專利名稱：：促創(chuàng)傷愈合因子的純化與應(yīng)用的制作方法促創(chuàng)傷愈合因子的純化與應(yīng)用本發(fā)明涉及一種血漿來源的促創(chuàng)傷愈合因子(factorforsupportingwoundhealing)的純化和應(yīng)用的方法。本發(fā)明的具體方面包括純化和在體內(nèi)和體外保護(hù)所述分子免遭降解的方法。
背景技術(shù)：
：HGF是一種促創(chuàng)傷愈合因子，它是一種在間充質(zhì)細(xì)胞(例如肺巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，肝中的枯否細(xì)胞，以及白細(xì)胞)中表達(dá)的蛋白。HGF是一種細(xì)胞因子，它在細(xì)胞損傷時(shí)分泌并殺J見出對(duì)某些器官再生和創(chuàng)傷^合是重要的。從化學(xué)角度看，HGF是一種糖蛋白，它首先以天然(無活性)的前體形式合成。該前體在受損器官中通過特定活化子被切割成活性HGF。HGF和其他一些因子與肝素結(jié)合，這似乎對(duì)HGF的激活和它與其受體的結(jié)合很重要。結(jié)合HGF的受體是c-MET。由于c-MET受體只在受損器官中被下調(diào)，所以看來只有這些受損器官中的細(xì)胞響應(yīng)于HGF-受體相互作用。具有肝素結(jié)合親和性的生長因子家族中這類影響創(chuàng)傷愈合過程的因子的實(shí)例還包括血小板衍生生長因子(Plateletderivedgrowthfactor,PDGF)，表皮生長因子(Epidermalgrowthfactor,EGF)，轉(zhuǎn)化生長因子a(Transforminggrowthfactoralpha,TGF-a)，轉(zhuǎn)^ffc生長因子P(Transforminggrowthfactorbeta,TGF-p)，胰島素樣生長因子(Insulinlikegrowthfactor,IGF-I)和成纖維細(xì)J^生長因子(Fibroblastgrowthfactor,FGF)。抗凝血酶III(AT-III)是一種血漿糖蛋白，它可以抑制凝血級(jí)聯(lián)過程中絲氨酸蛋白酶，因此，在凝血調(diào)控中起重要作用。AT-III是因子IXa、Xa、XI、XIIa和凝血酶的抑制劑。因此，AT-III在凝血級(jí)聯(lián)的不同階段調(diào)控凝塊的形成。血液中AT-III含量的輕微減少與血栓栓塞風(fēng)險(xiǎn)的增加相關(guān)。AT-III濃縮物被用于在獲得性或遺傳性AT-III缺乏患者中預(yù)防和治療血栓栓塞疾病。另外，已有報(bào)道表明AT-III還參與許多其它生物學(xué)反應(yīng)，例如血管發(fā)生和炎癥反應(yīng)。但AT-III在這些機(jī)制中的作用尚未完全弄清。以肝素作為固定相結(jié)合配基，采用親和色譜純化AT-III的方法是本領(lǐng)域已知的。Miller誦Andersson等(ThrombosisResearch5,439-452，1974)發(fā)表了使用肝素-瓊脂糖凝膠純化人AT-III的方法。包括離子交換和凝膠過濾色鐠法的整個(gè)過程提供34%的得率。富含組氨酸的糖蛋白(Histidine-richglyc叩rotein，HRGP)是一種單鏈血漿蛋白，最早于1972分離得到。HRGP確切的生理功能仍舊未知。由于它與肝素、纖維蛋白原和纖維蛋白、纖溶酶原和活化血小板的相互作用，HRGP被認(rèn)為是凝血和纖溶的調(diào)節(jié)因子(Koide，T.In:Fibrinolysis:CurrentProspects.Gaffney,PJ(Ed.),JohnLibbey&Co.,London1988，p.55-63)。該多肽鏈由507個(gè)氨基酸殘基組成，女包含與其他血漿蛋白(如AT-III)同源的區(qū)域(Koide,T.etal.(1986)Biochemistry25，2220-2225)。
