專利名稱：鹽地堿蓬Na的制作方法
這項(xiàng)發(fā)明是從耐海水的鹽地堿蓬中克隆分離的一個(gè)編碼Na+/H+逆向運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白(SsNHX1)的全長(zhǎng)cDNA，更確切地說，是編碼堿蓬Na+/H+逆向運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白的核苷酸，該基因片段長(zhǎng)2397個(gè)堿基對(duì)，其開放讀碼框架(Open Reading Frame，ORF)為1668個(gè)堿基對(duì)，從SsNHX1 cDNA開放讀碼框推斷出，該cDNA編碼一個(gè)556個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)(分子量約61.2KD)。該發(fā)明屬于植物分子生物學(xué)領(lǐng)域。Na+/H+逆向運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白是生物界普遍存在的一種負(fù)責(zé)Na+、H+交換的跨膜運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白，它不但在保持植物細(xì)胞內(nèi)離子均衡，即促進(jìn)Na+的外排及Na+區(qū)隔化過程中扮演重要的角色，而且，在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)pH、細(xì)胞體積以及Na+含量中也發(fā)揮重要的作用。
植物的排Na+及Na+區(qū)隔化是植物細(xì)胞解除Na+毒害、進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)的兩個(gè)關(guān)鍵過程，而解除Na+毒害和滲透調(diào)節(jié)是植物耐鹽所必需的。Na+/H+逆向運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白是植物細(xì)胞保持離子均衡的重要因子，因而，克隆鹽地堿蓬Na+/H+逆向運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白基因SsNHX1、并弄清其功能特征及其信號(hào)傳導(dǎo)的調(diào)控途徑，對(duì)于我們更進(jìn)一步地理解植物的耐鹽機(jī)理至關(guān)重要，對(duì)于植物耐鹽基因工程意義重大。
Na+從細(xì)胞內(nèi)排出需要逆著其電化學(xué)勢(shì)梯度，因此是一個(gè)主動(dòng)運(yùn)輸?shù)倪^程。高等植物的排Na+機(jī)制主要與質(zhì)膜Na+/H+逆向運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白有關(guān)，質(zhì)膜H+-ATPase用水解ATP的能量把H+從細(xì)胞質(zhì)中泵出細(xì)胞，產(chǎn)生跨質(zhì)膜的H+電化學(xué)勢(shì)梯度，提供能量驅(qū)動(dòng)質(zhì)膜Na+/H+逆向運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白，使H+順其電化學(xué)勢(shì)梯度進(jìn)入細(xì)胞，同時(shí)Na+逆其電化學(xué)勢(shì)梯度排出細(xì)胞。從擬南芥中克隆的一個(gè)基因SOS1(Salt Overly Sensitive 1)，其編碼的蛋白與細(xì)菌和真菌的質(zhì)膜Na+/H+逆向運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白非常相似，也是一種質(zhì)膜Na+/H+逆向運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白，它在植物的耐鹽機(jī)制中擔(dān)任重要作用。
盡管所有植物都有大量Na+流入細(xì)胞，但是鹽生植物和甜土植物都需把胞質(zhì)內(nèi)的Na+保持在非毒性水平。鹽敏感植物(甜土植物)主要依賴質(zhì)膜排Na+，而一些鹽生植物可將大量Na+積累于液泡中。Na+在液泡中的區(qū)隔化為消除Na+在細(xì)胞質(zhì)中的不利影響提供了一個(gè)有效機(jī)制；并且Na+(和Cl-)在液泡中的積累，還可使植物利用其作為滲透劑，來保持滲透勢(shì)以驅(qū)動(dòng)水分進(jìn)入細(xì)胞。Na+運(yùn)輸?shù)揭号菔怯梢号軳a+/H+逆向運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白調(diào)節(jié)的；而液泡的H+移位酶即H+-ATPase和H+-PPiase產(chǎn)生跨液泡膜的H+電化學(xué)勢(shì)梯度，提供液泡Na+/H+逆向運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白以驅(qū)動(dòng)力。擬南芥和水稻中的液泡膜Na+/H+逆向運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白基因AtNHX1和OsNHX1的克隆及其功能研究，均證實(shí)了液泡Na+/H+逆向運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白在植物耐鹽方面起著非常重要的作用，并且AtNHX1和OsNHX1的表達(dá)受到NaCl濃度調(diào)節(jié)。
已知的Na+/H+逆向運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白主要存在于細(xì)菌、酵母和植物中。高等植物中已經(jīng)克隆到的Na+/H+逆向運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白主要有AtNHX1、OsNHX1、SOS1，它們都與植物耐鹽有關(guān)。其中，AtNHX1、OsNHX1編碼液泡膜Na+/H+逆向運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白，而SOS1編碼質(zhì)膜Na+/H+逆向運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白。有證據(jù)表明，酵母的解毒機(jī)制與植物很相似，因而，酵母中運(yùn)輸?shù)鞍椎蔫b定及其功能的確定可作為模式系統(tǒng)，幫助我們了解植物中的同源基因。啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)在堿性條件下排Na+主要依靠質(zhì)膜上的Na+-ATPase系統(tǒng)(由ENA1-ENA4基因編碼)，其直接利用水解ATP的能量把Na+泵出細(xì)胞；在酸性條件下，啤酒酵母排Na+主要依靠質(zhì)膜上的Na+/H+逆向運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白(由NHA1基因編碼)。酵母中已經(jīng)克隆的質(zhì)膜上的Na+/H+逆向運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白還包括SOD2(Schizosaccharomyces pombe)、Z-SOD2和Z-SOD22(Zygosaccharomycesrouxii)。NHX1是從啤酒酵母中克隆的一個(gè)負(fù)責(zé)Na+區(qū)隔化的基因，即液泡膜Na+/H+逆向運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白，胞內(nèi)pH值的降低，即跨液泡膜的H+梯度的增加會(huì)激活該基因的表達(dá)，從而驅(qū)動(dòng)Na+的區(qū)隔化。大腸桿菌中也發(fā)現(xiàn)了三種Na+/H+逆向運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白，它們分別是NhaA、NhaB、ChaA。另外，NhaP為假單孢桿菌(Pseudomonas aeruginosa)中的質(zhì)膜Na+/H+逆向運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白；SynNhaP則是低等植物藍(lán)藻(Synechocystis Species PCC 6803)中的質(zhì)膜Na+/H+逆向運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白。
