專利名稱：一種檢測(cè)十四種常見(jiàn)致病菌的復(fù)合基因芯片及方法
—種檢測(cè)十四種常見(jiàn)致病菌的復(fù)合基因芯片及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因芯片，尤其涉及ー種檢測(cè)十四種常見(jiàn)致病菌的復(fù)合基因芯片及使用該復(fù)合基因芯片進(jìn)行檢測(cè)的方法。
背景技木生物毒素(biotoxin)亦稱天然毒素(natural toxin),是指生物來(lái)源不可自主復(fù)制的有毒化學(xué)物質(zhì)，包括動(dòng)物毒素、植物毒素和微生物毒素等。其中微生物毒素主要由產(chǎn)毒微生物生長(zhǎng)過(guò)程中分泌以及死亡后體內(nèi)的物質(zhì)釋放而產(chǎn)生的，可以分為細(xì)菌毒素(bacterial toxin)和真菌毒素(mycotoxin)。常見(jiàn)的細(xì)菌毒素有金黃色葡萄球菌毒素、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌腸毒素、志賀樣毒素、志賀菌毒素、霍亂毒素、溶血毒素等。常見(jiàn)真菌毒素有黃曲霉毒素、伏馬菌素等。對(duì)于上述諸多微生物毒素快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)是有效預(yù)防中毒事件發(fā)生的前提和關(guān)鍵。但目前由于天然食物生產(chǎn)的全球化、新食品生產(chǎn)エ藝的應(yīng)用、人們飲食 習(xí)慣的改變等各種因素在一定程度上増加了產(chǎn)毒微生物感染的途徑，造成各種產(chǎn)毒微生物引起大規(guī)模中毒事件屢屢發(fā)生，以產(chǎn)毒微生物為根源的中毒占食物中毒事件之首位，其毒性之高仍是化學(xué)合成毒物都難以達(dá)到的。因此發(fā)展產(chǎn)毒微生物的快速檢測(cè)、鑒定方法一直為國(guó)際上研究的熱點(diǎn)。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)細(xì)菌毒素和真菌毒素的直接檢測(cè)存在一定的難度。主要的方法有①生物法有很大局限性，只能測(cè)出其毒性大小，無(wú)法確知其組成；所測(cè)得的毒性和小鼠的品系、狀態(tài)、體重等有夫，不確定因素很多很復(fù)雜；毒性測(cè)定結(jié)果重復(fù)性差；測(cè)試所需時(shí)間長(zhǎng)，需專門(mén)人員，費(fèi)用高。②基于免疫技術(shù)的免疫層析法、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、免疫印跡等。隨著單克隆抗體和多克隆抗體制備技術(shù)的發(fā)展，免疫學(xué)檢測(cè)地敏感性及特異性均有提高，但仍存在一定的問(wèn)題。免疫學(xué)檢測(cè)不可避免地可能發(fā)生交叉反應(yīng)，使用的化學(xué)試劑也可能掩蓋毒素的存在，實(shí)驗(yàn)受試劑純度的影響很大，引起假陽(yáng)性或假陰性。此外，與儀器測(cè)定相比免疫方法的檢測(cè)靈敏度不高，只能作為快速篩選，常常需要檢測(cè)限較低的儀器作結(jié)果確證。③基于儀器測(cè)定的薄層色譜法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)、氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)、液質(zhì)聯(lián)用(HPLC-MS)、免疫親和柱-熒光檢測(cè)(IAC-FLD)。儀器測(cè)定有靈敏度高、檢測(cè)限低、自動(dòng)化程度高的優(yōu)點(diǎn)。然而此方法所需儀器昂貴，人員技術(shù)要求高，標(biāo)準(zhǔn)品毒性大，ー些毒素標(biāo)準(zhǔn)品難以獲得。另外，現(xiàn)時(shí)的儀器和技術(shù)尚未能實(shí)現(xiàn)同步檢測(cè)多種毒素及其衍生物。④基于核酸和基因探針技術(shù)的PCR反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction,)和實(shí)時(shí)熒光PCR法(Real-Time PCR)等。基因芯片(gene chip)又稱DNA芯片，是20世紀(jì)90年代發(fā)展起來(lái)的ー項(xiàng)專門(mén)用于核酸檢測(cè)的前沿生物技術(shù)，是在分子雜交技術(shù)和微晶技術(shù)(microfabrication technology)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的生物高技術(shù),具有傳統(tǒng)的檢測(cè)方法不可比擬的優(yōu)點(diǎn)微型化、高通量、并行處理、快速分析、高準(zhǔn)確性、高靈敏度、定量分析等。