本發(fā)明屬于納米顆粒制備技術(shù)領(lǐng)域，具體的是涉及一種具有類漆酶活性的鉑納米顆粒及制備方法。

背景技術(shù)：

漆酶(也叫藍(lán)酶，laccase)，是一種含銅的多酚氧化酶，是多酚氧化酶的一種，也是氧化還原酶，主要以酚類化合物和芳香胺類化合物為底物，同時(shí)伴隨分子氧還原成水(Galhaup,C.,Wagner,H.,Hinterstoisser,B.&Haltrich,D.Increased production of laccase by the wood degrading basidiomycete Trametes pubescens[J].Enzyme and Microbial Technology 2002,30:529-536)。眾所周知，工業(yè)催化嚴(yán)重污染環(huán)境以及其苛刻的反應(yīng)條件等缺點(diǎn)，使得漆酶這樣一種清潔高效的氧化還原酶，在生物催化反應(yīng)中占據(jù)了十分關(guān)鍵的地位，具有很重要的基礎(chǔ)研究意義和巨大的商業(yè)價(jià)值。然而，漆酶價(jià)格昂貴且其pH和溫度的適用性比較窄，遇到酸、堿、熱等非生理?xiàng)l件容易發(fā)生結(jié)構(gòu)變化而失去催化活性，不利于工業(yè)應(yīng)用。因此，研發(fā)具有漆酶特性，穩(wěn)定性高、價(jià)格低廉的模擬酶體系顯得十分必要。

以納米材料為基礎(chǔ)構(gòu)建的模擬酶體系即納米酶，在模擬酶的大家族中是一支最新并且最具應(yīng)用前景的生力軍。與天然酶相比，納米材料具有成本低、穩(wěn)定性高、易于處理和儲(chǔ)存、催化活性可調(diào)節(jié)等優(yōu)點(diǎn)(Wei,H.；Wang,E.Nanomaterials with enzyme-like characteristics(nanozymes):next-generation artificial enzymes.Chem.Soc.Rev.2013,42,6060–6093.)。在納米材料中，鉑納米顆粒已經(jīng)被公認(rèn)為是一種高度理想的催化劑，已被發(fā)現(xiàn)具有類過氧化酶、氧化酶、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶等活性但類漆酶活性尚未有報(bào)道。因此，開發(fā)方便有效的具有類漆酶活性的鉑納米顆粒制備方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種工藝簡單、周期短、條件易控、溫和，便于大工業(yè)生產(chǎn)的具有類漆酶活性的鉑納米顆粒的制備方法。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種具有類漆酶活性的鉑納米顆粒。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種具有類漆酶活性的鉑納米顆粒的用途。

本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：

一種具有類漆酶活性的鉑納米顆粒的制備方法，包括如下步驟：

(1)脫氧核苷酸的退火：

將2.5-250μL 2-200μM的脫氧核苷酸水溶液和50-200μL 5-60mM pH為3.0-9.0的緩沖液混勻；升溫至85-100℃，維持3-10min，降至室溫；

脫氧核苷酸的序列可選自下述序列之一：

Gb，其中b＝10-200；

Cc，其中c＝10-200；

Ad，其中d＝10-200；

Te，其中e＝10-200；

(AC)f，其中f＝5-100；

(AT)g，其中e＝5-100；

(AG)h，其中h＝5-100；

(GC)i，其中i＝5-100；

(GT)j，其中j＝5-100；

(GA)k，其中k＝5-100；

(CG)l，其中l(wèi)＝5-100；

(CA)m，其中m＝5-100；

(CT)n，其中n＝5-100；

(TA)o，其中o＝5-100；

(TC)p，其中p＝5-100；

(TG)q，其中q＝5-100；

(2)鉑納米顆粒的制備：

將2-15μL 100-1000μM氯鉑酸鹽水溶液加入到步驟(1)獲得的退火的脫氧核苷酸水溶液中，在20-30℃下混勻，靜置0.5-4h，加入6-24μL 0.6-2.4mM還原劑水溶液，混勻，在20-30℃下靜置10-15h，得到具有類漆酶活性的鉑納米顆粒液體。

優(yōu)選地，脫氧核苷酸水溶液的濃度為10μM。

緩沖液的濃度最好是10mM，緩沖液的pH為5.0，

緩沖液優(yōu)選：磷酸鹽緩沖溶液、三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液、2-(N-嗎啉)乙磺酸一水合物緩沖溶液、乙酸鈉緩沖溶液、羥乙基哌嗪乙硫磺酸緩沖溶液或3-(N-嗎啉)丙磺酸緩沖溶液。