擬南芥基因組測(cè)序鑒定出與啤酒酵母ScNHX1非常相似的AtNHX1，這是第一批克隆的植物Na+/H+逆向運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白基因，過量表達(dá)AtNHX1的轉(zhuǎn)基因植株能夠在200mMNaCl存在時(shí)生長(zhǎng)，生理生化研究也表明其在植物的耐鹽性中意義重大。第一次直接檢測(cè)到液泡Na+/H+逆向運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白活性是在甜菜貯藏組織的液泡膜囊泡中。自那以后，利用核磁共振和丫啶橙熒光猝滅技術(shù)，已在許多植物中發(fā)現(xiàn)液泡膜具有Na+、H+交換活性。一些植物液泡Na+/H+逆向運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白的表達(dá)似乎是組成型的，而另一些植物(如甜菜、冰葉日中花、大麥)液泡Na+/H+逆向運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白的活性則受高濃度NaCl的正調(diào)節(jié)。值得注意的是，Na+/H+逆向運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白活性的誘導(dǎo)非常迅速，好象是已存在的蛋白分子的激活而不是從頭合成。植物中SOS1、AtNHX1、OsNHXl基因的表達(dá)均具有組織特異性，且鹽脅迫可以增強(qiáng)它們的表達(dá)。另外一些研究結(jié)果還表明植物Na+解毒機(jī)制在根中主要是將Na+排出，而在莖葉中則是將Na+區(qū)隔化。
SynNhaP質(zhì)膜Na+/H+逆向運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白C端長(zhǎng)的尾巴在藍(lán)藻耐鹽性中起重要作用，其中保守的Asp138在NhaP、SOS1、AtNHX1、OsNHX1、NHX1以及哺乳動(dòng)物的NHE1中都非常保守，是發(fā)揮其功能所必不可少的；SOS1和SynNhaP的跨膜區(qū)有非常顯著的序列相似性，且它們都有長(zhǎng)的C端親水尾部，因此SynNhaP的結(jié)構(gòu)和功能分析有助于對(duì)SOS1逆向運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白的了解。AtNHX1逆向運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白的81LFFIYLLPPI90序列在OsNHX1、NHX1以及哺乳動(dòng)物的NHE1中也高度保守。另外，信號(hào)傳導(dǎo)在調(diào)節(jié)Na+/H+逆向運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白活性的過程中發(fā)揮重要的作用，如Jiankang Zhu Lab發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)SOS1的SOS3/SOS2信號(hào)傳導(dǎo)途徑。
目前，酵母和植物中的Na+運(yùn)輸?shù)鞍籽芯窟M(jìn)展迅速，Na+/H+逆向運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白的數(shù)目?jī)H從不同組織、不同膜Na+的運(yùn)輸就可以得到解釋，至于特定的發(fā)育時(shí)期和特定的脅迫所需的Na+運(yùn)輸就更為復(fù)雜。但國(guó)內(nèi)外對(duì)Na+/H+逆向運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白的克隆及研究基本上限于在鹽敏感植物(甜土植物)中進(jìn)行，本發(fā)明主要體現(xiàn)真鹽植物堿蓬SsNHX1基因在其耐鹽性中的重要作用。SsNHX1逆向運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白能夠在鹽脅迫條件下有效地將Na+運(yùn)輸?shù)揭号葜校M(jìn)行區(qū)隔化以消除Na+對(duì)細(xì)胞質(zhì)中酶等的毒害。鹽地堿蓬在200mM NaCl鹽脅迫下，其葉片肉質(zhì)化程度(多汁且加厚)優(yōu)于對(duì)照，在400mM NaCl鹽脅迫下，堿蓬尚能完成生活史。相對(duì)于甜土植物的鹽適應(yīng)機(jī)制可能具有更多的保守性，鹽生植物已進(jìn)化了一些獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和調(diào)控機(jī)制以避免過多Na+對(duì)細(xì)胞的滲透脅迫和離子毒害。基于Na+/H+逆向運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白在真鹽生植物中可能起著更為有效的耐鹽作用，我們選擇了真鹽生植物堿蓬來分離克隆Na+/H+逆向運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白基因。有理由相信，隨著在各種植物中Na+/H+逆向運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白基因的克隆及其分子特征的鑒定，對(duì)其在植物耐鹽機(jī)制中的作用將會(huì)有更深刻的理解。
雖然在多種植物中已分離得到Na+/H+逆向運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白，但在堿蓬這種耐海水的鹽生植物中克隆并分離出Na+/H+逆向運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白cDNA尚屬首次。植物Na+/H+逆向運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白基因在Genbank中已注冊(cè)的有多個(gè)，但沒有檢索到堿蓬的Na+/H+逆向運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白基因。
堿蓬基因組DNA的Southern雜交結(jié)果表明，SsNHX1在堿蓬基因組中至少存在3個(gè)以上的拷貝(

圖1)。提取對(duì)照(即不用鹽處理)及分別用400mM、500mM NaCl溶液處理堿蓬48小時(shí)后的堿蓬總RNA、葉RNA及根RNA，進(jìn)行Northern印跡雜交，結(jié)果表明鹽脅迫情況下，不論是整個(gè)植株、還是其根和葉，其SsNHX1的表達(dá)量均明顯高于對(duì)照(圖2)，而且，SsNHX1在葉中的表達(dá)量也大大高于根中。說明SsNHX1基因的表達(dá)，特異性地受鹽脅迫所誘導(dǎo)且存在組織特異性表達(dá)，是鹽生植物堿蓬進(jìn)行Na+區(qū)隔化并使之獲得耐鹽性的一個(gè)重要基因。另外，相對(duì)于對(duì)照，不同濃度(0mM～400mM)NaCl脅迫下葉片和根的鮮重均有不同程度的增加，且葉片的增加量高于根的增加量(圖3)。這一結(jié)果表明盡管過量的Na+可能會(huì)對(duì)膜透性、酶活、電子運(yùn)輸、葉綠素含量、葉綠素?zé)晒獾鹊犬a(chǎn)生不利的影響，但對(duì)堿蓬的生長(zhǎng)并未產(chǎn)生影響甚至還刺激了它的生長(zhǎng)，這是由于一旦根部將Na+吸收進(jìn)胞質(zhì)，大部分的Na+將會(huì)被運(yùn)輸?shù)饺~片并區(qū)隔化于液泡中。