能夠?qū)ξ廴臼称返漠a(chǎn)毒細(xì)菌、真菌的毒力基因?qū)崿F(xiàn)快速的在線檢測(cè)，及時(shí)反映食品中存在的潛在毒素污染問(wèn)題。基因芯片技術(shù)是將待測(cè)樣品DNA或RNA通過(guò)PCR擴(kuò)增、RT-PCR擴(kuò)增、體外轉(zhuǎn)錄等技術(shù)滲入探針?lè)肿雍螅c位于芯片上的探針?lè)肿与s交。通過(guò)激光共聚焦熒光檢測(cè)系統(tǒng)等對(duì)芯片進(jìn)行掃描，檢測(cè)雜交信號(hào)強(qiáng)度。計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的比較和綜合分析后，即獲得樣品中大量基因序列特征或基因表達(dá)特征信息。由于微生物毒素種類眾多，且存在許多結(jié)構(gòu)相似的衍生化合物，因此現(xiàn)有方法分別在特異性、靈敏度、適用范圍、檢測(cè)成本等方面有較大局限性。基因芯片具備高通量的優(yōu)點(diǎn)，通過(guò)反向雜交技術(shù)，可同時(shí)高通量、并行分析處理多基因、多序列，從而對(duì)多種產(chǎn)毒微生物進(jìn)行同步檢測(cè)鑒定。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的ー個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種檢測(cè)十四種常見(jiàn)致病菌的復(fù)合基因芯片，同時(shí)檢測(cè)14種常見(jiàn)致病菌，檢測(cè)通量高、特異性強(qiáng)、靈敏度好、快速有效。上述技術(shù)問(wèn)題通過(guò)以下技術(shù)方案解決一種檢測(cè)十四種常見(jiàn)致病菌的復(fù)合基因芯片，其特征在于，所述復(fù)合基因芯片上整合了如下探針
用于檢測(cè)金黃色葡萄球菌的靶基因FemA的探針金黃色葡萄球菌I探針，其序列為GCT CAC TAT TTG CTT GGC TTT G,金黃色葡萄球菌2探針，其序列為T(mén)TT GAC TCT CAT TCAAAT GTT G ；用于檢測(cè)沙門(mén)氏菌的靶基因invA的探針沙門(mén)氏菌探針，其序列為AAT AAG ACC GGC CTT CTA GG;用于檢測(cè)空腸彎曲菌的靶基因VSl的探針空腸彎曲菌I探針，其序列為T(mén)GAAAG TGA TAG CGC TAGACA G,空腸彎曲菌2探針，其序列為AAC TAT TAG GCT CTT GGA GGC T ；用于檢測(cè)小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的靶基因ail的探針小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌I探針，其序列為AGC AAT TGC CAG TTA TCC AT，小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌2探針，其序列為T(mén)GG AGC AAC ATT GAT GAA CA ；用于檢測(cè)副溶血性弧菌的靶基因tlh的探針副溶血性弧菌I探針，其序列為ATC TGC ACAAGC ACT AAG CG,副溶血性弧菌2探針，其序列為GAT GGC ACG CAA CAT TCC AC ；用于檢測(cè)霍亂弧菌的靶基因ompW的探針霍亂弧菌I探針，其序列為GTG TAC TAATTG TCC GCA CC,霍亂弧菌2探針，其序列為T(mén)AC CAC TAC TTG GAA GCA AG ；用于檢測(cè)腸出血性大腸埃希氏菌0157:H7的靶基因rfbE的探針0157:H7 探針，其序列為 GTGAAC TGAACG GCA CCA TC ；用于檢測(cè)臘樣芽孢桿菌的靶基因16s rRNA-b的探針臘樣芽孢桿探針，其序列為T(mén)GC TAC GCA TTG GCA CTG GCA CCT ；用于檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭菌的靶基因CP α的探針產(chǎn)氣莢膜梭菌探針，其序列為T(mén)AC TAG TTG TAT TAG GCT CC;用于檢測(cè)志賀氏菌的靶基因ipaH的探針志賀氏菌I探針，其序列為CAT TTC TGC CGA CGC AGT CA,志賀氏菌2探針，其序列為CAC ATC TTG CAA TCT GCA GA ；用于檢測(cè)單核增生李斯特氏菌的靶基因prfA的探針
單核增生李斯特氏菌探針，其序列為GAT TAC TAA GCA CCATGG CT ；用于檢測(cè)肉毒梭菌的靶基因16s rRNA-c的探針肉毒梭菌探針，其序列為T(mén)ATACC TAGACAATC TCATT ；用于檢測(cè)黃曲霉、寄生曲霉的靶基因Nor的探針黃曲霉/寄生曲霉Norl探針，其序列為ATC ATA CTG TCT GCAAGC TG,黃曲霉/寄生曲霉Nor2探針，其序列為GGT TTC TGC CCAATA CAG GA ；用于檢測(cè)黃曲霉、寄生曲霉的靶基因omt的探針黃曲霉/寄生曲霉omtl探針，其序列為GAG AAC CCA TCC AAG GCA TG,