氯鉑酸鹽水溶液的濃度最好是300μM。

氯鉑酸鹽優(yōu)選：氯鉑酸鈉或者氯鉑酸鉀。

還原劑優(yōu)選：硼氫化鈉或二甲胺硼烷。

上述方法制備的具有類漆酶活性的鉑納米顆粒。

上述具有類漆酶活性的鉑納米顆粒對(duì)漆酶底物催化氧化的用途。

本發(fā)明的方法簡單、周期短、條件易控、溫和，便于大工業(yè)生產(chǎn)制備；具有類漆酶活性的鉑納米顆粒的平均粒徑為1.0-10nm，催化活性高。可以替代漆酶用于生物檢測(cè)、污染物降解等相關(guān)領(lǐng)域。

附圖說明

圖1是實(shí)施例1中合成的具有類漆酶活性的鉑納米顆粒的透射電鏡圖；

圖2是實(shí)施例1中氨基安替比林溶液濃度為40μM，對(duì)二氯苯酚溶液分別為0.05mM、0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.5mM、1.0mM、2.0mM的動(dòng)力學(xué)曲線圖；

圖3為圖2的雙倒數(shù)曲線圖。

具體實(shí)施方式

下面的實(shí)施例是為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠更好地理解本發(fā)明，但不對(duì)本發(fā)明作任何限制。

實(shí)施例1

一種具有類漆酶活性的鉑納米顆粒的制備方法，包括如下步驟：

(1)脫氧核苷酸C₁₀(CCCCCCCCCC)的退火：

將5μL 10μM的脫氧核苷酸C₁₀水溶液和200μL 10mM pH為5.0的磷酸鹽緩沖溶液混勻；升溫至95℃，維持5min，降至室溫；

(2)鉑納米顆粒的制備：

將5μL 300μM氯鉑酸鉀水溶液加入到步驟(1)獲得的退火的脫氧核苷酸水溶液中，在28℃下混勻，靜置3h，加入10μL 1.5mM二甲胺硼烷水溶液，混勻，在28℃下靜置12h，得到具有類漆酶活性的鉑納米顆粒液體。用透射電鏡掃描獲得平均粒徑為3.4nm。(見圖1)檢測(cè)：

測(cè)定鉑納米顆粒的類漆酶活性：

在6個(gè)4mL比色皿中，均加入50μL實(shí)施例1獲得的具有類漆酶活性的鉑納米顆粒液體、750μL 10mM pH為7.0的2-(N-嗎啉)乙磺酸一水合物緩沖溶液、6μL 40μM氨基安替比林水溶液后，再向1-6個(gè)比色皿中依次分別加入為0.05mM、0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.5mM、1.0mM、2.0mM的對(duì)二氯苯酚水溶液，加入三蒸水使終體積為3000μL，混合反應(yīng)10min，采用紫外分光光度計(jì)掃描510nm處的吸收光譜，得到吸光度，通過Lineweaver–Burk方程計(jì)算出其米氏常數(shù)。(見圖2和圖3)

具有類漆酶活性的鉑納米顆粒表現(xiàn)出高的酶活性，對(duì)二氯苯酚的Km值為0.12mM。

實(shí)驗(yàn)證明，用三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液、羥乙基哌嗪乙硫磺酸緩沖溶液或3-(N-嗎啉)丙磺酸緩沖溶液替代實(shí)施例1中的磷酸鹽緩沖溶液，其它同實(shí)施例1，可以制備出相應(yīng)的具有類漆酶活性的鉑納米顆粒液體。

實(shí)施例2

一種具有類漆酶活性的鉑納米顆粒的制備方法，包括如下步驟：

(1)脫氧核苷酸C₁₀₀的退火：

將2.5μL 200μM的脫氧核苷酸C₁₀₀水溶液和50μL 60mM pH為3.0的2-(N-嗎啉)乙磺酸一水合物緩沖溶液混勻；升溫至85℃，維持10min，降至室溫；

(2)鉑納米顆粒的制備：

將2μL 1000μM氯鉑酸鈉水溶液加入到步驟(1)獲得的退火的脫氧核苷酸水溶液中，在20℃下混勻，靜置4h，加入6μL2.4mM硼氫化鈉水溶液，混勻，在20℃下靜置15h，得到具有類漆酶活性的鉑納米顆粒液體。用透射電鏡掃描獲得平均粒徑為2.6nm。