酵母中Na+的吸收是由液泡H+-ATPase提供能量、通過Na+/H+逆向運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白(NHX1)來實(shí)現(xiàn)的(Nass and Rao，1998；Gaxiola et al.，1999)；甜土植物擬南芥中Na+的吸收是通過Na+/H+逆向運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白經(jīng)囊泡途徑由前液泡進(jìn)入大液泡(Apse et al.，1999；Frommer et al.，1999)；對(duì)于真鹽生植物堿蓬，其Na+被運(yùn)輸?shù)饺~片并區(qū)隔化于液泡中則和另一個(gè)鹽生植物大洋洲濱藜(Atriplex gmelini)更為相似液泡膜上Na+/H+逆向運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白，經(jīng)由與其偶聯(lián)的液泡H+-ATPase提供能量、將Na+由胞質(zhì)運(yùn)往液泡(Matoh et al.，1989)。鹽脅迫下，堿蓬葉細(xì)胞液泡中Na+濃度的增加大大高于根細(xì)胞液泡中Na+濃度的增加(見圖)，且H+-ATPase和H+-焦磷酸酶這兩個(gè)酶的活性增強(qiáng)，這同兼性鹽生植物冰葉日中花中得到的結(jié)論相一致鹽脅迫下，其葉子中V-ATPase活性增強(qiáng)(Ratafczak et al.，1994；Barkla et al.，1995)，但根細(xì)胞中V-ATPase的E亞基活性不能隨Na+濃度增加而增大，甚至還有所降低，表明根中不能進(jìn)行Na+的積累，而是將Na+運(yùn)輸?shù)侥举|(zhì)部并轉(zhuǎn)移到葉中(Golldack and Dietz，2001)。SsNHX1基因的表達(dá)量受Na+濃度的正調(diào)節(jié)，與鹽脅迫下冰葉日中花(M.crystallinum)葉中的H+-ATPase亞基A、B、E、F表達(dá)量的增加也是相吻合的(Golldack and Dietz，2001)。總之，在NaCl脅迫下，H+-ATPase和H+-焦磷酸酶活性增強(qiáng)，提供質(zhì)子驅(qū)動(dòng)力，通過Na+/H+逆向運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白將Na+區(qū)隔化于液泡(Blumwald，1987)。有如此多的基因涉及到Na+的區(qū)隔化，這說明它可能是堿蓬乃至一系列鹽生植物最重要的耐鹽機(jī)制。
對(duì)SsNHX1(AF370358)與其它9個(gè)Na+/H+逆向運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白AtNHX1(AC009465)、InNHX1(AB033989)、OsNHX1(AB021878)、ScNHX1(NP-010744.1)、McNHX1(AF 279671)、ZmNHX1(AF 307944)、DmNHE3(AE 003614)、DmNHE2(AE 003669)、HsNHX1(M 81768)進(jìn)行了其譜系分析，這些Na+/H+逆向運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白分別來自堿蓬(S.Salsa)、擬南芥(A.thaliana)、牽牛花(Ipomoea nil)、水稻(Oryza sativa)、啤酒酵母(S.Cerevisaiae)、冰葉日中花(Mesembryanthemum crystallinum)、玉米(Zea mays)、果蠅(Drosophilia melanogaster)和人(Homo sapiens)。通過譜系分析，發(fā)現(xiàn)冰葉日中花和堿蓬親緣關(guān)系最近，均起源于甜土植物，而不是酵母(圖4)。疏水域診斷法(hydropathyplot)分析(Hofmann和Stoffel，1993)顯示出SsNHX1的疏水域，SsNHX1疏水域值由TMPRED軟件計(jì)算(http//www.ch.embnet.org/software/TMPRED form html)。通過TMPRED軟件，還推測(cè)出SsNHXI有12個(gè)跨膜區(qū)域(圖5)。根據(jù)其它Na+/H+逆向運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白的原初拓?fù)淠Ｐ秃吞腔稽c(diǎn)推斷出SsNHX1的N端糖基化位點(diǎn)為Asn-49、-292和-367三個(gè)殘基，其位置同人的NHE1 N-端糖基化位點(diǎn)相一致(Counillon et al.，1994)。
在已知SsNHX1逆向運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白cDNA序列的情況下，可根據(jù)該序列設(shè)計(jì)引物從其它物種中克隆分離SsNHX1基因，用SsNHX1基因，進(jìn)行轉(zhuǎn)化得到的轉(zhuǎn)化體能產(chǎn)生一系列的表型。在異源宿主細(xì)胞中尤其在微生物中產(chǎn)生SsNHX1蛋白，其獨(dú)特的表達(dá)系統(tǒng)和有調(diào)控序列的表達(dá)載體能使該基因進(jìn)行高水平的表達(dá)。在細(xì)胞中過量表達(dá)該基因可用來制備抗體，這可有效地對(duì)植物體中的SsNHX1進(jìn)行原位雜交檢測(cè)，也可在離體細(xì)胞的提取液中檢測(cè)SsNHX1的存在。一些情況下，SsNHX1蛋白的產(chǎn)生可以被鹽脅迫所誘導(dǎo)，因而在植物體中表達(dá)外源SsNHX1基因可以產(chǎn)生耐鹽的轉(zhuǎn)基因植株。SsNHX1的轉(zhuǎn)基因植株，將會(huì)大大降低鹽脅迫對(duì)植物體造成的毒害，同時(shí)也能明顯提高植物在鹽脅迫條件下的生長(zhǎng)能力。目前，用SsNHX1基因改造甜土植物，使其在液泡中積Na+、增強(qiáng)其耐鹽性，已成為植物耐鹽基因工程的又一新思路。
這項(xiàng)發(fā)明涉及到的堿蓬Na+/H+逆向運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白(SsNHX1)中間cDNA片段的克隆、5’端cDNA片段的克隆(5’-RACE)、3’端cDNA片段的克隆(3’-RACE)、全長(zhǎng)cDNA片段的克隆方法以及基本的DNA重組技術(shù)等具體實(shí)驗(yàn)方法可參見《分子克隆》(Sambrook等，1989)和《5’RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends，Version 2.0》(GibcobrlInstruction Manual)，所涉及到的堿蓬中編碼SsNHX1的核苷酸片段的序列及相關(guān)的多肽已在序列表中列出，其中SEQ ID NO1編碼SsNHX1 cDNA的全長(zhǎng)核苷酸序列；SEQ ID NO2編碼SsNHX1 cDNA中開放閱讀框架的一段核苷酸序列；SEQ ID NO3對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO.2中核苷酸序列的氨基酸序列；SEQ ID NO4原核表達(dá)載體中插入了一段含有SsNHX1 cDNA的核苷酸序列；SEQ ID NO5植物雙元表達(dá)載體中插入了一段含有SsNHX1 cDNA的核苷酸序列。為了明確地進(jìn)行說明，本說明書帶有附圖，以下是附圖的簡(jiǎn)要說明圖1表示以該發(fā)明得到的SsNHXI基因片段為探針與基因組DNA的Southem雜交結(jié)果；圖2表示以該發(fā)明得到的SsNHXI基因片段為探針與不同處理的堿蓬RNA的Northern雜交結(jié)果；圖3表示NaCl脅迫下堿蓬葉和根中的Na含量；圖4表示該發(fā)明得到的堿蓬Na/H逆向運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白(SsNHX1)譜系分析；圖5表示堿蓬SsNHX1疏水域及跨膜區(qū)域分析；圖6表示原核表達(dá)載體pBV221的多克隆位點(diǎn)；圖7表示真核表達(dá)載體pROKII的多克隆位點(diǎn)；圖8表示克隆載體KS的多克隆位點(diǎn)；圖9 pCAMBIA 1300載體的多克隆位點(diǎn)。以下是本發(fā)明的實(shí)施事例實(shí)施例1 堿蓬SsNHX1中間cDNA片段、5’端cDNA片段、3’端cDNA片段、全長(zhǎng)cDNA的克隆以及測(cè)序鑒定總RNA的提取以鹽地堿蓬幼苗地上部分組織為材料，使用TRIzol試劑、按TRIzol試劑提供的方法進(jìn)行堿蓬總RNA的提取。