發(fā)明內(nèi)容促創(chuàng)傷愈合因子的活化形式在體內(nèi)很快降解，特別是在已觸發(fā)凝血和蛋白水解體系(包含蛋白酶)的創(chuàng)傷區(qū)域里。在純化過程中，能夠抑制天然的和活化形式的促創(chuàng)傷愈合因子的降解在體外也是至關(guān)重要的。其中一種因子，HGF，已知在血液中作為無活性前體被傳輸，在創(chuàng)傷過程中被特定的活化劑所活化。例如，在幾乎所測(cè)試的所有純化方法中都可以檢測(cè)到少量無活性(變性)形式的HGF,但是，只有在使用本發(fā)明的方法時(shí)才能檢測(cè)到活化的和/或非活化的形式。令人吃驚的發(fā)現(xiàn)除去蛋白酶和/或蛋白酶前體并且共純化HGF的兩種穩(wěn)定劑(AT-III和/或HRGP)，得到富集的HGF活化和/或非活化形式，其很容易發(fā)揮作用或者可以轉(zhuǎn)化成它的活性形式。由于HGF通常在體內(nèi)以無活性前體形式循環(huán)，因此很顯然天然的和/或活性的HGF藥物產(chǎn)品可以顯著改善許多機(jī)體功能障礙的治療，特別是局部應(yīng)用可行的區(qū)域，例如，在創(chuàng)傷愈合過程中。預(yù)期對(duì)其它具有肝素結(jié)合性質(zhì)的生長因子也是如此，如血小板衍生生長因子(PDGF)、表皮生長因子(EGF)、轉(zhuǎn)化生長因子a(TGF-a)、轉(zhuǎn)化生長因子p(TGF-p)、胰島素樣生長因子(IGF-I)和成纖維細(xì)胞生長因子(FGF),同時(shí)也預(yù)期AT-III和HRGP的存在可以改善這些生長因子的純化和應(yīng)用。根據(jù)用途，可提供帶有或不帶兩種特異性穩(wěn)定劑AT-III和HRGP的所述活化和/或非活化形式的促創(chuàng)傷愈合因子，所述穩(wěn)定劑充當(dāng)促創(chuàng)傷愈合因子天然和活化形式的蛋白降解的抑制劑，因此，提高了產(chǎn)品的功效和半衰期。根據(jù)用途，在一些情況下，為患者只提供活化或非活化形式的促創(chuàng)傷愈合因子是有利的，而在另外一些情況下，提供包括所選擇的穩(wěn)定劑AT-III和HRGP在內(nèi)的其混合物是比較有利的。這取決于要求促創(chuàng)傷愈合因子分子起作用有多快。顯然，這些原則對(duì)其他一些與HGF相似的具有肝素結(jié)合性質(zhì)的生長因子也有效，例如血小板衍生生長因子(PDGF)、表皮生長因子(EGF)、轉(zhuǎn)化生長因子a(TGF-a)、轉(zhuǎn)化生長因子p(TGF-p)、胰島素樣生長因子(IGF-I)和成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)。本發(fā)明涉及從含有促創(chuàng)傷愈合因子的來源(例如血液)中制備含有純化促創(chuàng)傷愈合因子組合物的方法，其中純化步驟在存在抗凝血酶III(AT-III)、富含組氨酸的糖蛋白(HRGP)或其組合存在的情況下，施。液)的肝細(xì)胞生長因子(HepatocyteGrowthFactor,HGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、表皮生長因子(EGF)、轉(zhuǎn)化生長因子a(TGF-a)、轉(zhuǎn)化生長因子p(TGF-P)、胰島素樣生長因子(IGF-I)和成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)組成，其中所述制備過程包括在抗凝血酶III(AT-III)存在下實(shí)施的純化步驟。本發(fā)明方法可以按以下步驟實(shí)施(i)將冷凍血液解凍，最終除去沉淀并進(jìn)一步處理上清液，(ii)使上清液在陰離子交換色鐠所需緩沖液中與陰離子交換色鐠材料接觸，所述緩沖液的鹽濃度與生理?xiàng)l件相當(dāng)，其pH值約中性，大部分的蛋白質(zhì)都未被結(jié)合(包括所述促創(chuàng)傷愈合因子、AT-III、HRGP、白蛋白、IgG、轉(zhuǎn)鐵蛋白、觸珠蛋白等)，但是一些特定的蛋白質(zhì)和蛋白酶結(jié)合在陰離子樹月旨上(例如凝血酶原，F(xiàn)X，F(xiàn)IX等)；(m)將所述陰離子交換色譜材料分離出去，得到溶液(包含促創(chuàng)傷愈合因子、AT-III、HRGP、白蛋白、IgG、轉(zhuǎn)鐵蛋白、觸珠蛋白等)；(iv)使所述溶液與肝素-親和色鐠材料接觸，而大部分的蛋白質(zhì)(白蛋白，IgG，轉(zhuǎn)鐵蛋白，觸珠蛋白等)未被結(jié)合；(v)分離出所述溶液，用解吸緩沖液處理肝素-親和色鐠材料，所述解吸緩沖液具有足夠允許所述促創(chuàng)傷愈合因子從所述肝素-親和色鐠材料解吸的離子強(qiáng)度(任選地，在所述促創(chuàng)傷愈合因子級(jí)分解吸前用清洗緩沖液處理肝素瓊脂糖材料，所述清洗液具有提高的足以解吸雜質(zhì)蛋白(例如肝素輔因子II等)但是不解吸所述促創(chuàng)傷愈合因子級(jí)分的離子強(qiáng)度)；(vi)收集包含所述促創(chuàng)傷愈合因子、AT-III和HRGP的解吸緩沖液。