檢測(cè)：

測(cè)定鉑納米顆粒的類漆酶活性：

在6個(gè)4mL比色皿中，均加入50μL實(shí)施例2獲得的具有類漆酶活性的鉑納米顆粒液體、750μL 10mM pH為7.0的2-(N-嗎啉)乙磺酸一水合物緩沖溶液、6μL 40μM氨基安替比林水溶液后，再向1-6個(gè)比色皿中依次分別加入為0.05mM、0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.5mM、1.0mM、2.0mM的對(duì)二氯苯酚水溶液，加入三蒸水使終體積為3000μL，混合反應(yīng)10min，采用紫外分光光度計(jì)掃描510nm處的吸收光譜，得到吸光度，通過Lineweaver–Burk方程計(jì)算出其米氏常數(shù)。

具有類漆酶活性的鉑納米顆粒表現(xiàn)出高的酶活性，對(duì)二氯苯酚的Km值為0.27mM。

實(shí)施例3

一種具有類漆酶活性的鉑納米顆粒的制備方法，包括如下步驟：

(1)脫氧核苷酸C₂₀₀的退火：

將250μL 2μM的脫氧核苷酸C₂₀₀水溶液和200μL 5mM pH為9.0的乙酸鈉緩沖溶液混勻；升溫至100℃，維持3min，降至室溫；

(2)鉑納米顆粒的制備：

將15μL 100μM氯鉑酸鉀水溶液加入到步驟(1)獲得的退火的脫氧核苷酸水溶液中，在30℃下混勻，靜置0.5h，加入24μL0.6mM二甲胺硼烷水溶液，混勻，在30℃下靜置10h，得到具有類漆酶活性的鉑納米顆粒液體。用透射電鏡掃描獲得平均粒徑為2.2nm。

檢測(cè)：

測(cè)定鉑納米顆粒的類漆酶活性：

在6個(gè)4mL比色皿中，均加入50μL實(shí)施例3獲得的具有類漆酶活性的鉑納米顆粒液體、750μL 10mM pH為7.0的2-(N-嗎啉)乙磺酸一水合物緩沖溶液、6μL 40μM氨基安替比林水溶液后，再向1-6個(gè)比色皿中依次分別加入為0.05mM、0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.5mM、1.0mM、2.0mM的對(duì)二氯苯酚水溶液，加入三蒸水使終體積為3000μL，混合反應(yīng)10min，采用紫外分光光度計(jì)掃描510nm處的吸收光譜，得到吸光度，通過Lineweaver–Burk方程計(jì)算出其米氏常數(shù)。

具有類漆酶活性的鉑納米顆粒表現(xiàn)出高的酶活性，對(duì)二氯苯酚的Km值為0.32mM。

用G₁₀、G₁₀₀、G₂₀₀、(GC)₅、(GC)₅₀、(GC)₁₀₀、(GT)₅、(GT)₁₀₀、(GA)₅、(GA)₁₀₀、(CT)₅、(CT)₅₀、(CT)₁₀₀、(CA)₅、(CA)₁₀₀、(CG)₅、(CG)₁₀₀、A₁₀、A₁₀₀、A₂₀₀、(AC)₅、(AC)₅₀、(AC)₁₀₀、(AG)₅、(AG)₁₀₀、T₁₀、T₁₀₀、T₂₀₀、(TA)₅、(TA)₅₀、(TA)₁₀₀、(TC)₅、(TC)₁₀₀、(TG)₅、(TG)₁₀₀；分別替換實(shí)施例1中的C₁₀，其它同實(shí)施例1，所獲得的具有類漆酶活性的鉑納米顆粒的平均粒徑見表1。并用同實(shí)施例1相同的方法測(cè)定對(duì)二氯苯酚的Km值，見表1。

表1

結(jié)論：本發(fā)明的方法制備的具有類漆酶活性的鉑納米顆粒對(duì)二氯苯酚的Km值小，說明具有類漆酶活性的鉑納米顆粒與對(duì)二氯苯酚的親和力高，反應(yīng)速率快，催化活性高。

用對(duì)苯二酚，鄰苯二酚，對(duì)苯二胺，兒茶酚，2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽，多巴胺，抗壞血酸，對(duì)氨基苯酚，鄰氨基苯酚，二茂鐵，丁香醛連氮替代實(shí)施例1中檢測(cè)中的對(duì)二氯苯酚，其它同實(shí)施例1的檢測(cè)，結(jié)果顯示，本發(fā)明的具有類漆酶活性的鉑納米顆粒與上述物質(zhì)中的任意一個(gè)物質(zhì)都親和力高，反應(yīng)速率快，催化活性高。