跨膜區(qū)域(中間)cDNA片段的克隆反轉(zhuǎn)錄使用RNA-PCR Kit(AMV)，從10μg總RNA中，于42℃ 1小時(shí)，70℃ 10分鐘，進(jìn)行cDNA第一鏈的合成；根據(jù)其它植物NHX1保守的跨膜區(qū)域設(shè)計(jì)一對(duì)引物N-R(5’-CCNCCNATHATHTTYAAYGCNGG-3’)和C-F(5’-YTANGCCATNAGCATCAT-3’)，以該引物進(jìn)行RT-PCR，得到約0.5kb的片段；取新鮮的RT-PCR產(chǎn)物2μl，將其克隆到PCR-TOPO載體中；從含有卡那霉素(25mg/L)的培養(yǎng)基上挑取白斑(單克隆)，提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)(以M13Forward和M13Reverser引物)、并經(jīng)EcoRI酶切驗(yàn)證；以標(biāo)準(zhǔn)的M13測(cè)序引物進(jìn)行序列測(cè)定。
5’-RACE以總RNA為模板，使用SsNHX1特異引物N-R-1(5’-GAATGATACCAATGTACCAACG-3’)，進(jìn)行cDNA第一鏈的合成；再以5’-RACE Kit中的純化系統(tǒng)進(jìn)行cDNA的純化；使用TdT和dCTP，對(duì)純化cDNA的3’端加上同聚尾C；以5’-RACE系統(tǒng)中提供的錨定引物(5’-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGG-3’)和SsNHX1特異引物N-R-2(5’-ATGTACCAACGGCTCCAAAC-3’)，對(duì)加了同聚尾C的cDNA進(jìn)行PCR；將上一輪PCR產(chǎn)物稀釋100倍后取5μl為模板，以SsNHX1特異引物N-R-3(5’-TCACCTGAAACCCCGCATTG-3’)和引物AUAP(5’-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3’)，再進(jìn)行一次潮式PCR，得到5’RACE產(chǎn)物，即約0.7kb的片段，將其克隆到PCR-TOPO載體中并測(cè)序。
3’-RACE由于mRNA的3’端帶有PolyA尾巴，所以，首先用帶有Oligo-dT的引物(5’-GCTCTAGATAATACGACTCACTATAGGGTTTTTTTTTTTT-3’)，以總RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA第一鏈；對(duì)cDNA第一鏈進(jìn)行純化；以純化后的cDNA為模板，分別使用引物T7q(5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’)同C-F-1(5’-TGCAAGCACTCTGCTTGGAG-3’)、C-F-2(5’-TTGGAGCAGTGACTGGCTTG-3’)和C-F-3(5’-TGGAAGGCATTAACTGACCG-3’)進(jìn)行兩輪或三輪潮式PCR，最后獲得1.3kb的3’-RACE片段，將其克隆到PCR-TOPO載體中并測(cè)序。
SsNHX1全長(zhǎng)cDNA片段的克隆以對(duì)應(yīng)于cDNA片段5’端和3’端的序列設(shè)計(jì)引物SN-F(5’-TATCTGAGAGCAGTCACTTGCG-3’)和SN-R(5’-TAGTTTCTGCACCAACTGCCTC-3’)，以總RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，即得到全長(zhǎng)cDNA，其長(zhǎng)度約2.4kb，將其克隆到pMD18載體中測(cè)序，并進(jìn)行序列分析。實(shí)施例2 堿蓬SsNHX1 cDNA的BLAST同源性分析及與其它Na+/H+逆向運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白的同源性線形比較。
采用BLAST同源性分析，鑒定出編碼堿蓬SsNHX1的cDNAs。BLAST(網(wǎng)址為www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)是在BLAST“nr”數(shù)據(jù)庫(kù)中(包括所有非冗余GenBank CDS、具有三維結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)的序列、SWISS-PROT蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)、EMBL及DDBJ數(shù)據(jù)庫(kù))進(jìn)行同源性搜尋的一種方式。BLASTX(Gish，W.and States，D.J.1993，Nature Genetics3266-272)是NCBI(National Center of Biology Information)提供的一種將核甘酸序列的6種翻譯序列與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較的一種方式。P值(probability)是被查尋cDNA序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中的某一序列相比較的同源性程度，P值越大，其二者的同源性就越大。通過BLASTX同源性比較，得知SsNHX1氨基酸序列與McNHXI1有88％的同源性，與AtNHXI1和OsNHX1的同源性在67％-68％之間。
SsNHX1氨基酸序列與其它物種中的Na+/H+逆向運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白(NHXs)氨基酸序列的也進(jìn)行了線形比較。序列的線形排列使用Clustalx軟件，且每個(gè)序列的線形排列均從N端開始。這些代表性的Na+/H+逆向運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白分別來自S.Salsa(SsNHX1)、A.thaliana(AtNHX1)、Ipomoeanil(InNHX1)、Oryza sativa(OsNHX1)、S.cerevisaiae(ScNHX1)。SsNHX1氨基酸序列與AtNHX1、InNHX1(AB033989)、OsNHX1、ScNHX1氨基酸序列的比較結(jié)果見表1。從表1還可以看出真核生物Na+/H+逆向運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白的跨膜區(qū)域高度保守；SsNHX1推測(cè)的跨膜區(qū)域同其它的Na+/H+逆向運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白(AtNHX1、OsNHX1和NHX1)的跨膜區(qū)域具有高度的相似性；而且，SsNHX1中的87LFFIYLLPPI92序列在AtNHX1、OsNHX1、NHX1以及哺乳動(dòng)物NHE中也高度保守；哺乳動(dòng)物NHE1中的這個(gè)結(jié)構(gòu)域是作為amiloride結(jié)合位點(diǎn)而鑒定的，且該結(jié)構(gòu)域與amiloride的結(jié)合可抑制真核生物的Na+、H+交換；另外，SsNHX1也存在C末端親水尾部。表1 SsNHX1氨基酸序列與其它物利中的Na+/H+逆向運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白(NHXs)氨基酸序列的線形比較SsNHXI ------MLSQLSSFFASKMDMVSTSDHASVVS----------------------------AtNHXI ------MLDSL----VSKLPSLSTSDHASVVA----------------------------InNHXI ------MAFGLSS--LLQNSDLFTSDHASVVS----------------------------OsNHXI ------MGMEVAA--ARLGALYTTSDYASVVS----------------------------ScNHXI MLSKVLLNIAFKVLLTTAKRAVDPDDDDELLPSPDLPGSDDPIAGDPDVDLNPVTEEMFS: ...* .::.
