用于一體化檢測的基因芯片及在片擴(kuò)增方法
【專利摘要】用于一體化檢測的基因芯片及在片擴(kuò)增方法，按如下步驟：（1）在基片上固定特異性核酸引物；（2）將固定特異性核酸引物的基片置于擴(kuò)增管中；（3）將制備好的待檢測基因提取物、擴(kuò)增體系加入到擴(kuò)增管中；（4）將擴(kuò)增管置于基因擴(kuò)增儀中擴(kuò)增；（5）基因擴(kuò)增完成后，檢測基片上的熒光信號，從而獲得基因信息。本發(fā)明去除了通用的核酸雜交的步驟，極大地提高了效益，降低了成本；基片上固定特異性核酸引物，并置于擴(kuò)增管中進(jìn)行在片PCR，使各個PCR反應(yīng)能分開進(jìn)行，解決了多重PCR中引物互相干擾問題；實(shí)現(xiàn)一體化同時檢測多個基因信息，避免了擴(kuò)增、產(chǎn)物轉(zhuǎn)移過程中可能出現(xiàn)的污染；使用的儀器簡單且通用，普通PCR儀和熒光顯微鏡即可完成檢測。
【專利說明】用于一體化檢測的基因芯片及在片擴(kuò)增方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種在片PCR擴(kuò)增的基因芯片，可以用于一體化檢測基因信息，使得基因擴(kuò)增、檢測等相應(yīng)功能在同一個封閉空間內(nèi)即可完成，無需轉(zhuǎn)移操作。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，在分子生物學(xué)、基因檢測、疾病的檢測與診斷等各種涉及核酸分子的檢測及研究過程中，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction, PCR)都是不可或缺的技術(shù)之一。PCR的原理是DNA (脫氧核糖核酸，Deoxyribonucleic acid)的半保留復(fù)制,雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈，在DNA聚合酶的參與下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則復(fù)制成同樣的兩分子拷貝。DNA在高溫時也可以發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，加入設(shè)計引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。PCR反應(yīng)中有兩條引物，即5'端引物和3'引物，按實(shí)驗需要設(shè)計引物，以一條DNA單鏈為基準(zhǔn)(常以信息鏈為基準(zhǔn))，5,端引物與位于待擴(kuò)增片段5,端上的一小段DNA序列相同；3'端引物與位于待擴(kuò)增片段3'端的一小段DNA序列互補(bǔ)。PCR擴(kuò)增方法靈敏度極高，可以將原本濃度極低的待測基因擴(kuò)增到數(shù)萬至數(shù)百萬倍的濃度，其擴(kuò)增產(chǎn)物一般使用電泳的方法來檢測。
[0003]但是，該技術(shù)存在如下問題:首先，因為PCR擴(kuò)增的高靈敏度，在擴(kuò)增和轉(zhuǎn)移過程中很容易發(fā)生交叉污染，而且該污染很容易被放大，出現(xiàn)“假陽性”的現(xiàn)象，不僅影響對結(jié)果的判斷，還常常需要其他實(shí)驗加以驗證。其次，使用電泳來檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，需經(jīng)染色才能顯現(xiàn)帶型，最常用的是極毒的溴化乙錠(EB)染色法。另外，一次PCR反應(yīng)一般情況下只能檢測一個基因的信息。如果要檢測多個基因，即多重PCR，引物之間、引物與待測基因之間會產(chǎn)生干擾，很難實(shí)現(xiàn)在同一時間在一個反應(yīng)體系內(nèi)對多個基因的檢測，因此，還無法滿足人們對于多基因同時檢測的需求。