黃曲霉/寄生曲霉omt2探針，其序列為CCT TAC TTC CTC GCAAAG AA。本發(fā)明要解決的另一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種檢測(cè)十四種常見(jiàn)致病菌的方法，能檢測(cè)14種常見(jiàn)致病菌，檢測(cè)通量高、特異性強(qiáng)、靈敏度好、快速有效。上述技術(shù)問(wèn)題通過(guò)以下技術(shù)方案解決一種檢測(cè)十四種常見(jiàn)致病菌的方法，其特征在于，包括以下步驟I)提取被檢測(cè)物質(zhì)的模版DNA ；2)使用生物標(biāo)記素標(biāo)記引物；3)使用上述被標(biāo)記的引物對(duì)所述模版DNA進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增；4)將所得擴(kuò)增產(chǎn)物與權(quán)利要求I所述的復(fù)合基因芯片進(jìn)行雜交；5)檢測(cè)復(fù)合基因芯片的雜交信號(hào)。進(jìn)ー步的方案步驟2)中所述的引物為下列引物中ー種與金黃色葡萄球菌的靶基因FemA對(duì)應(yīng)的引物，其序列為FemA-F aaa aaa gca cat aac aag eg, FemA-R gat aaa gaa gaa acc age ag ；與沙門(mén)氏菌的靶基因invA對(duì)應(yīng)的引物，其序列為ιηνΑ-F gtg aaa tta tcg cca cgt tcg ggc aa, ιηνΑ-R tca tcg cac cgt caa
agg aacc 與空腸彎曲菌的靶基因VSl對(duì)應(yīng)的引物，其序列為V^l-F gat atg tat gat ttt ate ttg cgaa tga aat ttt aga atg ggg ；與小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的靶基因ail對(duì)應(yīng)的引物，其序列為ail-F tta atg tgtacg ctg gga gtg，ail-R gga gta ttc ata tga age gtc ；與副溶血性弧菌的靶基因tlh對(duì)應(yīng)的引物，其序列為tlh-F aaa gcg gat tat gca gaa gca ctg, tlh-R gct act ttc tag cat tttctc tgc;與霍亂弧菌的靶基因ompW對(duì)應(yīng)的引物，其序列為ompW-F cac caa gaa ggt gac ttt att gtg, ompW-R gaa ctt ata acc acc cgcg ;與腸出血性大腸埃希氏菌0157:H7的靶基因rfbE對(duì)應(yīng)的引物，其序列為rfbE-F att gcg ctg aag cct ttg ;rfbE_R cga gta cat tgg cat cgt g ；與臘樣芽孢桿菌的靶基因16s rRNA-b對(duì)應(yīng)的引物，其序列為Ibs-F cgc tgg egg cag gcc taa cac atgc，16s_R :cgc ggc tgc tgg cac ggagtt age c ；與產(chǎn)氣莢膜梭菌的靶基因CPa對(duì)應(yīng)的引物，其序列為CP a -F aga tat gaa tgg caa aga gga aac，CP a-R :gct ate aac ggc agt aacatt ag ；與志賀氏菌的靶基因ipaH對(duì)應(yīng)的引物，其序列為ipaH-F gtt cct tga ccg cct ttc cga tac cgt c ；ipaH-R gcc ggt cag ccaccc tct gag agt ac ；與單核增生李斯特氏菌的靶基因prfA對(duì)應(yīng)的引物，其序列為prfA-F gat aca gaa aca tcg gtt ggc，prfA-R :gtg taa tct tga tgc cat cag ；與肉毒梭菌的靶基因16s rRNA-c對(duì)應(yīng)的引物，其序列為Ibs-F cgc tgg egg cag gcc taa cac atg c ； Ids-R cgc ggc tgc tgg cac ggagtt age c ；與黃曲霉和寄生曲霉的革巴基因Nor對(duì)應(yīng)的引物，其序列為Nor-F acc get acg ccg gca ctc tcg gca c ；Nor-R gtt ggc cgc cag ctt cgacac tcc g ；與黃曲霉和寄生曲霉的革巴基因omt對(duì)應(yīng)的引物，其序列為omt-F ggc ccg gtt cct tgg ctc cta age ;omt_R cgc ccc agt gag acc cttcct Cgo進(jìn)ー步的方案步驟2)中的聚合酶鏈反應(yīng)的反應(yīng)體系為