SsNHXI ---MNLFVALLRGCIVIGHLLEEN--RWMNESITALLIGLSTGIIILLISGGKSSHLLVFAtNHXI ---LNLFVALLCACIVLGHLLEEN--RWMNESITALLIGLGTGVTILLISKGKSSHLLVFInNHXI ---MNLFVALLCACIVLGHLLEEN--RWVNESITALIIGLCTGVVILLLSGGKSSHLLVFOsNHXI ---INLFVALLCACIVLGHLLEEN--RWVNESITALIIGLCTGVVILLMTKGKSSHLFVFScNHXI SWALFIMLLLLISALWSSYYLTQKRIRAVHETVLSIFYGMVIGLIIRMSPGHYIQDTVTF: ::: ** ..: .: * :: * ::*:: ::: *: *: * : ... ..*SsNHXI SEDLFFIYLLPPIIFNAGFQVKKKQFFRNFITIILFGAVGTLVSFIIISLG-SIAIFQLMAtNHXI SEDLFFIYLLPPIIFNAGFQVKKKQFFRNFVTIMLFGAVGTIISCTIISLG-VTQFFKKLInNHXI SEDLFFIYLLPPIIFNAGFQVKKKQFFVNFMTIMLFGAIGTLISCSIISFG-AVKIFKHLOsNHXI SEDLFFIYLLPPIIFNAGFQVKKKQFFRNFMTITLFGAVGTMISFFTISIA-AIAIFSRMScNHXI NSSYFFNVLLPPIILNSGYELNQVNFFNNMLSILIFAIPGTFISAVVIGIILYIWTFLGL... ** ******:*:*::::: :** *:::* :*. **::* *.: * :
SsNHXI DIGSLELGDLLAIGAIFAATDSVCTLQVLNQ-DETPLLYSLVFGEGVVNDATSVVLFNAIAtNHXI DIGTFDLGDYLAIGAIFAATDSVCTLQVLNQ-DETPLLYSLVFGEGVVNDATSVVVFNAIInNHXI DIDFLDFGDYLAIGAIFAATDSVCTLQVLSQ-DETPLLYSLVFGEGVVNDATSVVLFNAIOsNHXI NIGTLDVGDFLAIGAIFSATDSVCTLQVLNQ-DETPFLYSLVFGEGVVNDATSIVLFNALScNHXI ESIDISFADAMSVGATLSATDPVTILSIFNAYKVDPKLYTIIFGESLLNDAISIVMFETC. . *...**..*** **.. * **...***..****.*.*..
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SsNHXI QNFDLTHIDHRIAFQFGGNFLYLFFASTLLGAVTGLLSAYVIKKLYFGRHSTDREVALMMAtNHXI QSFDLTHLNHEAAFHLLGNFLYLFLLSTLLGAATGLISAYVIKKLYFGRHSTDREVALMMInNHXI QSFDMTSFDPKIGLHFIGNFLYLFLSSTFLGVGIGLLCAYIIKKLYFGRHSTDREVALMMOsNHXI QNFDLVHIDAAVVLKFLGNFFYLFLSSTFLGVFAGLLSAYIIKKLYIGRHSTDREVALMMScNHXI QKFHGQPATFSSVFEGAGLFLMTFSVSLLIGVLIGILVALLLKHTHIRRYP-QIESCLIL*.*. :. * *: * * ::*. *:: * ::*: :: *:. : * .*::
SsNHXI LMAYLSYMLAELFYLSGILTVFFCGIVMSHYTWHNVTESSRVTTKHAFATLSFVAEIFIFAtNHXI LMAYLSYMLAELFDLSGILTVFFCGIVMSHYTWHNVTESSRITTKHTFATLSFLAETFIFInNHXI LMSYLSYIMAELFYLSGILTVFFCGIVMSHYTWHNVTESSRVTTRHSFATLSFVAETFIFOsNHXI LMAYLSYMLAELLDLSGILTVFFCGIVMSHYTWHNVTESSRVTTKHAFATLSFIAETFLF
ScNHXI LIAYESYFFSNGCHMSGIVSLLFCGITLKHYAYYNMSRRSQITIKYIFQLLARLSENFIF*::* **:::: :***::::****.:.**:::*::. *::* :: * *: ::* *:*SsNHXI LYVGMDALDIEKWRFVS---DSPGTSVAVSSILLGLHMVGRAAFVFPFAFLMNLS-----AtNHXI LYVGMDALDIDKWRSVS---DTPGTSIAVSSILMGLVMVGRAAFVFPLSFLSNLA-----InNHXI LYVGMDALDIEKWKFVK---NSQGLSVAVSSILVGLILVGRAAFVFPLSFLSNLA-----OsNHXI LYVGMDALDIEKWEFAS---DRPGKSIGISSILLGLVLIGRAAFVFPLSFLSNLT-----ScNHXI IYLGLELFTEVELVYKPLLIIVAAISICVARWCAVFPLSQFVNWIYRVKTIRSMSGITGE:*:*:: : : . *: :: : : . ::: . : .::
SsNHXI KKSNSEKVTFNQQIVIWWAGLMKSAVSVALAYNQFSRSGHTQLRGNAIMITSTITVVLFSAtNHXI KKNQSEKINFNMQVVIWWSGLMRGAVSMALAYNKFTRAGHTDVRGNAIMITSTITVCLFSInNHXI KKNSSDKISFRQQIIIWWAGLMRGAVSIALAYNKFTTSGHTSLHENAIMITSTVTVVLFSOsNHXI KKAPNEKITWRQQVVIWWAGLMRGAVSIALAYNKFTRSGHTQLHGNAIMITSTITVVLFSScNHXI NISVPDEIPYNYQMMTFWAG-LRGAVGVALALGIQGEYKFTLLAT--VLVVVVLTVIIFG: ::: :. *:: :*:* ::.**.:***. . * : :::. .:** :*.