[0004]基因芯片(Genechip)又稱DNA芯片(DNA Chip),也稱為寡核苷酸陣列或雜交陣列分析，它是根據(jù)DNA雙螺旋原理而發(fā)展的核酸鏈間分子雜交的技術(shù)。它是在基片表面制備成千上萬的基因單元作為配基，對待測基因進(jìn)行篩選。基片是指玻璃，硅片，石英，金屬，高分子材料，塑料片、尼龍膜、硝酸纖維膜、多孔膜，凝膠這類固相基底材料，通過化學(xué)、物理方法對其進(jìn)行改性后可得到的具有功能性基團(tuán)的載體表面。待測基因通過PCR擴(kuò)增技術(shù)得到數(shù)量放大，再進(jìn)行熒光標(biāo)記，使其在篩選過程中產(chǎn)生可識別的熒光發(fā)射或光譜轉(zhuǎn)移。此熒光信號被檢測儀器檢出，達(dá)到基因識別的目的。將已知的DNA (探針)和未知的核酸序列之間的一方以有序的陣列固定到載玻片或娃片上，再與突光標(biāo)記的另一方進(jìn)行雜交。當(dāng)突光標(biāo)記的一方在DNA芯片上發(fā)現(xiàn)互補(bǔ)序列時即發(fā)生雜交，雜交的結(jié)果以熒光和模式識別分析來檢測。DNA芯片技術(shù)可以快速分析大量的基因信息，從而使生物醫(yī)學(xué)工作者可以研究并收集基因表達(dá)和變異信息。
[0005]基因芯片的出現(xiàn)，實(shí)現(xiàn)了同時檢測多個基因的想法，使得高通量檢測基因成為了可能。盡管利用基因芯片可以高通量地獲得基因的信息，同時檢測多個基因，但是其待測基因的擴(kuò)增、擴(kuò)增產(chǎn)物的轉(zhuǎn)移以及雜交都是在不同的體系中完成的，這難免使得每個步驟的銜接過程都增大了污染的可能性，從而降低了實(shí)驗檢測的準(zhǔn)確性和可靠性。基因芯片在高通量基因檢測和篩選中有重要作用，但由于制造成本及雜交反應(yīng)復(fù)雜性，在低通量的實(shí)際應(yīng)用中受到了限制。為此，有科學(xué)家設(shè)計了一些方法來促進(jìn)其應(yīng)用，如管蓋芯片，其使用普通PCR擴(kuò)增管，在專用管蓋內(nèi)側(cè)固定分子探針，擴(kuò)增后與PCR產(chǎn)物雜交。但其還是有DNA雜交這一步驟，為此還專門設(shè)計改造擴(kuò)增管。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明提供了一種用于一體化檢測的基因芯片及在片擴(kuò)增方法，即將特異性核酸引物固定在基片上所制成的基因芯片，直接放入普通擴(kuò)增管中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測中無需進(jìn)行核酸分子雜交過程，減化了操作，提高基因檢測的準(zhǔn)確性和可靠性。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。
[0007]本發(fā)明所述的用于一體化檢測的基因芯片，在基片上固定特異性核酸引物。
[0008]本發(fā)明所述的用于一體化檢測的基因芯片及在片擴(kuò)增方法，按如下步驟:
(1)在基片上固定特異性核酸引物；
(2)將固定特異性核酸引物的基片置于擴(kuò)增管中；
(3)將制備好的待檢測基因提取物、擴(kuò)增體系加入到擴(kuò)增管中； (4)將擴(kuò)增管置于基因擴(kuò)增儀中擴(kuò)增；
(5)基因擴(kuò)增完成后，檢測基片上的熒光信號，從而獲得基因信息。
[0009]步驟(2)所述的擴(kuò)增體系包括相應(yīng)的酶和熒光標(biāo)記的核酸引物系統(tǒng)等。
[0010]本發(fā)明所述的基片，包括玻璃、硅片、石英、金屬、高分子材料、塑料片、尼龍膜、硝酸纖維膜、多孔膜或凝膠等。
[0011]本發(fā)明所述的基因擴(kuò)增儀可以是各種現(xiàn)有的擴(kuò)增儀器，也可以是改進(jìn)的專用擴(kuò)增和檢測一體化儀器。
[0012]即將特異性核酸引物固定在基片上所制成的基因芯片，直接放入普通擴(kuò)增管中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系中包括熒光標(biāo)記的相應(yīng)引物。
