專利名稱：一種新型白果蛋白的制備和表征方法
技術領域：
本發明涉及一種新型白果蛋白的制備方法，尤其是白果蛋白的提取分離和結構表征技術。背景技術：
蛋白質是兩性物質，在不同的pH值環境下可解離為正離子和負離子，而且具有各自的等電點。而使蛋白質穩定的基本因素是它分子表面的水化層與同性電荷的作用，若破壞這些因素即可促使蛋白質顆粒相互聚集而沉淀，這就是蛋白質鹽析、等電點沉淀和有機溶劑分離沉淀法的基本原理。蛋白質按其溶解度分類可分為(I)清蛋白，溶于水及稀鹽、稀酸或稀堿溶液，為飽和硫酸銨所沉淀；(2)球蛋白，溶于稀鹽溶液，為半飽和硫酸銨所沉淀；(3)谷蛋白，不溶于水、醇及中性鹽溶液，但易溶于稀酸或稀堿；(4)醇溶谷蛋白，不溶于水及無水乙醇，但溶于70 80%乙醇中；(5)組蛋白，溶于水及稀酸，但為稀氨水所沉淀，分子呈堿性；(6)魚精蛋白，溶于水及稀酸，不溶于氨水；(7)硬蛋白，這類蛋白一般是動物體內做為結締及保護功能的蛋白質，不溶于水、鹽、稀酸或稀堿。蛋白質按其結構和構象的不同可分為兩大類，即纖維狀蛋白質和球狀蛋白質兩大類。然后用適當的溶劑進行提取。如清蛋白可選擇用水和鹽溶液，球蛋白用鹽溶液，組蛋白和谷蛋白等不溶于水或鹽的可選擇用稀酸或稀堿溶液。在提取的過程中，考慮到蛋白質受溫度的影響會變性，一般選擇常溫攪拌提取、低溫減壓提取、超聲波和微波輔助提取等。當獲得蛋白質混合物提取液后，想要將所要的蛋白質與其它雜質初步分離開來，一般采用鹽析等電點沉淀和有機溶劑分級分離等方法。同時可采用離子交換層析、凝膠過濾、吸附層析以及親和層析等。必要時還可選擇電泳法，膜過濾分級的方法。銀杏樹(Ginkgo Biloba L.)是落葉喬木中雌雄異株的裸子植物,原產于中國，素有“活化石”，“植物界的熊貓”之稱。白果在我國食用、藥用歷史已有3000年之久。近十幾年來，對銀杏白果蛋白的研究取得了一定的進展。Uwe等在1989年從白果中分離出一種類似豆球蛋白的物質。牛衛寧等報道了從白果中提取得到的蛋白具有抗菌作用。黃文等應用不同的提取方法，分離出白果清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和堿溶蛋白等，發現白果中的蛋白質主要以清蛋白和球蛋白為主，其中白果清蛋白具有抗氧化和延緩衰老等作用。鄧乾春等分離出一種新蛋白GAPIIa并對其進行氨基酸殘基分析，指出氨基酸組成為脂肪族氨基酸殘基占33. 21% (共90個)，芳香族氨基酸殘基占7. 38% (共20個)，羥基氨基酸殘基與含硫氨基酸殘基占26. 57% (共72個)，酸性氨基酸殘基及其酰胺占23. 61% (共64個)，堿性氨基酸殘基占6. 27% (共17個)。經證實GAP具有較明顯的抗生物氧化活性。黃文等采用Halliwell方法對白果中不同蛋白清除羥基自由基(.OH)的能力進行了測定，相應的抑制率為清蛋白(50. 84% )、球蛋白(24. 09% )、醇溶蛋白(45. 78% )、堿溶蛋白(41. 33% )。鄧乾春等探討白果清蛋白(GAP)對正常小鼠的免疫調節作用。由于白果蛋白具有很好的藥食價值，隨著我國銀杏種植業規模的擴大，白果產量日益增加，需要開發具有高新技術含量的白果蛋白深加工產品。本發明專利重點研究白果蛋白質提取和分離方法，制備一種新型白果蛋白，為銀杏產業的發展提供技術。

發明內容
