JS. 'Touchdown' PCR to circumvent spurious priming during gene amplification. Nucleic Acids Res. 1991，19: 4008] :94°C變性5 min ;94°C變性40 s， 64°C退火1 min，每個(gè)循環(huán)降低0. 5°C，72°C延伸50 s，共10個(gè)循環(huán)；然后94°C變性40 s， 59°〇退火4〇8,721：延伸5〇8，共30個(gè)循環(huán)；最后721：延伸5 1^11。？0?結(jié)束后用1.5% 瓊脂糖凝膠檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。
[0076] 當(dāng)進(jìn)行多重PCR反應(yīng)時(shí)，將SEQ ID N0:39?SEQ ID N0:78所示序列的引物放入 一個(gè)反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，體系為5〇μ1。多重PCR的反應(yīng)體系為：每種dNTP 0. 3 Mmol/L， Tricine-KOH (PH8. 7)40 mmol/L, KC1 16 mmol/L, MgCl23. 5 mmol/L, BSA 3.75 μδ/πι1, 每條引物 2Mmol/L，DNA 80ng 和 2.2X Titanium Taq DNA 聚合酶（Clontech，USA)。多重 PCR反應(yīng)條件：95°C變性3 min;95°C變性30s，66°C退火2 min，68°C延伸4 min，共40個(gè) 循環(huán)；最后68°C延長(zhǎng)10 min。PCR擴(kuò)增后，取3 μ? PCR反應(yīng)產(chǎn)物做瓊脂糖凝膠電泳，電泳 結(jié)果見(jiàn)圖1。這些PCR產(chǎn)物經(jīng)處理后可用于下面的雜交步驟。
[0077] (2) PCR產(chǎn)物純化和片段化
[0078] 每個(gè)樣品的所有 PCR 產(chǎn)物混合，用 QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen， Cat. No. 28106)純化。純化的PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)定濃度后，用DNase I進(jìn)行片段化。片段化的 反應(yīng)體系包括：30 μ?純化PCR產(chǎn)物（10 Pg)，4 μ?的10X DNase I緩沖液，0. 12 μ?的 DNase Ι，5. 88 μ?的ddH20。反應(yīng)條件為37°C溫浴5 min，然后95°C 15 min。片段化后的 產(chǎn)物跑4%瓊脂糖凝膠，保證絕大多數(shù)的片段處于30-200個(gè)堿基對(duì)，電泳檢測(cè)結(jié)果如圖2所 /_J、1 〇
[0079] (3)熒光素標(biāo)記
[0080] 利用脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶在3'末端進(jìn)行熒光素標(biāo)記，標(biāo)記的40 μ?反應(yīng)體系包括： 25 μ?片段化PCR產(chǎn)物，8 μ?的5Χ脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶緩沖液，1 μ?的CY3-N6_ddCTP (1 mM)，3 μ?的脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（20 υ/μ1)，3 μ?的ddH20。反應(yīng)條件為37°C溫浴120min，然 后 95°C加熱 15min。
[0081] 3.雜交、洗滌和結(jié)果檢測(cè)
[0082] 熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物95°C變性10 min，立即置于冰上，用于雜交，雜交反應(yīng)20 μ? 體系包括：熒光素標(biāo)記的 PCR 產(chǎn)物 15 μ1，20Χ SSPE 1.2 μ1，1% Triton 0.2 μ?，10Χ Denhandts 0.9 μ?，甲酰胺 0.5 μ?，ddH20 2.2 μ?。反應(yīng)條件為 48°C溫浴 120 min，然后相 繼用 IX 洗滌緩沖液 I (5X SSC，0. 1% SDS)、1X 洗滌緩沖液II (2X SSC，0. 1% SDS)和 IX 洗滌緩沖液IIK1X SSC)在42°C各洗滌10 min，最后用ddH20洗滌0. 5 min。
[0083] 洗滌后的芯片，經(jīng)甩干后，用GenePix 4000B共聚焦激光掃描儀進(jìn)行掃描(也可以 用其他的激光掃描儀)。掃描雜交后的芯片得到的雜交結(jié)果如圖3所示，再用GenePix Pro 處理圖像得到數(shù)據(jù)文件，然后對(duì)數(shù)據(jù)文件利用人生物學(xué)性狀評(píng)估軟件(上海芯超生物科技 有限公司）進(jìn)行處理就可以得到受檢者生物學(xué)性狀的結(jié)果，從而指導(dǎo)家長(zhǎng)、教育學(xué)家或心理 醫(yī)生為制定個(gè)性化的教育方案或心理治療方案。