[0013]本發(fā)明將固定在基片上的特殊DNA序列，作為特異性的核酸引物的一部分放入擴(kuò)增管中，加入相應(yīng)的PCR擴(kuò)增體系，包括所需的帶熒光標(biāo)記的引物、酶以及緩沖液及待檢測基因，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，基因擴(kuò)增完成后，檢測基片上的熒光信號，從而獲得基因信息。
[0014]由于本發(fā)明將特異性的核酸引物固定于擴(kuò)增管內(nèi)的基片(玻璃，硅片，石英，金屬，高分子材料，塑料片、尼龍膜、硝酸纖維膜、多孔膜，凝膠等)上，在擴(kuò)增管內(nèi)構(gòu)成一個相對封閉的空間，使得本發(fā)明可以被應(yīng)用于一體化檢測基因，能在上述相對封閉的空間內(nèi)完成。本發(fā)明使得基因擴(kuò)增在一個相對封閉的空間內(nèi)即可完成，避免了交叉污染，省去了核酸雜交操作過程，實(shí)現(xiàn)了基因在片擴(kuò)增的一體化。
[0015]本發(fā)明有效地整合了 PCR技術(shù)與基因芯片技術(shù)的優(yōu)勢，彌補(bǔ)了其缺陷，在實(shí)現(xiàn)一體化高通量檢測多個基因信息的同時，有效地避免了擴(kuò)增、擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)移過程中可能出現(xiàn)的污染。同時去除了在基因芯片技術(shù)中通用的核酸雜交這一步驟，也去除了 PCR擴(kuò)增后的電泳這一步驟，減化了操作，降低了成本，提高了效益。
[0016]本發(fā)明提供了一種用于一體化檢測的基因芯片及在片擴(kuò)增方法，有效地整合了PCR技術(shù)與基因芯片技術(shù)的優(yōu)勢，在實(shí)現(xiàn)一體化檢測多個基因信息的同時，有效地避免了擴(kuò)增、擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)移過程中可能出現(xiàn)的污染。去除了在基因芯片技術(shù)中通用的核酸雜交這一步驟，減化了操作，提高了效益。
[0017]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn):
(I)固定特異性核酸引物于基片上，該引物起著引物和探針的雙重作用，從而去除了通用的核酸雜交這一步驟，極大地提高了效益，降低了成本。
[0018](2)基片上固定特異性核酸引物，并置于擴(kuò)增管中進(jìn)行在片PCR，使各個PCR反應(yīng)能分開進(jìn)行，解決了多重PCR中引物互相干擾問題。
[0019](3)實(shí)現(xiàn)一體化同時檢測多個基因信息，避免了擴(kuò)增、產(chǎn)物轉(zhuǎn)移過程中可能出現(xiàn)的污染。 [0020](4)使用的儀器簡單且通用，普通PCR儀和熒光顯微鏡即可完成檢測，將大大推動基因芯片技術(shù)應(yīng)用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1是本發(fā)明實(shí)施例1的示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022]本發(fā)明將通過以下實(shí)施例作進(jìn)一步說明。
[0023]實(shí)施例1。
[0024]本發(fā)明的用于一體化檢測的基因芯片及在片擴(kuò)增方法，即將特異性核酸引物固定在基片上所制成的基因芯片，直接放入普通擴(kuò)增管中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。固定在基片上的特殊DNA序列，作為引物的一部分放入擴(kuò)增管中，加入相應(yīng)的PCR擴(kuò)增體系，包括所需的帶熒光標(biāo)記的引物、待檢測基因、擴(kuò)增體系(dNTP、相應(yīng)的酶和緩沖液等)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，基因擴(kuò)增完成后，檢測基片上的熒光信號，從而獲得基因信息。擴(kuò)增管內(nèi)的擴(kuò)增體系包括用于管內(nèi)在片PCR反應(yīng)的基片、基片上固定的引物系統(tǒng)、帶標(biāo)記的核酸引物系統(tǒng)、擴(kuò)增體系(dNTP、相應(yīng)的酶和緩沖液等)。