技術問題蛋白質在提取分離過程中受外界因系影響會變性，本發明的技術難點在于提取白果蛋白的過程中保持蛋白的結構不變，制備高純度的蛋白質，分離鑒定新型結構蛋白質。技術方案本發明公開了一種新型白果蛋白的制備和表征方法，新鮮白果經脫脂和減壓沸騰提取，分離富集蛋白beltl、蛋白belt2和蛋白belt3三個蛋白帶。為了實現本技術方案，本發明具體步驟如下第一步新鮮白果在-10°C至_50°C下冷凍干燥，除去外殼和內衣，將果仁粉碎，得到含水重量百分比小于6%、粒度在10目-50目的白果粗粉。第二步用非極性溶劑與白果粗粉按質量比例4-30 I (g/g)加入到脫脂釜萃取0. 5 10小時，萃取溫度-10°C至80°C，過濾，濾渣在室溫通風下干燥，制備脫脂白果粉。第三步將脫脂白果粉加入到0. 1-0. 50mol/L NaCl鹽溶液減壓沸騰提取5 30min，提取溶劑pH8-9，提取溫度20°C -75 °C，脫脂白果粉與提取劑質量體積比例為1:3-1: 30 (g/ml)，提取次數2-6次，合并提取液。第四步將鹽溶液提取液采用40% -80%硫酸銨溶液兩次沉淀，沉淀時間3_24h，pH 5-7，濾液經過不同孔徑膜切割分離分子量10 000 Da 30 000 Da的蛋白質溶液，-10°C至_50°C下冷凍干燥制備高純度白果蛋白粉。第五步用DEAE-Cellulose樹脂對白果蛋白粉進行純化。白果蛋白粉與去離子水質量體積比例為I 3-1 50 (g/ml)，用緩沖液pH 7. 0-9. 5的0. 1-1. 5mol/L NaCl溶液洗脫樹脂，洗脫下來的蛋白質樣品經過電泳分析，得到蛋白質樣品由分子量為21. 4KDa、17. 9KDa和15. 8KDa譜帶組成。第六步將DEAE-Cellulose樹脂洗脫液經過葡聚糖凝膠G純化，分離得到蛋白beltl、蛋白belt2和蛋白belt3三個蛋白帶。第七步采用電泳技術及MALDI-T0F-T0F質譜技術對純化的蛋白beltl、蛋白belt2和蛋白belt3三個蛋白帶進行一級結構表征，分離鑒定新型白果蛋白。第八步采用17種氨基酸標準品做外標對照，建立HPLC氨基酸的分析方法，分析新型白果蛋白中氨基酸的組成和相對含量。本發明采用電泳技術及MALDI-T0F-T0F質譜技術對純化的蛋白質進行一級結構的分析。MALDI-T0F-MS質譜分析儀(Applied Biosystems)緩沖溶液采用l/15mol/LNaHPO4, l/15mol/L KH2PO4,以不同的比例配制不同pH值的樣品緩沖液。pH = 3. 5，pH = 4，pH = 4. 5, pH = 5，pH = 5. 5，pH = 6，pH = 6. 5，pH = 7. 0, pH = 7. 5，pH = 8. 0, pH = 8. 5，pH = 9. 0的樣品緩沖液。分析條件UV激光，355nm下200Hz的重復率，20KV電壓，質量分辨率為I 500Da，采用胰蛋白酶消化肌紅蛋白做為儀器內部校正。MS檢測限為100ppm，MS/MS檢測限為0. 6Da ;在此條件下獲得的樣品質譜峰使用4700Explore Software (AppliedBiosystems)在默認模式下進行分析，數據結果由GPS Explore (V3. 6)提供的MASC0T(2. I)搜索引擎進行分析比對，參數設置如下=NCBI (美國國立生物信息中心)數據庫；蛋白分子質量范圍700 3 200 Da ;胰蛋白酶消化；蛋白匹配度(protein scores)大于59或MS/MS的離子匹配度(ion score)大于30為顯著(P < 0. 05)。本發明電泳marker標準曲線以14. 4KD marker條帶為基線,量取每個條帶到基線的距離，并以此為橫坐標X，分子量為縱坐標Y，繪制標準曲線方程Y = 4. 8312X+14. 4，R2 = O. 8746。本發明分離富集蛋白beltl、蛋白belt2和蛋白belt3三個蛋白帶。其特征在于蛋白 beltl 由分子量分別為 m/z 1408. 