SsNHXI TMVFGLLTKPLIL---------------FMLPQPKH-FTSAS------TVSDLGSP----AtNHXI TVVFGMLTKPLIS---------------YLLPHQN---ATTS------MLSDDNTP----InNHXI TVVFGLMTKPLIN---------------LLLPPHKQMPSGHSSM----TTSEPSSP----OsNHXI TMVFGMMTKPLIR---------------LLLP-----ASGHP------VTSEPSSP----ScNHXI GTTAGMLEVLNIKTGCISEEDTSDDEFDIEAPRAINLLNGSSIQTDLGPYSDNNSPDISI. *::* * .*: .:*SsNHXI KSFSLPLLEDRQDSEADLGNDDEEAYPRGTIARPT---------SLRMLLNAPTHTVHHYAtNHXI KSIHIPLLD--QDSFIEPSGNHN-------VPRPD---------SIRGFLTRPTRTVHYYInNHXI KHFTVPLLDNQPDSESDMITGPE-------VARPT---------ALRMLLRTPTHTVHRYOsNHXI KSLHSPLLTSMQGSDLESTTN---------IVRPS---------SLRMLLTKPTHTVHYYScNHXI DQFAVSSNKNLPNNISTTGGNTFGGLNETENTSPNPARSSMDKRNLRDKLGTIFNSDSQW. : . .. .*:* * .: :
SsNHXI WRRFDDYFMRPVFGGRGFVPFVPGSPTEQSITNFVTENISAtNHXI WRQFDDSFMRPVFGGRGFVPFVPGSPTERNPPDLSKA---InNHXI WRKFDDSFMRPVFGGRGFVPFVAGSPVEQSPR--------OsNHXI WRKFDDALMRPMFGGRGFVPFSPGSPTEQSHGGR------ScNHXI FQNFDEQVLKPVFLDN--VSPSLQDSATQSPADFSSQNH-::.**: .::*:* .. *.... :.實(shí)施例3 嵌合基因在微生物中的表達(dá)在微生物細(xì)胞中過量表達(dá)SsNHX1基因，可以得到大量的SsNHX1蛋白。首先，構(gòu)建原核表達(dá)框架對(duì)該基因所在的原始質(zhì)粒選擇合適的酶切位點(diǎn)，同時(shí)對(duì)原核表達(dá)載體進(jìn)行同樣的酶切消化，將基因片段正向插入消化后的載體，用連接酶連接。連接產(chǎn)物用來轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株XLI-Blue(Escherichia.coli XLI-Blue，Stratagene)，轉(zhuǎn)化體用相同的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切驗(yàn)證，或者用適當(dāng)?shù)囊镞M(jìn)行PCR驗(yàn)證。本發(fā)明涉及到的原核表達(dá)載體是pBV221熱激表達(dá)載體(多克隆位點(diǎn)圖譜見圖6)，先用PstI單切pBV221載體，用T4 DNA聚合酶將其削為平端，再用BamHI酶切，回收載體大片段；對(duì)克隆到的含SsNHX1基因的重組質(zhì)粒(KSSX)用BamHI和XbaI雙酶切，回收2.4kb左右的基因片段；用T4 DNA連接酶于16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株XLI-Blue，得到pBV221重組質(zhì)粒。提取蛋白，經(jīng)10％SDS-PAGE凝膠電泳分析，結(jié)果出現(xiàn)一條特異的61.2KD左右的蛋白條帶，推測(cè)該帶為表達(dá)的外源SsNHX1蛋白。在該項(xiàng)實(shí)施中，也可利用其它的原核表達(dá)載體進(jìn)行重組轉(zhuǎn)化，均可獲得大量表達(dá)的SsNHX1蛋白；外源SsNHX1蛋白可以用來制備抗體，從而有效地對(duì)生物體中的SsNHX1進(jìn)行原位雜交檢測(cè)。實(shí)施例4 嵌合基因在雙子葉植物中的表達(dá)全世界鹽漬化荒地近10億公頃，我國(guó)總鹽漬化土壤面積超過8000萬公頃，因此，培育耐鹽作物品種以開發(fā)利用鹽荒地，對(duì)于我國(guó)這樣一個(gè)耕地資源十分有限的人口大國(guó)而言，具有極其重要的戰(zhàn)略意義。植物雙元表達(dá)載體包括右邊界區(qū)、nos啟動(dòng)子、NPTII報(bào)告基因、nos終止子、35S啟動(dòng)子、左邊界區(qū)，外源基因與花耶菜花葉病毒的35S啟動(dòng)子相連。本實(shí)驗(yàn)所涉及到的植物表達(dá)載體為pROKII(多克隆位點(diǎn)圖譜見圖7)；為使外源基因正向插入pROKII載體，先將基因片段克隆到KS載體，再利用KS多克隆位點(diǎn)(多克隆位點(diǎn)圖譜見圖8)上的KpnI和SacI位點(diǎn)，雙酶切下外源片斷并正向插入pROKII載體的相應(yīng)位點(diǎn)，連接反應(yīng)在16℃下過夜，連接產(chǎn)物用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切驗(yàn)證。將pROKII重組質(zhì)粒用三親雜交法(Ruvkin and Ausubel，1981，Nature28985-88)轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌(Agrobacterium)菌株LBA4404(Hoekemaetal.1983，Nature 303179-180)在28℃YEB培養(yǎng)基中培養(yǎng)農(nóng)桿菌細(xì)胞，在37℃LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)供體細(xì)胞，然后在沒有抗生素的YEB培養(yǎng)基中混合這兩種細(xì)胞，于28℃過夜培養(yǎng)，在含有抗生素的LB平板上劃線，用堿裂解法提質(zhì)粒驗(yàn)證。另外，也可用葉盤轉(zhuǎn)化法(Horsch et al.1985，Science2271229-1231)或原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法(Van den Elzen et al.1985，Plant Mol.Biol，5149-154)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植株的構(gòu)建。利用這些方法使SsNHX1 cDNA轉(zhuǎn)入黃瓜、番茄等蔬菜及其它雙子葉植物，通過篩選抗卡那霉素轉(zhuǎn)化體得到具有一定抗逆性的轉(zhuǎn)基因植株，使其在鹽漬地帶或用海水灌溉的土壤中能夠正常生長(zhǎng)。實(shí)施例5.嵌合基因在單子葉植物中的表達(dá)單子葉植物的轉(zhuǎn)化體系不同于雙子葉植物，常采用基因槍直接注射法將基因擊到植物的葉片里。也可利用pCAMBIA 1300載體系統(tǒng)(多克隆位點(diǎn)圖譜見圖9)通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的直接轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行轉(zhuǎn)化，它具有雙元載體的一切優(yōu)點(diǎn)。用KpnI和SalI分別酶切原始質(zhì)粒和pCAMBIA 1300載體，T4 DNA連接酶將外源片段與載體片段于16℃下反應(yīng)過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404。這樣構(gòu)建的重組體包括目的片段和相應(yīng)的啟動(dòng)子，利用葉盤轉(zhuǎn)化法，將SsNHX1 cDNA轉(zhuǎn)化一些農(nóng)作物如水稻、玉米、小麥等谷類作物，可以得到耐逆的轉(zhuǎn)基因植株。另外，也可以使用基因槍轉(zhuǎn)化法，將SsNHX1 cDNA直接轉(zhuǎn)化草坪類植物，從而獲得耐鹽脅迫的草坪植株。