[0025]本發(fā)明的用于一體化檢測基因的在片PCR基因芯片，其使用方法如下:
(I)芯片的制備
塑料基片經(jīng)清洗、等離子處理、化學(xué)修飾后在基片上得到活性基團(tuán)，設(shè)計特異性的核酸引物使其一段帶有相應(yīng)的活性基團(tuán)，通過手工或點(diǎn)樣儀將核酸探針按照一定的陣列固定到經(jīng)化學(xué)處理的基片上，制備出基因芯片。
[0026](2)基因擴(kuò)增
將制備的基因芯片置于擴(kuò)增管內(nèi)，擴(kuò)增管管內(nèi)加入相應(yīng)的PCR擴(kuò)增體系，包括所需的帶熒光標(biāo)記的引物、待檢測基因、擴(kuò)增體系(dNTP、相應(yīng)的酶和緩沖液等)。蓋好管蓋，將擴(kuò)增管置于PCR擴(kuò)增儀上擴(kuò)增。
[0027](3)芯片檢測
將擴(kuò)增后的基因芯片置于熒光顯微鏡下，逐個掃描，檢查結(jié)果。
[0028]實(shí)施例2。
[0029]本發(fā)明的用于一體化檢測的基因芯片及在片擴(kuò)增方法，即將特異性核酸引物固定在基片上所制成的基因芯片，直接放入普通擴(kuò)增管中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用于檢測轉(zhuǎn)基因大豆。在管內(nèi)玻璃芯片上通過點(diǎn)樣儀固定上轉(zhuǎn)基因大豆轉(zhuǎn)入基因的特異性引物；擴(kuò)增管內(nèi)加入帶標(biāo)記的特異性的引物、待測 基因、擴(kuò)增體系(dNTP、相應(yīng)的酶和緩沖液等)。PCR擴(kuò)增后，經(jīng)熒光掃描，若出現(xiàn)熒光，則基因擴(kuò)增反應(yīng)發(fā)生，待測基因中含有轉(zhuǎn)入基因，表明該樣品來源于轉(zhuǎn)基因大豆。
【權(quán)利要求】
1.一種用于一體化檢測的基因芯片，其特征是在基片上固定特異性核酸引物。
2.—種權(quán)利要求1所述的用于一體化檢測的基因芯片的在片擴(kuò)增方法，其特征是按如下步驟: (1)在基片上固定特異性核酸引物； (2)將固定特異性核酸引物的基片置于擴(kuò)增管中； (3)將制備好的待檢測基因提取物、擴(kuò)增體系加入到擴(kuò)增管中； (4)將擴(kuò)增管置于基因擴(kuò)增儀中擴(kuò)增； (5)基因擴(kuò)增完成后，檢測基片上的熒光信號，從而獲得基因信息； 步驟(2)所述的擴(kuò)增體系包括相應(yīng)的酶和熒光標(biāo)記的核酸引物系統(tǒng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于一體化檢測的基因芯片的在片擴(kuò)增方法，其特征是所述的基片為塑料片、玻璃、硅片、石英、尼龍膜、硝酸纖維膜制成。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于一體化檢測的基因芯片的在片擴(kuò)增方法，其特征是所述的基因擴(kuò)增儀為擴(kuò)增儀器， 或?qū)Ｓ脭U(kuò)增和檢測一體化儀器。
【文檔編號】C40B40/06GK103966320SQ201410166686
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年4月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月24日
【發(fā)明者】吳凌偉, 秦煊 申請人:南昌大學(xué)