在第二個(gè)可替代方案中，本發(fā)明的方法可采用如下步驟進(jìn)行(i)將冷凍血漿解凍，任選地除去沉淀并進(jìn)一步處理上清液，(ii)加入無機(jī)吸附材料，如硅藻土、硅膠、氧化鋁，孵育足夠的時(shí)間使之與不想要的物質(zhì)(例如FXII和激肽釋放酶原激活劑等)結(jié)合；(iii)加入低級(jí)脂肪醇，如CrQ醇，以形成科恩級(jí)分(Cohnfraction)I;(iv)除去所述無機(jī)吸附材料，以及，如果沉淀存在，還除去沉淀；(v)使科恩級(jí)分I上清液通過親和色鐠材料來對(duì)其進(jìn)行處理，由此使天然的/活性的促創(chuàng)傷愈合因子、AT-III和HRGP(天然的/活性的促創(chuàng)傷愈合因子、AT-III和HRGP，此后被稱為HAH)結(jié)合，而大部分的其它血漿蛋白(如白蛋白、IgG、轉(zhuǎn)鐵蛋白、觸珠蛋白等)保持未結(jié)合并被除去；(vi)從親和色鐠材料上洗脫并收集^M^創(chuàng)傷愈合因子的物質(zhì)(任選地，在促創(chuàng)傷愈合因子級(jí)分解吸前用清洗緩沖液處理親和樹脂，所述清洗液的離子強(qiáng)度高至足以使雜質(zhì)蛋白(如肝素輔因子II等)解吸，但是尚不能4吏促創(chuàng)傷^合因子級(jí)分解吸)。在第三個(gè)可替代方案中，本發(fā)明的方法可釆用如下步驟進(jìn)行(i)將冷凍血漿解凍，任選地除去沉淀并進(jìn)一步處理上清液，(ii)使上清^陰離子交換色鐠所需緩沖液中與陰離子交換色鐠材料接觸，所述緩沖液的鹽濃度與生理?xiàng)l件相當(dāng)，其pH值約中性，大部分的所述蛋白都未結(jié)合(包括所述促創(chuàng)傷愈合因子、AT-III、HRGP、白蛋白、IgG、轉(zhuǎn)鐵蛋白、觸珠蛋白等)，但是一些特定的蛋白質(zhì)和蛋白酶(例如凝血酶原，F(xiàn)X，F(xiàn)IX等)結(jié)合在陰離子樹脂上；(m)將所述陰離子色鐠材料分離出去，得到溶液(包含促創(chuàng)傷愈合因子、AT-III、HRGP、白蛋白、IgG、轉(zhuǎn)鐵蛋白、觸珠蛋白等)；(iv)加入無機(jī)吸附材料，如硅藻土、硅膠、氧化鋁，孵育足夠的時(shí)間使之與不想要的物質(zhì)(如FXII和激肽釋放酶原激活劑等)結(jié)合；(v)加入低級(jí)脂肪醇，如d-C4醇，形成科恩級(jí)分I;(vi)除去無機(jī)吸附材料，以及，如果沉淀存在，還除去沉淀；(vii)使科恩級(jí)分I上清液通過親和色鐠材料來對(duì)其進(jìn)行處理，由此使活性的促創(chuàng)傷愈合因子、AT-III和HRGP(HAH)結(jié)合，而大部分其它血漿蛋白(如白蛋白、IgG、轉(zhuǎn)鐵蛋白、觸珠蛋白等)保持未結(jié)合并被除去；(viii)從親和色譜材料上洗脫并收集含促創(chuàng)傷愈合因子的物質(zhì)(任選地，在促創(chuàng)傷愈合因子級(jí)分解吸前用清洗緩沖液處理親和樹脂，所述清洗液的離子強(qiáng)度高至足以使雜質(zhì)蛋白解吸，但是尚不能使促創(chuàng)傷愈合因子級(jí)分解吸)。在第四個(gè)可替代方案中，本發(fā)明的方法可采用如下步驟進(jìn)行(i)將冷凍血漿解凍，任選地除去沉淀并進(jìn)一步處理上清液，(ii)使上清液通過親和色鐠材料來對(duì)其進(jìn)行處理，由此使活性的促創(chuàng)傷愈合因子、AT-III和HRGP(HAH)結(jié)合，而大部分其它血漿蛋白(如白蛋白、IgG、轉(zhuǎn)鐵蛋白、觸珠蛋白等)保持未結(jié)合并被除去；(iii)從親和色鐠材料上洗脫并收集^l創(chuàng)傷愈合因子的物質(zhì)并對(duì)其進(jìn)行收集(任選地，在促創(chuàng)傷愈合因子級(jí)分解吸前用清洗緩沖液處理親和樹脂，所述清洗液的離子強(qiáng)度高至足以使雜質(zhì)蛋白(如肝素輔因子II等)解吸，但是尚不能使促創(chuàng)傷愈合因子級(jí)分解吸)。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述方法包括病毒滅活，其特別地在步驟(Vi)后進(jìn)行。在此方法中的病毒滅活優(yōu)選是用能夠使病毒滅活的化學(xué)物進(jìn)行處理。這樣的病毒滅活在EP-A-131740中有詳細(xì)描述，即所謂的溶劑/去污劑方法。EP-A-131740的內(nèi)容通過參考并入本文。在病毒滅活步驟之后，可實(shí)施陰離子交換色鐠法。也可實(shí)施陽離子交換色鐠法，特別是在陰離子交換色谞法之后進(jìn)行。在本發(fā)明方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，實(shí)施磷酸纖維素色語法。因?yàn)閮H僅進(jìn)行此色鐠法就足夠了，所以磷酸纖維素色譜法可能是有利的。