序列表(1)一般信息(a)申請(qǐng)人山東師范大學(xué)(b)發(fā)明人張荃 趙彥修 馬秀玲 孫宇飛 張慧(c)發(fā)明名稱鹽地堿蓬(Suaeda salsa)Na+/H+逆向運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白(SsNHX1)全長(zhǎng)cDNA(d)序列數(shù)目2397堿基對(duì)(e)通信地址*地址山東師范大學(xué)生物系*街道文化東路88號(hào)*城市濟(jì)南*國(guó)家中國(guó)*郵編250014(f)本申請(qǐng)數(shù)據(jù)*申請(qǐng)日2001.7*分類 C07K(g)通訊信息*電話0531-2960864*傳真0531-2966954(2)SEQ ID NO1的信息(a)序列特征*長(zhǎng)度2397堿基對(duì)*類型核酸*鏈型雙鏈*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型cDNA(c)最初來源鹽地堿蓬(d)序列描述SEQ ID NO11GTTTTTTATG TTCTTCTTTT TCTGGAGTTG AATTGATTGA TTGTGGCTAT CTGAGAGCAG61 TCACTTGCGC ATGCAATTGA ATTTGCATGC TGAATGATTT CTGAAGGTCT TGTGGTGGAC121 AGTGAAGAGA CAGATTTCAC AAAGATTATT GGACTTCAGA AGTTTGATTT TGTGGAGCTA181 GAAAGGGTTT CACATACATT GGACATTAAT TTACTTGAAT ATATATATAT TTGTTGTGGG241 TCTTGGATTC GGGTGCACAA AGAAATAGGT GAACAATGTT GTCACAGTTG AGCTCTTTTT301 TTGCAAGTAA GATGGACATG GTTTCGACGT CTGATCATGC TTCCGTTGTT TCGATGAATT361 TGTTTGTGGC ACTGTTACGT GGCTGCATTG TAATTGGTCA TCTTCTCGAA GAGAATCGCT421 GGATGAATGA ATCCATTACA GCTTTGCTAA TAGGTTTATC TACTGGGATT ATAATCCTGC481 TAATTAGTGG AGGAAAGAGT TCGCATTTGT TGGTCTTCAG TGAAGATCTT TTCTTTATAT541 ACCTCCTTCC ACCGATTATA TTCAATGCGG GGTTTCAGGT GAAAAAGAAG CAATTTTTCC601 GCAACTTCAT TACTATTATT TTGTTTGGAG CCGTTGGTAC ATTGGTATCA TTCATAATCA661 TATCTCTTGG TTCAATAGCT ATATTTCAAA AGATGGATAT TGGTTCGCTG GAGTTAGGGG721 ATCTTCTTGC AATTGGTGCA ATATTCGCTG CAACTGATTC AGTTTGCACA TTGCAAGTGC
781 TTAATCAAGA TGAGACTCCA CTTCTTTATA GTCTCGTGTT TGGTGAAGGT GTCGTCAATG841 ATGCTACATC AGTGGTGTTG TTCAATGCAA TTCAAAACTT TGACCTCACG CACATTGACC901 ACAGAATTGC CTTCCAATTT GGTGGCAACT TTCTATATTT ATTTTTTGCA AGCACTCTGC961 TTGGAGCAGT GACTGGCTTG CTAAGCGCTT ATGTCATCAA AAAGTTGTAC TTTGGAAGGC1021 ATTCAACTGA CCGTGAGGTA GCCTTAATGA TGCTTATGGC TTATCTATCG TACATGCTTG1081 CTGAACTCTT CTATCTGAGC GGAATTCTTA CAGTATTCTT CTGTGGGATT GTCATGTCCC1141 ATTATACATG GCACAATGTG ACGGAGAGCT CCAGAGTAAC CACCAAGCAT GCTTTTGCAA1201 CACTCTCTTT TGTAGCTGAG ATCTTCATCT TTCTATATGT TGGTATGGAT GCACTGGATA1261 TTGAGAAGTG GAGATTTGTG AGCGATAGTC CTGGAACATC TGTTGCTGTG AGTTCCATAC1321 TGCTTGGTCT TCACATGGTT GGGCGAGCTG CTTTTGTTTT TCCCTTCGCC TTTTTAATGA1381 ACTTGTCCAA GAAATCAAAT AGTGAGAAGG TCACCTTCAA TCAGCAGATA GTCATTTGGT1441 GGGCTGGTCT CATGAAAAGT GCTGTCTCCG TGGCACTTGC TTATAATCAG TTTTCAAGGT1501 CAGGACACAC ACAGCTGAGG GGAAATGCAA TCATGATTAC AAGCACCATA ACCGTTGTCC1561 TTTTCAGTAC GATGGTATTT GGGTTGCTGA CAAAGCCTCT TATACTCTTT ATGTTGCCTC1621 AACCGAAACA TTTCACTAGT GCAAGCACCG TGTCAGATTT GGGGAGTCCA AAGTCATTCT1681 CCTTGCCTCT TCTTGAAGAT AGACAAGATT CTGAAGCTGA TTTGGGCAAC GATGATGAAG1741 AAGCCTACCC CCGTGGGACT ATAGCTCGAC CTACTAGTCT TCGTATGCTA CTAAATGCAC1801 CAACTCACAC TGTCCATCAT TATTGGCGCA GATTCGATGA TTATTTCATG CGGCCTGTAT1861 TTGGTGGCCG GGGTTTTGTA CCTTTTGTCC CAGGTTCACC CACCGAACAG AGCATCACTA1921 ATTTTGTCAC AGAGAACATA AGTTAGCGAT AATTGAGGCA GTTGGTGCAG AAACTAATAA1981 CTTACAGCCC TACAGGCAAT CTACAAAGAC AAAAAATGCC CTTACCCAAG AACGAACAGC2041 CCGGTGTTTG GTCTCGTGGG CTTGATGTTA AGACTGTGCT GTACTTCTGT TAATAGAGAG2101 TAAGTTACAG AAACCACCGA TTTAAACATA TCTGTAATTT TTTACAGCAT GGATATTCGA2161 TGCATTCTTT AATCTGGCTG TAGCTAGAAT ACTCTAGCAT GTTTTGTAGT TTCAGTCTTA2221 CCATTTAGGT TTTCTCCTAC ATAACCTCAA TAAGCTGTTT AGTGTGCTTA CTGCTTACTT2281 TAGAGCAAAC TGCAACTGTG AAAATTGCTT ACGTCAGCGG CACCTGTGTA ATTTATCATT2341 TTTATAATGA TGGAGCATGA TCATTTGCAA TCAAATTTAC AATACTGTGA TTAAAAA(3)SEQ ID NO2的信息(a)序列特征*長(zhǎng)度1668堿基對(duì)*類型核酸*鏈型雙鏈*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型cDNA(c)最初來源鹽地堿蓬(d)序列描述SEQ ID NO21ATGTTGTCAC AGTTGAGCTC TTTTTTTGCA AGTAAGATGG ACATGGTTTC GACGTCTGAT61 CATGCTTCCG TTGTTTCGAT GAATTTGTTT GTGGCACTGT TACGTGGCTG CATTGTAATT121 GGTCATCTTC TCGAAGAGAA TCGCTGGATG AATGAATCCA TTACAGCTTT GCTAATAGGT181 TTATCTACTG GGATTATAAT CCTGCTAATT AGTGGAGGAA AGAGTTCGCA TTTGTTGGTC241 TTCAGTGAAG ATCTTTTCTT TATATACCTC CTTCCACCGA TTATATTCAA TGCGGGGTTT301 CAGGTGAAAA AGAAGCAATT TTTCCGCAAC TTCATTACTA TTATTTTGTT TGGAGCCGTT361 GGTACATTGG TATCATTCAT AATCATATCT CTTGGTTCAA TAGCTATATT TCAAAAGATG