[0084] 實(shí)施例2正向雜交
[0085] 1.人生物學(xué)性狀相關(guān)基因多態(tài)性的擴(kuò)增和芯片制備
[0086] 用 rs2770296 的引物（SEQ ID N0:39、40)、rs2350780 的引物（SEQ ID N0:41、 42)、rs2061174 的引物（SEQ ID N0:43、44)、rs4680 的引物（SEQ ID N0:45、46)、rsl042713 的引物（SEQ ID N0:47 ?48)、rs2242446 的引物（SEQ ID N0:49、50)、rsl799971 的引 物（SEQ ID N0:51、52)、rs6265 的引物（SEQ ID N0:53、54)、rsl3212041 的引物（SEQ ID N0:55、56)、rs429358 的引物（SEQ ID N0:57、58)、MA0A G941T 的引物（SEQ ID N0:59、60)、 rsl800955 的引物（SEQ ID N0:61、62)、rsl815739 的引物（SEQ ID N0:63、64)、rs671 的引 物（SEQ ID N0:65、66)、rsl695 的引物（SEQ ID N0:67、68)、rs7412 的引物（SEQ ID N0:69、 70)、rs2143340 的引物（SEQIDN0:71、72)、rs363449 的引物（SEQIDN0:73、74)和MSTN C66493737T的引物（SEQ ID N0:75?76)擴(kuò)增基因。PCR擴(kuò)增用100 μ?反應(yīng)體系進(jìn)行，反應(yīng) 體系是 0.3 mM dNTP，10 mM Tris-HCl，50 mM KC1，2 mM MgCl2,20% Q solution(Qiagen)， 0.01 μΜ SHV_F，0.2 μΜ SHV_R，100 ng 基因組 DNA，3 U Ex Taq 酶（Takara)。循環(huán)參數(shù)： 94°C變性5 min;94°C變性40 s，65°C退火1 min，72°C延伸1 min，共40個(gè)循環(huán)；最后72°C 延伸 5 min。PCR 產(chǎn)物用 QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen，Cat. No. 28106)純 化。將純化的PCR產(chǎn)物濃度調(diào)整至400 ng/μ?。
[0087] 將濃度為400 ng/μ?的PCR產(chǎn)物與100%的DMS0于384孔板中等體積混合，以粘膠 片封好384孔板，室溫下振蕩2分鐘，離心。將200 ng/μ?的PCR產(chǎn)物通過(guò)接觸式點(diǎn)樣或噴 墨式點(diǎn)樣點(diǎn)載到玻片、娃片等材質(zhì)的固相載體片基上。采用GeneMachine公司的Ominigrid 100型號(hào)的點(diǎn)樣儀，在濕度：65 - 75%(以FullMoon片基為準(zhǔn))，溫度為25°C的條件下點(diǎn)樣， 點(diǎn)樣完畢放置半小時(shí)后，將芯片放于飽和食鹽水盒中，37°C水化過(guò)夜，次日取出，600 mj交 聯(lián)，交聯(lián)完畢之芯片即可使用。
[0088] 2.芯片雜交
[0089] 雜交反應(yīng)體系包括：2 nM熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針（SEQ ID N0:1?SEQ ID Ν0:54)，1·2 μ? 20X SSPE，0.2 μ? 1% Triton，0.9 μ? 10X Denhandts，0.5 μ? 甲酰胺， 2. 2 μ? ddH 20。反應(yīng)條件為50°C溫浴2小時(shí)，然后相繼用IX洗滌緩沖液I (5Χ SSC，0. 1% 305)、1\洗滌緩沖液11(2乂55(：，0.1%505)和1\洗滌緩沖液111(1\35〇在421：各洗 漆10 min,最后用ddH20洗漆10秒。洗漆后的芯片，經(jīng)甩干后，用GenePix 4000B共聚焦 激光掃描儀進(jìn)行掃描(也可以用其他的激光掃描儀)。
[0090] 實(shí)施例3 :受檢者生物學(xué)性狀評(píng)估
[0091] 樣本：受檢者(女,4歲）
[0092] 按照實(shí)施例1的檢測(cè)操作流程進(jìn)行檢測(cè)，其中，該受檢者目的基因多重PCR擴(kuò)增后 的電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1，PCR產(chǎn)物片段化后的電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2,檢測(cè)芯片雜交結(jié)果見(jiàn)圖 3, 電泳檢測(cè)基因缺失結(jié)果見(jiàn)圖4。將所得檢測(cè)結(jié)果導(dǎo)入人生物學(xué)性狀評(píng)估軟件，得到本實(shí)施 例中的受檢者的性格為A、情感為D、智商為B、閱讀為A、數(shù)學(xué)為C、飲酒為A、成癮性為B、運(yùn) 動(dòng)為C、體質(zhì)為B。