然而，磷酸纖維素色譜法與陰離子和/或陽離子交換色鐠法結(jié)合使用也可能是有利的。通常，包含HGF的級(jí)分在允許其吸附于磷酸纖維素材料的緩沖液中上樣于磷酸纖維素基質(zhì)上。通常使用離子強(qiáng)度20.05M氯化鈉或其等同物的緩沖液實(shí)現(xiàn)HGF的洗脫。根據(jù)本發(fā)明，濃縮和/或滲濾(diafiltrate)在各個(gè)替代方法中收集的級(jí)分得到濃縮物。該濃縮物可任選地通過接觸陽離子交換填料進(jìn)行進(jìn)一步處理。用離子強(qiáng)度足夠洗脫主要包含AT-III(>90%)的級(jí)分Al的緩沖液處理所述陽離子交換材料，隨后用更高的足以洗脫被收集的所述促創(chuàng)傷愈合因子和HRGP之離子強(qiáng)度的緩沖液處理所述材料。濃縮或滲濾包含所述促創(chuàng)傷愈合因子和HRGP的級(jí)分得到級(jí)分A2。在本發(fā)明方法的第二個(gè)可替代方案中，其中向所述濃縮物添加沉淀緩沖液，過濾并用緩沖液處理所述沉淀以回收所述促創(chuàng)傷愈合因子和AT-III。可通過采用下述至少一個(gè)步驟使用陽離子交換樹脂對(duì)所得天然促創(chuàng)傷愈合因子濃縮物進(jìn)行進(jìn)一步純化，其中所述天然促創(chuàng)傷愈合因子和HRGP與所述樹脂結(jié)合(i)用緩沖液將所述促創(chuàng)傷愈合因子/HRGP級(jí)分從陽離子交換樹月旨上洗脫下來，所述緩沖液具有室溫下10-450mS/cm的電導(dǎo)率，更優(yōu)選20-200mS/cm，最優(yōu)選30-100mS/cm，(ii)色鐠過程中pH保持在6-9，尤其是6.5-8或6.75-7.25，(iii)所述樹脂的帶電基團(tuán)用約10到約100個(gè)單體單元組成的弱疏水聚合物碳鏈連接到樹脂上。更詳細(xì)地說，采用使HRGP沉淀的鹽析步驟純化所得促創(chuàng)傷愈合因子濃縮物的第二個(gè)可替代純化方法的條件包括(i)使用根據(jù)霍夫邁斯特序列(Hofmeisterseries)的鹽，優(yōu)選地選自硫酸鈉、砩酸鈉、檸檬酸鈉、硫酸銨及其組合；(ii)所述鹽濃度選自0.3-3M，特別地選自0.5-2M或0.75-1.5M的范圍內(nèi)；(iii)所述溶液的pH選自4-10，特別地選自6-9或7-8的范圍；(iv)通過過濾或離心除去所得沉淀。為了提供可以商業(yè)化的促創(chuàng)傷愈合因子級(jí)分，處理所得天然促創(chuàng)傷愈合因子濃縮物以減少病原體，其中包括至少下述一種方法(i)用溶劑去垢劑溶液進(jìn)行病毒滅活；(ii)用光照(例如UVC)或輻射處理進(jìn)行病毒滅活；(iii)用熱處理進(jìn)行病毒滅活；(vi)用病毒濾器除去病毒。本發(fā)明的主題還有可根據(jù)本發(fā)明方法獲得的組合物，其包含活化和/或非活化形式的倡/fi，J傷愈:合因子，活性形式的促創(chuàng)傷1^合因子或其組合。'，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物含有所述活化形式和/或非活外的穩(wěn)定性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物含有所述活化形式和/或非活化形式的促創(chuàng)傷愈合因子，并且HRGP也已包含在內(nèi)以增加天然促創(chuàng)傷愈合因子在體內(nèi)和體外的穩(wěn)定性。特別地，所述促創(chuàng)傷愈合因子是完全活化的，或者是非活化的。向含有所述促創(chuàng)傷愈:合因子和HRGP的級(jí)分中添加選自糖類和M酸中的穩(wěn)定劑可以是有利的。通常，所述穩(wěn)定劑可以是多元醇(polyole)、精氨酸、海藻糖、賴氨酸、甘露醇或其組合。本發(fā)明的主題還包括包含本發(fā)明組合物的藥物組合物。本發(fā)明的藥物組合物可以以活化和/或非活化形式的所述促創(chuàng)傷愈合因子或其組合存在，其優(yōu)選是液體或凍干形式并且通常局部施用，其混合于凝膠、噴霧劑等中，劑量方案大致是1-10納克促創(chuàng)傷愈合因子/平方厘米創(chuàng)傷/天。還可以使用下述一種或多種方法施用(取決于用途)所述組合物靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、^L^、鞘內(nèi)或者經(jīng)直腸。實(shí)驗(yàn)方法AT-III的定量測(cè)定測(cè)定AT-III作為肝素輔因子活性的生物活性(IU/ml)，其是通過監(jiān)測(cè)在肝素和AT-III存在下凝血酶對(duì)發(fā)色底物H-D-Phe-Pip-Arg-pNA.2HC1(Chromogenix，Sweden)的切割進(jìn)行的。