65,1663. 94,1823. 86,2064. 99 和 2208. 08 五條肽段組成的球蛋白llS-globulin，通過NCBI數據庫進行同源性蛋白質分析，匹配到蛋白質gi/949869 (Iegumin)，分子量為51418，等電點(pi) 8. 69。蛋白belt2為新蛋白，由分子量m/z 2131和m/z :2338肽段組成，m/z :2131肽段的精確序列為I/L S A I/L T A D I/LGNff Q/KD S P G I/L R, m/z :2338 肽段的精確序列為 AAQ/KVDSSSDVYASD N I/L P G G N R0 蛋白 belt3 為分子量分別為 1605、1913、2053、2242 和 2355 五 5 個肽段組成，通過NCBI通過NCBI數據庫進行同源性蛋白質分析，匹配到的蛋白是beltl蛋白和 belt2蛋白混合物。本發明蛋白beltl、蛋白belt2和蛋白belt3三個蛋白帶的一級結構解析如

圖1-7.beltl蛋白的質譜利用MALDI-T0F-T0F質譜對條帶I蛋白進行肽段測序，如圖1，共獲得近50條肽段，選取離子強度較大的5個肽段1409、1664、1824、2065和2208進行MS/MS分析，通過BLAST(蛋白質序列對比工具)將獲得的這5條肽段序列提交NCBI數據庫進行同源性蛋白質分析，匹配到蛋白質gi/949869 (Iegumin)，llS-globulin,匹配度121,分子量為51.418KDa，等電點(pl)8.69。MASCOT顯示此種蛋白質全序列如表I所示，下劃線部分是匹配到的序列組，占全序列的38%。表Ibeltl的蛋白全序列
NO.氨基酸序列 Amino acid sequence
IMEKQTTLLILLVCLLFSIQCFTSNAREAEVERRQREQLQQSCRFDRLNAQ
51EPTQRITSEGGSVELLNVEDSEQFQCAGVAPLRETLNPNALSLPRYTNTP
101TMAYVVEGEGRLGVVFPGCPETFQSSTSRGGEGQQSQERSQKIRRVRRGD
151VVAIPAGVAYWLYNDGNRRLQIVAIADTSNHQNQLDQTYRPFYLAGSAPS
201GAQKAAGATSIGDNILQGFDTDTLAEAMGISQDTARRIQQNQKKGLIVKV
251ERGLRMPGPPSDDYEREREREGNNVEEFYCSMRL畫ADDSEDADVYVRN
301GGRLNTVNRLKLPALRSLRLGAERGILQPNAMFAPSWLNAHAVMYVTRGQ
351GRIQIVQNEGRRVFDGAVKEGQFLVIPQLHAIAKQAGKDGLEWISFTTSD
401SPIRSTLTGRNSVLKAMPQEVVMNAYRINGKDARDLRRNREHETIILSPT
451PQHQQPRAIEbe 112蛋白的質譜
belt2經胰蛋白酶酶解，MALDI-T0F-T0F分析后得到該酶的肽指紋圖譜，如圖3，由于在MALDI條件下C端為Arg的肽離子化效率明顯高于C端的Lys肽，因而經過磺化反應后，如圖4，選擇2條離子化效率相對較高的Arg肽(肽段m/z :2131和肽段m/z :2338)進RMS/MS分析，如圖5，清晰的展出一系列離子，通過手工計算相鄰系列離子的質量差可知，肽段 m/z 2131 的的精確序列為 I/L S A I/L T A D I/L G N WQ/K D S P G I/L R，肽段m/z 2338 的精確序列為 AAQ/KVDSSSDVYASDNI/LPGGNR。