【權(quán)利要求】
1. 一種人生理特征基因芯片，包括步驟： 1) 提取受:檢者樣本DNA ; 2) 對(duì)樣本DNA進(jìn)行目的基因 SNP的PCR擴(kuò)增、純化、片段化及熒光素標(biāo)記，所述目的基 因 SNP 包括 rs2770296、rs2350780、rs2061174、rs4680、rsl042713、rs2242446、rsl799971、 rs6265、rsl3212041、rs429358、MAOA G941T、rsl800955、rsl815739、rs671、rsl695、 rs7412、rs2143340、rs363449 和 MSTN C66493737T ; 3) 熒光素標(biāo)記的PCR產(chǎn)物進(jìn)行基因芯片雜交，檢測(cè)目的基因的SNP位點(diǎn)； 4) 根據(jù)步驟3)得到的基因分型結(jié)果，評(píng)估受檢者的生物學(xué)性狀。
2. 如權(quán)利要求1所述的人生物學(xué)性狀基因芯片及其檢測(cè)套組和方法，其特征在于：所 述步驟2)中的rs2770296 的引物是SEQIDN0:39?40所示序列的引物，rs2350780 的引 物是SEQ ID N0:41?42所示序列的引物，rs2061174的引物是SEQ ID N0:43?44所示序 列的引物，rs4680 的引物是SEQIDN0:45?46所示序列的引物，rsl042713 的引物是SEQ ID N0:47?48所示序列的引物，rs2242446的引物是SEQ ID N0:49?50所示序列的引物， rsl799971的引物是SEQ ID NO:51?52所示序列的引物，rs6265的引物是SEQ ID NO:53?54 所示序列的引物，rsl3212041 的引物是SEQIDN0:55?56所示序列的引物，rs429358 的引 物是SEQ ID NO:57?58所示序列的引物，MAOA G941T的引物是SEQ ID NO:59?60所示序列 的引物，rsl800955的引物是SEQ ID N0:61?62所示序列的引物，rsl815739的引物是SEQ ID N0:63?64所示序列的引物，rs671的引物是SEQ ID N0:65?66所示序列的引物，rsl695 的引物是SEQ ID N0:67?68所示序列的引物，rs7412的引物是SEQ ID N0:69?70所示序列 的引物，rs2143340的引物是SEQIDN0:71?72所示序列的引物，rs363449 的引物是SEQID N0:73?74)和MSTNC66493737T的引物是SEQIDN0:75?76所示序列的引物。
3. 如權(quán)利要求1所述的人生物學(xué)性狀基因芯片及其檢測(cè)套組和方法，其特征在于：所 述步驟2)中的片段化是將純化的PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)定濃度后，用DNase I進(jìn)行片段化； 所述熒光素標(biāo)記是將片段化PCR產(chǎn)物利用脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶在3'末端進(jìn)行熒光素標(biāo) 記。
4. 如權(quán)利要求1所述的人生物學(xué)性狀基因芯片及其檢測(cè)套組和方法，其特征在于：所 述步驟3)基因芯片的制備是將預(yù)先設(shè)計(jì)并合成好的探針通過(guò)接觸式點(diǎn)樣或噴墨式點(diǎn)樣點(diǎn) 載到玻片或硅片材質(zhì)的固相載體片基上，其中，探針是SEQ ID N0:1?SEQ ID N0:38所示 序列的DNA探針。
5. 如權(quán)利要求1所述的人生物學(xué)性狀基因芯片及其檢測(cè)套組和方法，其特征在于：所 述步驟4)中的基因分型結(jié)果導(dǎo)入人生物學(xué)性狀評(píng)估軟件進(jìn)行受檢者生物學(xué)性狀評(píng)估。
6. 如權(quán)利要求1所述的人生物學(xué)性狀包括：性格、情感、智商、閱讀、數(shù)學(xué)、飲酒、成癮 性、運(yùn)動(dòng)和體質(zhì)。
【文檔編號(hào)】C40B40/06GK104109707SQ201210513259
【公開(kāi)日】2014年10月22日 申請(qǐng)日期:2013年4月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月22日
【發(fā)明者】郜恒駿, 張新, 盛海輝 申請(qǐng)人:泰州醫(yī)藥城博奧邦科生物科技有限公司