參見Frantzenhandelandetal.(Scand.J.Haematol.31，427-436，1983)和VanVoorhuizenetal.(Thromb.Haemostas.52(3),350-353，1984).總蛋白通過測(cè)量280nm(A28())下的吸光度測(cè)定總蛋白濃度，使用系數(shù)6.4IU/mg計(jì)算AT-III溶液的濃度(mg/ml)。AT-III的比活性定義為以IU/ml計(jì)的肝素輔因子活性與A280之間的比值。富含組氨酸的糖蛋白的定量測(cè)定使用火箭電泳技術(shù)對(duì)HRGP進(jìn)行定量測(cè)定，其中"火箭"的高度正比于抗原濃度(Laurell,C-B，(1966)Analyt.Biochem.Vol.15,p.45;Laurell，C國B(1972)J.Clin.Lab.Invset.Vol.29，suppl.124，P.21)。HRGP兔抗體(Behringwerke)加入到1%的瓊脂糖A凝膠中(AmerchamPharmaciaBiotech)。將HRGP樣品(5jd)上樣于所述凝膠，電泳過夜(150V,1V/cm)。將所得的抗原-抗體復(fù)合物染色，并與標(biāo)準(zhǔn)品(人血清)進(jìn)行比較。等電聚焦根據(jù)Phast手冊(cè)分離技術(shù)文件No.100(附帶圖片)，在PhastSystem(AmershamPharmaciaBiotech)上使用預(yù)制膠，pi3-9,進(jìn)行等電聚HGF的鑒定進(jìn)行Westernblot分析以確定具有該細(xì)胞因子特征性的多種功能的完整HGF的可獲得性。因此，在還原和非還原條件下進(jìn)行SDS-PAGE。將通過電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素片上的蛋白質(zhì)與市售抗人HGFIgG(R&DSystems,Inc.)和市售經(jīng)綴合的二抗(R&DSystems,Inc.)—起孵育，所述二抗對(duì)于前一抗體具有特異性。通過顯色反應(yīng)顯示所述抗原(蛋白質(zhì))。HGF的定量測(cè)定使用設(shè)計(jì)用于測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液、血清及血漿中HGF水平的市售固相ELISA(R&DSystems,Inc.)測(cè)定天然HGF的相對(duì)質(zhì)量值。HGF特異性單克隆抗體被預(yù)包被在微孔板(microplate)上。將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品滴加至孔中，任何存在的HGF被固定化的抗體結(jié)合。洗掉所有未結(jié)合物質(zhì)后，將HGF特異性酶聯(lián)多克隆抗體加入到孔中。隨后洗去所有未結(jié)合的抗體-酶試劑，將底物溶液加入到孔中，顯色，其與最初步驟中HGF結(jié)合的量成正比。終止顯色后，使用微孔板讀數(shù)器在450nm下測(cè)定每孔的光密度。HGF的生物學(xué)活性通過使用市售的創(chuàng)傷愈合、遷移和增殖測(cè)定來測(cè)定生物活性。參見B.Raffertyetal(J.Immunol.Methods258(2001)1-11)。實(shí)施例實(shí)施例1根據(jù)本發(fā)明，在AT-III和HRPG穩(wěn)定下純化天然(活性)HGF。歩驟l將來源于健康供體的匯集的新鮮冷凍血漿(1,200kg)在O'C解凍，通過離心移出所得的冷沉淀(包含例如因子VIII和纖連蛋白)。所述沉淀通常用于FVIII的進(jìn)一步純化。步驟2使所得的冷上清(來自步驟1)通過陰離子交換柱(70升DEAE-SepharoseFF，AmershamPharmaciaBiotech)進(jìn)行處理以結(jié)合微生素K依賴蛋白(因子IX，因子X，因子II,蛋白C，蛋白S等)。用含0.14M氯化鈉和5mM磷酸鈉pH7.0的緩沖液清洗所述柱。未結(jié)合的蛋白級(jí)分(約1,270kg)進(jìn)一步進(jìn)入步驟3中進(jìn)行處理，而對(duì)所述結(jié)合于柱中的蛋白進(jìn)一步處理以純化FIX、凝血酶等。步驟3通過加入乙醇至8%(v/v)的終濃度進(jìn)一步處理來自步驟2的未結(jié)合蛋白級(jí)分中以得到科恩級(jí)分I沉淀，其包含例如纖維蛋白酶原和脂蛋白(Cohnetal.(1946)J.Am.Chem.Soc.68，459-475)。加入乙醇前，在溶液中加入5.5kg磋藻土材料(HyflowSupereel)。通過離心除去沉淀和珪藻土。