be 113蛋白的質譜belt3蛋白經過MALDI-T0F-T0F分析，如圖5，獲得一系列肽段，選取離子強度較大的5個肽段1605、1913、2053、2242和2355進一步進行MS/MS分析，通過BLAST (蛋白質序列對比工具)將獲得的這5條肽段序列提交NCBI數據庫進行同源性蛋白質分析，匹配到的蛋白與beltl蛋白相同，只是匹配度稍低，為89，并且從質譜圖中得到部分峰與belt2蛋白相同，也就是說，belt3可能不是單一組分純蛋白質,而是一個混合蛋白條帶,包含beltl的一個大片段和belt2的部分片段，可能是因為蛋白的斷裂或者蛋白相互作用導致的。本發明采用電泳圖譜分析，得到蛋白質樣品由分子量不同的三個譜帶組成。其中蛋白帶beltl分子量為21. 4KDa，是蛋白質gi/949869的一個主要的肽段。belt2分子量為17. 9KDa, belt3 分子量為 15. 8KDa。如圖 6-7。本發明制備的新型白果蛋白，富含16種氨基酸，其中丙氨酸Ala、賴氨酸(Lys)和纈氨酸Val大于4.0%，天冬氨酸Asp大于6. 5%絲氨酸(Ser)大于10. 5%，組氨酸(His)大于40. 5%。本發明HPLC氨基酸分析條件鄰苯二甲醛柱前衍生，固定相C18 (0 4. 6X 50mm，5um)，流動相A:醋酸鈉溶液(內含3%。四氫呋喃)；流動相:甲醇乙腈=200 450 350，進行線性梯度洗脫。如表2 :表2鹽溶蛋白的氨基酸組成
權利要求
1.一種新型白果蛋白的制備和表征方法，其特征在于新鮮白果經脫脂和減壓沸騰提取，分離富集蛋白beltl、蛋白belt2和蛋白belt3三個蛋白帶。
2.根據權利要求I所述新型白果蛋白的制備和表征方法，其特征在于蛋白beltl由分子量分別為 m/z 1408. 65、1663. 94、1823. 86,2064. 99 和 2208. 08 五條肽段組成的球蛋白llS-globulin,通過NCBI數據庫進行同源性蛋白質分析，匹配到蛋白質gi/949869 (Iegumin)，分子量為 51418，等電點(pi) 8. 69。
3.根據權利要求I所述新型白果蛋白的制備和表征方法，其特征在于蛋白belt2為新蛋白，由分子量m/z :2131和m/z :2338肽段組成，m/z :2131肽段的精確序列為I/L SAI/LTA DI/LG N W Q/K D S P GI/L R, m/z :2338 肽段的精確序列為 AA Q/K VDSSSDVYASD NI/L P G G N R0
4.根據權利要求I所述新型白果蛋白的制備和表征方法，其特征在于蛋白belt3為分子量分別為1605、1913、2053、2242和2355五5個肽段組成，通過NCBI數據庫進行同源性蛋白質分析，匹配到的蛋白是beltl蛋白和belt2蛋白混合物。
5.根據權利要求I所述新型白果蛋白的制備和表征方法，其特征在于新型白果蛋白富含16種氨基酸，其中丙氨酸(Ala)、賴氨酸(Lys)和纈氨酸(Val)大于4.0%，天冬氨酸(Asp)大于6. 5%,絲氨酸(Ser)大于10. 5% ,組氨酸(His)大于40. 5%
6.根據權利要求I所述新型白果蛋白的制備和表征方法，其特征在于新鮮白果在-10°C至-50°C下冷凍干燥，除去外殼和內衣，將果仁粉碎，得到含水重量百分比小于6%、粒度在10目-50目的白果粗粉。再用非極性溶劑與白果粗粉按質量比例4-30 l(g/g)加入到脫脂釜萃取0. 5 10小時，萃取溫度-10°C至80°C，過濾，濾渣在室溫通風下干燥，制備脫脂白果粉。