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)十四種常見(jiàn)致病菌的復(fù)合基因芯片，其特征在于，所述復(fù)合基因芯片上整合了如下探針 用于檢測(cè)金黃色葡萄球菌的靶基因FemA的探針 金黃色葡萄球菌I探針，其序列為GCT CAC TAT TTG CTT GGC TTT G， 金黃色葡萄球菌2探針，其序列為T(mén)TT GAC TCT CAT TCAAAT GTT G ； 用于檢測(cè)沙門(mén)氏菌的靶基因invA的探針 沙門(mén)氏菌探針，其序列為AAT AAG ACC GGC CTT CTA GG; 用于檢測(cè)空腸彎曲菌的靶基因VSl的探針 空腸彎曲菌I探針,其序列為T(mén)GAAAG TGA TAG CGC TAGACA G, 空腸彎曲菌2探針，其序列為AAC TAT TAG GCT CTT GGA GGC T ； 用于檢測(cè)小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的靶基因ail的探針 小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌I探針，其序列為AGC AAT TGC CAG TTA TCC AT， 小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌2探針，其序列為T(mén)GG AGC AAC ATT GAT GAA CA ； 用于檢測(cè)副溶血性弧菌的靶基因tlh的探針 副溶血性弧菌I探針，其序列為ATC TGC ACAAGC ACT AAG CG, 副溶血性弧菌2探針，其序列為GAT GGC ACG CAA CAT TCC AC ； 用于檢測(cè)霍亂弧菌的靶基因ompW的探針 霍亂弧菌I探針，其序列為GTG TAC TAATTG TCC GCA CC, 霍亂弧菌2探針，其序列為T(mén)AC CAC TAC TTG GAA GCA AG ； 用于檢測(cè)腸出血性大腸埃希氏菌0157:H7的靶基因rfbE的探針 0157 :H7 探針，其序列為 GTGAAC TGAACG GCA CCA TC; 用于檢測(cè)臘樣芽孢桿菌的靶基因16s rRNA-b的探針 臘樣芽孢桿探針，其序列為T(mén)GC TAC GCA TTG GCA CTG GCA CCT ； 用于檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭菌的靶基因CPa的探針 產(chǎn)氣莢膜梭菌探針，其序列為T(mén)AC TAG TTG TAT TAG GCT CC ； 用于檢測(cè)志賀氏菌的靶基因ipaH的探針 志賀氏菌I探針，其序列為CAT TTC TGC CGA CGC AGT CA, 志賀氏菌2探針，其序列為CAC ATC TTG CAA TCT GCA GA ； 用于檢測(cè)單核增生李斯特氏菌的靶基因PrfA的探針 單核增生李斯特氏菌探針，其序列為GAT TAC TAA GCA CCA TGG CT ； 用于檢測(cè)肉毒梭菌的靶基因16s rRNA-c的探針 肉毒梭菌探針，其序列為T(mén)ATACC TAGACAATC TCATT ； 用于檢測(cè)黃曲霉、寄生曲霉的靶基因Nor的探針 黃曲霉/寄生曲霉Norl探針，其序列為ATC ATA CTG TCT GCA AGC TG, 黃曲霉/寄生曲霉Nor2探針，其序列為GGT TTC TGC CCAATA CAG GA ； 用于檢測(cè)黃曲霉、寄生曲霉的靶基因omt的探針 黃曲霉/寄生曲霉omtl探針，其序列為GAG AAC CCA TCC AAG GCA TG, 黃曲霉/寄生曲霉omt2探針，其序列為CCT TAC TTC CTC GCA AAG AA。
2.一種檢測(cè)十四種常見(jiàn)致病菌的方法，其特征在于，包括以下步驟1)提取被檢測(cè)物質(zhì)的模版DNA； 2)使用生物標(biāo)記素標(biāo)記引物； 3)使用上述被標(biāo)記的引物對(duì)所述模版DNA進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增； 4)將所得擴(kuò)增產(chǎn)物與權(quán)利要求I所述的復(fù)合基因芯片進(jìn)行雜交； 5)檢測(cè)復(fù)合基因芯片的雜交信號(hào)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟2)中所述的引物為下列引物中一種 與金黃色葡萄球菌的靶基因FemA對(duì)應(yīng)的引物，其序列為 FemA F aaa aaa gca cat aac aag eg, FemA-R gat aaa gaa gaa