步驟4將科恩級(jí)分I上清液(大約1,400kg)pH值調(diào)至7.8，然后通過親和色鐠柱(120升肝素畫SepharoseFF,AmershamPharmaciaBiotech)進(jìn)行處理，其中天然(活性)HGF、AT-III和HRGP(HAH)結(jié)合，而大部分的其它血漿蛋白(白蛋白，IgG等)穿過所述柱。用600kg緩沖液(0.4M氯化鈉和0.01M褲酸鈉，pH7.8)對(duì)所述柱進(jìn)行清洗以除去無活性形式的蛋白，再用500kg緩^液(2.3M氯化鈉和0.01M的磷酸鈉，pH7.8)洗脫HAH級(jí)分。濃縮所得HAH洗脫液并使用超濾膜(Biomax-10,Millipore)和0.05M、pH7.5的褲酸鈉對(duì)其進(jìn)行滲濾。所得經(jīng)滲濾的HAH濃縮物被稱作UFl。實(shí)施例2根據(jù)本發(fā)明，在AT-III和HRPG穩(wěn)定下純化天然(活化和/或非活化)HGF。步驟l將來源于健康供體的匯集的新鮮冷凍血漿U，200kg)在0'C解凍，通過離心移出所得的冷沉淀(包含因子VIII和纖維連接蛋白)。所述沉淀通常用于FVIII的進(jìn)一步純化。歩驟2通過加入乙醇至8%(v/v)的終濃度處理來自步驟1的冷上清得到科恩級(jí)分I沉淀，其包含例如纖維蛋白酶原和脂蛋白(Cohnetal.(1946)J.Am.Chem.Soc.68，459-475)。加入乙醇前，在溶液中加入5.5kg硅藻土材料(HyflowSupereel),攪拌1-2小時(shí)。通過離心除去沉淀和珪藻土歩驟3將科恩級(jí)分I上清液(大約1,400kg)pH值調(diào)至7.8，然后通過親和色鐠柱(120升Heparin-SepharoseFF，AmershamPharmaciaBiotech)進(jìn)行處理，其中天然(活性)HGF、AT-III和HRGP(HAH)結(jié)合，而大部分其它血漿蛋白(白蛋白，IgG等)穿過所述柱。用600kg緩沖液(0.4M氯化鈉和0.01M褲酸鈉，pH7.8)對(duì)所述柱進(jìn)行清洗以除去無活性形式的蛋白，再用500kg緩斗液(2.3M氯化鈉和0.01M磷酸鈉，pH7.8)洗脫HAH級(jí)分。濃縮所述HAH洗脫液并使用超濾膜(Biomax-lO,Millipore)和0.05M，pH7.5的褲酸鈉對(duì)其進(jìn)行滲濾。所得經(jīng)滲濾的HAH濃縮物被稱作UF1。實(shí)施例3天然HGF的進(jìn)一步純化，以除去AT-III此方法在室溫下(+22'C)進(jìn)行，實(shí)施例1或2中所得的UF1濃縮物(人28。=23.6;圖1，泳道l)用蒸餾水1+3稀釋。使稀釋后的溶液(2050g，電導(dǎo)率2.6mS/cm)通過色鐠柱(PharmaciaBiotechBioprocessColumn,直徑15cm)進(jìn)行處理，所述柱裝填Fractogel⑧EMDSO3-650(M)陽離子交換色譜介質(zhì)(1.71)，介質(zhì)用pH7.5，電導(dǎo)率2.6mS/cm的10mM杵檬酸鈉溶液平衡。流速為91/h。在蛋白溶液上樣之后，用7倍體積的平衡緩沖液清洗色鐠柱。未被吸附到所述柱的物質(zhì)與所述清洗液混合(14.6kg，稱作"級(jí)分A1，，；圖1，泳道2)。用1.9kg緩沖液(1MNacl/10mM檸檬酸鈉，pH7.5,電導(dǎo)率106mS/cm)洗脫更強(qiáng)吸附的蛋白。對(duì)洗脫液(1.9kg)進(jìn)行濃縮并且用pH7.0的0.11\1檸檬酸鈉/1%蔗糖進(jìn)行滲濾。所得"A2，，含有活性HGF和HRGP(表1和圖1,泳道3)。表1.根據(jù)本發(fā)明的AT-III和HGF/HRGP級(jí)分的分離<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>實(shí)施例5為了研究AT-III和/或HRGP對(duì)HGF最佳回收率的重要性，進(jìn)行了下列實(shí)驗(yàn)A.如實(shí)施例2(步驟1到3)中所實(shí)施的流經(jīng)肝素-瓊脂糖色譜柱的級(jí)分用于進(jìn)行進(jìn)一步制備。然后，在不含HGF、活性AT-III和HRGP的此級(jí)分中加入HGF，但不加入AT-III和HRGP。在經(jīng)溶劑去垢劑(solventdetergent,SD)處理(Octoxynol，TnBP)后，過濾(4吏用0.45jim孔徑的濾器)所述溶液，然后上樣于Q-SepharoseXL柱(陰離子交換樹脂)。用pH7.0，20mMTris/HCl溶液(女也用于除去SD試劑)清洗柱后，用含0.2M氯化鈉的pH7.0,20mMTris/HCl緩沖液洗脫結(jié)合蛋白。