7.根據權利要求I所述新型白果蛋白的制備和表征方法，其特征在于減壓沸騰提取是將脫脂白果粉加入到0. 1-0. 50mol/L NaCl鹽溶液減壓沸騰提取5 30min，提取溶劑PH8-9，提取溫度20°C_75°C，脫脂白果粉與提取劑質量體積比例為I : 3_1 30(g/ml)，提取次數2-6次，合并提取液。
8.根據權利要求I所述新型白果蛋白的制備和表征方法，其特征在于分離純化是將鹽溶液提取液經過40% -80%硫酸銨溶液兩次沉淀，沉淀時間3-24h，pH 5_7，濾液經過不同孔徑膜切割分離分子量10 OOODa 30 OOODa的蛋白質溶液，_10°C至_50°C下冷凍干燥制備高純度白果蛋白粉。
9.根據權利要求I所述新型白果蛋白的制備和表征方法，其特征在于分離純化是采用DEAE-Cellulose樹脂對白果蛋白粉進行純化。白果蛋白粉與去離子水質量體積比例為1:3-1: 50(g/ml)，用緩沖液pH 7. 0-9. 5的0. 1-1. 5mol/L NaCl溶液洗脫樹脂，洗脫下來的蛋白質樣品經過電泳分析，得到蛋白質樣品由分子量為21. 4KDa、17. 9KDa和15. 8KDa譜帶組成。
10.根據權利要求I所述新型白果蛋白的制備和表征方法，其特征在于分離純化是將DEAE-Cellulose樹脂洗脫液經過葡聚糖凝膠G純化,分離得到蛋白beltl、蛋白belt2和蛋白belt3三個蛋白帶。
11.根據權利要求I所述新型白果蛋白的制備方法，其特征在于新型白果蛋白采用電泳技術及MALDI-T0F-T0F質譜技術對純化的蛋白beltl、蛋白belt2和蛋白belt3三個蛋白帶進行一級結構表征。
12.根據權利要求I所述新型白果蛋白的制備方法，其特征在于新型白果蛋白富含.16種氨基酸，其中丙氨酸Ala、賴氨酸(Lys)和纈氨酸Val大于4. O %，天冬氨酸Asp大于6.5%,絲氨酸(Ser)大于10. 5%,組氨酸(His)大于40. 5%
13.根據權利要求5所述非極性溶劑，其物征為正己烷、石油醚、6號溶劑油、丙酮等溶劑中一種或幾種任意比例的混合溶劑。
全文摘要
本發明公開一種新型白果蛋白的制備和表征方法，將新鮮白果經脫脂和減壓沸騰提取，沉淀、膜分離和DEAE纖維素樹脂及葡聚糖凝膠(Sephadex)G純化蛋白質，首次分離富集蛋白belt1、蛋白belt2和蛋白belt3三個蛋白帶，分子量分別為21.4KDa、17.9KDa、15.8KDa。蛋白belt1由分子量分別為m/z1408.65、1663.94、1823.86、2064.99和2208.08五條肽段組成的球蛋白11S-globulin。蛋白belt2為新蛋白，由分子量m/z2131和m/z2338肽段組成，m/z2131肽段的精確序列為I/L S A I/L T A DI/L G N W Q/K D S P G I/L R，m/z2338肽段的精確序列為A A Q/K V D S S S D V Y A S D N I/L P G G N R。蛋白belt3為分子量分別為1605、1913、2053、2242和2355五條肽段組成。本發明制備富集的白果蛋白質含量高于90％，由16種氨基酸組成，其中丙氨酸(Ala)、賴氨酸(Lys)和纈氨酸(Val)大于4.0％，天冬氨酸(Asp)大于6.5％，絲氨酸(Ser)大于10.5％，組氨酸(His)大于40.5％。
文檔編號C07K14/415GK102617716SQ20121007934
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月23日 優先權日2012年3月23日
發明者原姣姣, 周彥, 王成章, 陳虹霞, 陳西娟 申請人:中國林業科學研究院林產化學工業研究所