421 GATATTGGTT CGCTGGAGTT AGGGGATCTT CTTGCAATTG GTGCAATATT CGCTGCAACT481 GATTCAGTTT GCACATTGCA AGTGCTTAAT CAAGATGAGA CTCCACTTCT TTATAGTCTC541 GTGTTTGGTG AAGGTGTCGT CAATGATGCT ACATCAGTGG TGTTGTTCAA TGCAATTCAA601 AACTTTGACC TCACGCACAT TGACCACAGA ATTGCCTTCC AATTTGGTGG CAACTTTCTA661 TATTTATTTT TTGCAAGCAC TCTGCTTGGA GCAGTGACTG GCTTGCTAAG CGCTTATGTC721 ATCAAAAAGT TGTACTTTGG AAGGCATTCA ACTGACCGTG AGGTAGCCTT AATGATGCTT781 ATGGCTTATC TATCGTACAT GCTTGCTGAA CTCTTCTATC TGAGCGGAAT TCTTACAGTA841 TTCTTCTGTG GGATTGTCAT GTCCCATTAT ACATGGCACA ATGTGACGGA GAGCTCCAGA901 GTAACCACCA AGCATGCTTT TGCAACACTC TCTTTTGTAG CTGAGATCTT CATCTTTCTA961 TATGTTGGTA TGGATGCACT GGATATTGAG AAGTGGAGAT TTGTGAGCGA TAGTCCTGGA1021 ACATCTGTTG CTGTGAGTTC CATACTGCTT GGTCTTCACA TGGTTGGGCG AGCTGCTTTT1081 GTTTTTCCCT TCGCCTTTTT AATGAACTTG TCCAAGAAAT CAAATAGTGA GAAGGTCACC1141 TTCAATCAGC AGATAGTCAT TTGGTGGGCT GGTCTCATGA AAAGTGCTGT CTCCGTGGCA1201 CTTGCTTATA ATCAGTTTTC AAGGTCAGGA CACACACAGC TGAGGGGAAA TGCAATCATG1261 ATTACAAGCA CCATAACCGT TGTCCTTTTC AGTACGATGG TATTTGGGTT GCTGACAAAG1321 CCTCTTATAC TCTTTATGTT GCCTCAACCG AAACATTTCA CTAGTGCAAG CACCGTGTCA1381 GATTTGGGGA GTCCAAAGTC ATTCTCCTTG CCTCTTCTTG AAGATAGACA AGATTCTGAA1441 GCTGATTFGG GCAACGATGA TGAAGAAGCC TACCCCCGTG GGACTATAGC TCGACCTACT1501 AGTCTTCGTA TGCTACTAAA TGCACCAACT CACACTGTCC ATCATTATTG GCGCAGATTC1561 GATGATTATT TCATGCGGCC TGTATTTGGT GGCCGGGGTT TTGTACCTTT TGTCCCAGGT1621 TCACCCACCG AACAGAGCAT CACTAATTTT GTCACAGAGA ACATAAGT(4)SEQ ID NO3的信息(a)序列特征*長(zhǎng)度556個(gè)氨基酸*類型氨基酸*鏈型單鏈*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型肽(c)最初來源鹽地堿蓬(d)序列描述SEQ ID NO31 M L S Q L S S F F A S K M D M V S T S D21 H A S V V S M N L F V A L L R G C I V I41 G H L L E E N R W M N E S I T A L L I G61 L S T G I I I L L I S G G K S S H L L V81 F S E D L F F I Y L L P P I I F N A G F101 Q V K K K Q F F R N F I T I I L F G A V121 G T L V S F I I I S L G S I A I F Q L M141 D I G S L E L G D L L A I G A I F A A T161 D S V C T L Q V L N Q D E T P L L Y S L181 V F G E G V V N D A T S V V L F N A I Q201 N F D L T H I D H R I A F Q F G G N F L221 Y L F F A S T L L G A V T G L L S A Y V241 I K K L Y F G R H S T D R E V A L M M L
261 M A Y L S Y M L A E L F Y L S G I L T V281 F F C G I V M S H Y T W H N V T E S S R301 V T T K H A F A T L S F V A E I F I F L321 Y V G M D A L D I E K W R F V S D S P G341 T S V A V S S I L L G L H M V G R A A F361 V F P F A F L M N L S K K S N S E K V T381 F N Q Q I V I W W A G L M K S A V S V A401 L A Y N Q F S R S G H T Q L R G N A I M421 I T S T I T V V L F S T M V F G L L T K441 P L I L F M L P Q P K H F T S A S T V S461 D L G S P K S F S L P L L E D R Q D S E481 A D L G N D D E E A Y P R G T I A R P T501 S L R M L L N A P T H T V H H Y W R R F521 D D Y F M R P V F G G R G F V P F V P G541 S P T E Q S I T N F V T E N I S
權(quán)利要求
1.一種分離純化的編碼Na+/H+逆向運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白(SsNHX1)cDNA的核苷酸片段，包括(a)編碼氨基酸序列的核苷酸片段，其特征是具有SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ IDNO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5所示的序列，(b)與(a)互補(bǔ)的核苷酸片段；
2.權(quán)利要求1中的核苷酸片段與相應(yīng)的原核表達(dá)載體構(gòu)成的重組質(zhì)粒；
3.權(quán)利要求1中的核苷酸片段與相應(yīng)的真核表達(dá)載體構(gòu)成的重組質(zhì)粒；
4.一個(gè)大腸桿菌細(xì)胞，其特征是，權(quán)利要求2中的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化該細(xì)胞；
5.一個(gè)農(nóng)桿菌細(xì)胞，其特征是，權(quán)利要求3中的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化該細(xì)胞；
6.一個(gè)雙子葉植物細(xì)胞，其特征是，權(quán)利要求5中的農(nóng)桿菌細(xì)胞轉(zhuǎn)化該植物細(xì)胞；
7.一個(gè)單子葉植物細(xì)胞，其特征是，權(quán)利要求5中的農(nóng)桿菌細(xì)胞轉(zhuǎn)化該植物細(xì)胞，或者利用基因槍直接轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化該植物細(xì)胞；
8.一種使SsNHX1基因在宿主細(xì)胞中過量表達(dá)的方法，包括(a)權(quán)利要求2和3中的質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的方法，(b)一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的方法，(c)一種利用基因槍的直接轉(zhuǎn)化法；
9.一種獲得編碼Na+/H+逆向跨膜運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白(SsNHX1)cDNA的核苷酸片段的方法(a)SsNHX1中間cDNA、5’端cDNA、3’端cDNA以及全長(zhǎng)cDNA的克隆方法。(b)SsNHX1中間cDNA、5’端cDNA、3’端cDNA以及全長(zhǎng)cDNA克隆的序列測(cè)定方法。(c)SsNHX1中間cDNA、5’端cDNA以及3’端cDNA BLAST同源性分析以確定SsNHX1的方法。
全文摘要
該發(fā)明名稱是鹽地堿蓬(Suaedasalsa)Na
文檔編號(hào)C12N15/05GK1357626SQ0112356
公開日2002年7月10日 申請(qǐng)日期2001年8月2日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月2日
發(fā)明者張荃, 趙彥修, 馬秀玲, 孫宇飛, 張慧 申請(qǐng)人:山東師范大學(xué)