此洗脫液上樣于FractogelEMDS03-柱。在清洗步驟后，用10mM檸檬酸鈉pH5.5和1M氯化鈉進(jìn)行洗脫。B.純化步驟與A中所描述的相同，只是在加入了HGF的溶液中加入純4t的AT-III。結(jié)果對(duì)從A和B操作中獲得的不同級(jí)分進(jìn)行的評(píng)價(jià)表明，來自操作B的洗脫液的兩個(gè)色鐠過程的步驟得率明顯高于AT-III不存在時(shí)色譜過程的得率，特別是FractogelEMDSOr色鐠過程。HGF步驟的得率至少是AT-III不存在情況下的兩倍。值得注意的是，AT-III不存在時(shí)，在洗脫液之外的級(jí)分中也檢測(cè)到HGF，然而在操作B的清洗級(jí)分中和柱穿過液中檢測(cè)不到HGF的存在，而其在洗脫液中得到了濃縮。總之，這些結(jié)果證明，AT-III的存在明顯提高了HGF的得率。特別是對(duì)于此處使用的陰離子和陽離子交換色鐠。實(shí)施例6根據(jù)實(shí)施例5，對(duì)實(shí)施例2中的肝素-瓊脂糖柱洗脫液和UF1(即包含HGF、AT-III和HRGP)進(jìn)行SD處理，過濾(0.45jim)并上樣于磷酸纖維素柱，所述柱用1mM的磷酸緩沖液pH6.0進(jìn)行清洗。用含1M氯化鈉的磷酸緩沖液進(jìn)行HGF的洗脫。通過該色鐠過程，除去了SD試劑，并實(shí)現(xiàn)了HGF的進(jìn)一步純化，相比于粗制品，HGF的方法步驟得率大于50%。權(quán)利要求1.一種從含有促創(chuàng)傷愈合因子的來源如血液中制備含有純化的促創(chuàng)傷愈合因子之組合物的方法，所述促創(chuàng)傷愈合因子選自:肝細(xì)胞生長因子(HGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、表皮生長因子(EGF)、轉(zhuǎn)化生長因子α(TGF-α)、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)、胰島素樣生長因子(IGF-I)和成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)，其中所述制備方法包括在抗凝血酶III(AT-III)存在下實(shí)施的純化步驟。2.權(quán)利要求l的方法，其包括如下步驟(i)將冷凍血液解凍，最終除去沉淀并進(jìn)一步處理上清液；(ii)使上清液在陰離子交換色鐠所需緩沖溶液中與陰離子交換色鐠材料接觸，所述緩沖液中的鹽濃度與生理?xiàng)l件相當(dāng)，其pH值約為中性；(m)將所述陰離子交換色鐠材料分離出去，得到溶液；(iv)使所述溶液與肝素-親和色鐠材料接觸；(v)分離出所述溶液，用解吸緩沖液處理肝素-親和色諳材料，所述緩沖液具有足以允許所述促創(chuàng)傷愈合因子從所述肝素-親和色鐠材料上解吸下來的離子強(qiáng)度；(vi)收集包含所述促創(chuàng)傷愈合因子、AT-III和HRGP的所述解吸緩沖液。3.權(quán)利要求l的方法，其包括如下步驟(i)將冷凍血漿解凍，任選地除去沉淀并進(jìn)一步處理上清液；(ii)加入無機(jī)吸附材料，如硅藻土、硅膠、氧化鋁，孵育足夠的時(shí)間使之與不想要的物質(zhì)結(jié)合；(iii)加入低級(jí)脂肪醇，如d-Q醇，以形成科恩級(jí)分I;(iv)除去無機(jī)吸附材料，以及，如果沉淀存在，還除去沉淀；(v)使科恩級(jí)分I上清液通過親和色譜材料來對(duì)其進(jìn)行處理，由此使所述促創(chuàng)傷愈合因子、AT-III和HRGP(HAH)結(jié)合，而其它血漿蛋白未結(jié)合并被除去；(vi)從親和色i普材料上洗脫并收集所述促創(chuàng)傷愈合因子。4.權(quán)利要求l的方法，其包括如下步驟(i)將冷凍血漿解凍，任選地除去沉淀并進(jìn)一步處理上清液；(ii)使上清液在陰離子交換色鐠所需緩沖液中與陰離子交換色鐠材料接觸，所述緩沖液鹽的濃度與生理?xiàng)l件相當(dāng)，其pH值約中性，大部分的蛋白質(zhì)(包括所述促創(chuàng)傷愈合因子、AT-III、HRGP、白蛋白、IgG、轉(zhuǎn)鐵蛋白、觸珠蛋白等)未結(jié)合，但是一些特定蛋白和蛋白酶結(jié)合在陰離子樹脂上(例如凝血酶原，F(xiàn)X，F(xiàn)IX等)；(iii)將所述陰離子色鐠材料分離出去，得到溶液(包含促創(chuàng)傷愈合因子、AT-III、HRGP、白蛋白、IgG、轉(zhuǎn)鐵蛋白、觸珠蛋白等)；(iv)加入無機(jī)吸附材料，如硅藻土、硅膠、氧化鋁，孵育足夠的時(shí)間使之與不想要的物質(zhì)結(jié)