acc age ag ；與沙門(mén)氏菌的靶基因invA對(duì)應(yīng)的引物，其序列為invA-F gtg aaa tta tcg cca cgt tcg ggc aa，invA-R tca tcg cac cgt caa aggBBC C ; 與空腸彎曲菌的靶基因VSl對(duì)應(yīng)的引物，其序列為VSl-F gat atg tat gat ttt ate ttg c ；VS1-R gaa tga aat ttt aga atg ggg ； 與小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的靶基因ail對(duì)應(yīng)的引物，其序列為ail-F tta atg tgt acg ctg gga gtg，ail_R :gga gta ttc ata tga age gtc ； 與副溶血性弧菌的靶基因tlh對(duì)應(yīng)的引物，其序列為tlh-F aaa gcg gat tat gca gaa gca ctg, tlh-R gct act ttc tag cat ttt ctctgc ； 與霍亂弧菌的靶基因ompW對(duì)應(yīng)的引物，其序列為ompW—F cac caa gaa ggt gac ttt att gtg, ompW—R gaa ctt ata acc acc cgc g ；與腸出血性大腸埃希氏菌0157:H7的靶基因rfbE對(duì)應(yīng)的引物，其序列為rfbE—F att gcg ctg aag cct ttg, rfbE—R cga gta cat tgg cat cgt g ； 與臘樣芽孢桿菌的靶基因16s對(duì)應(yīng)的引物，其序列為16s_F cgc tgg egg cag gcc taa cac atg c，16s_R:cgc ggc tgc tgg cac gga gttage c ； 與產(chǎn)氣莢膜梭菌的靶基因CPa對(duì)應(yīng)的引物，其序列為CPa-F aga tat gaa tgg caa aga gga aac，CP a-R :gct ate aac ggc agt aac attag ； 與志賀氏菌的靶基因ipaH對(duì)應(yīng)的引物，其序列為 ipaH-F gtt cct tga ccg cct ttc cga tac cgt c;ipaH_R:gcc ggt cag cca ccctct gag agt ac ； 與單核增生李斯特氏菌的靶基因prfA對(duì)應(yīng)的引物，其序列為prfA-F gat aca gaa aca tcg gtt ggc, prfA-R gtg taa tct tga tgc cat cag ； 與肉毒梭菌的靶基因16s對(duì)應(yīng)的引物，其序列為.16s_F cgc tgg egg cag gcc taa cac atg c ;16s_R:cgc ggc tgc tgg cac gga gttage c ； 與黃曲霉和寄生曲霉的革巴基因Nor對(duì)應(yīng)的引物，其序列為Nor-F acc get acg ccg gca ctc tcg gca c ;Nor_R gtt ggc cgc cag ctt cga cactec g ; 與黃曲霉和寄生曲霉的祀基因omt對(duì)應(yīng)的引物,其序列為omt—F ggc ccg gtt cct tgg ctc cta age ;omt_R cgc ccc agt gag acc ctt ccteg。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于， 步驟2)中的聚合酶鏈反應(yīng)的反應(yīng)體系為
全文摘要
本發(fā)明涉及基因芯片及方法，本發(fā)明針對(duì)十四種常見(jiàn)致病菌的特異性鑒別靶基因設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物和探針，構(gòu)建復(fù)合基因芯片；使用生物素標(biāo)記引物，再將引物以PCR方法來(lái)擴(kuò)增被檢測(cè)物質(zhì)的靶基因片段，擴(kuò)增產(chǎn)物與復(fù)合基因芯片上的探針雜交，通過(guò)引物和探針雙重特異性檢測(cè)，復(fù)合物在復(fù)合基因表面沉積，使特定的分子雜交轉(zhuǎn)變成可視信號(hào)，從而檢測(cè)不同產(chǎn)毒微生物。本發(fā)明能檢測(cè)14種常見(jiàn)致病菌，檢測(cè)通量高、特異性強(qiáng)、靈敏度好、快速有效。
文檔編號(hào)C12R1/42GK102851356SQ201210079510
公開(kāi)日2013年1月2日 申請(qǐng)日期2012年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月22日
發(fā)明者馮家望, 王小玉, 鄺筱珊, 游淑珠, 胡松楠, 成曉維, 唐食明 申請(qǐng)人:馮家望, 王小玉, 鄺筱珊