合，如FXII和激肽釋放酶原激活劑等；(v)加入低級(jí)脂肪醇，如d-C4醇，以形成科恩級(jí)分I;(vi)除去無機(jī)吸附材料，以及，如果沉淀存在，還除去沉淀；(vii)使科恩級(jí)分I上清液通過親和色鐠材料來對(duì)其進(jìn)行處理，由此使促創(chuàng)傷愈合因子、AT-III和HRGP(HAH)結(jié)合，而大部分其它血漿蛋白(如白蛋白、IgG、轉(zhuǎn)鐵蛋白、觸珠蛋白等)未結(jié)合并被除去；(viii)從親和色譜材料上洗脫并收集含有所述促創(chuàng)傷愈合因子的物質(zhì)(任選地，在促創(chuàng)傷愈合因子級(jí)分解吸前用清M沖液處理親和樹脂，所述清洗液具有提高的離子強(qiáng)度，足以使雜質(zhì)蛋白解吸，但是尚不能使所述^^創(chuàng)傷愈合因子級(jí)分解吸)。5.權(quán)利要求l的方法，其包括如下步驟(i)將冷凍血漿解凍，任選地除去沉淀并進(jìn)一步處理上清液；(ii)使上清液通過親和色譜材料來對(duì)其進(jìn)行處理，由此使促創(chuàng)傷愈合因子、AT-III和HRGP(HAH)發(fā)生結(jié)合，而大部分其它血漿蛋白(如白蛋白、IgG、轉(zhuǎn)鐵蛋白、觸珠蛋白等)保持未結(jié)合并被除去；(m)從親和色鐠材料上洗脫并收集含所述促創(chuàng)傷愈合因子的物質(zhì)(任選地，在促創(chuàng)傷愈合因子級(jí)分解吸前用清洗緩沖液處理親和樹脂，所述清洗緩沖液具有提高的離子強(qiáng)度，足以使雜質(zhì)蛋白(如肝素輔因子II等)解吸，但是尚不能使所述促創(chuàng)傷愈合因子級(jí)分解吸)。6.根據(jù)權(quán)利要求2至5的方法，其中濃縮和/或滲濾所收集的級(jí)分得到濃縮物。7.根據(jù)權(quán)利要求2至6中任一項(xiàng)的方法，其中病毒滅活特別地在步驟(vi)之后實(shí)施。8.根據(jù)權(quán)利要求2至7中任一項(xiàng)的方法，其中在病毒滅活步驟之后實(shí)施陰離子交換色鐠。9.根據(jù)權(quán)利要求2至8中任一項(xiàng)的方法，其中陽離子交換色鐠特別地在陰離子交換色譜之后實(shí)施。10.根據(jù)權(quán)利要求2至9中任一項(xiàng)的方法，其中實(shí)施磷酸纖維素色譜。11.根據(jù)權(quán)利要求2至10中任一項(xiàng)的方法，其中實(shí)施納膜過濾。12.根據(jù)權(quán)利要求2至11中任一項(xiàng)的方法，其中權(quán)利要求2或3中步驟(vi)、權(quán)利要求4中步驟(viii)或權(quán)利要求5中步驟(iii)所得的級(jí)分采用病毒滅活化學(xué)劑進(jìn)行病毒滅活。13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中經(jīng)病毒滅活化學(xué)劑處理的級(jí)分接受磷酸纖維素色諉。14.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中經(jīng)病毒滅活化學(xué)劑處理的級(jí)分先接受陰離子交換色譜再接受陽離子交換色鐠。15.根據(jù)權(quán)利要求8或14的方法，其中所述陽離子交換材料先用離子強(qiáng)度足夠洗脫主要包含AT-III(>卯％)的級(jí)分A1之緩沖液進(jìn)行處理，隨后用離子強(qiáng)度更高以洗脫大部分所述促創(chuàng)傷愈合因子和HRGP的緩沖液進(jìn)行處理，并對(duì)其進(jìn)行收集。16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中濃縮或滲濾含有所述促創(chuàng)傷愈合因子和HRGP的級(jí)分以得到級(jí)分A2。17.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中將沉淀緩沖液添加到所述濃縮物，進(jìn)行過濾，用緩沖液處理所述沉淀以回收所述促創(chuàng)傷愈合因子和AT-III。18.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其特征在于處理所得促創(chuàng)傷愈合因子濃縮物以減少病原體，其包括以下方法中的至少一種(i)用溶劑去垢劑溶液進(jìn)行病毒滅活；(ii)用光照(例如UVC)或輻射處理進(jìn)行病毒滅活；(iii)用熱處理進(jìn)行病毒滅活；(vi)用病毒濾器除去病毒。19.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其特征在于，使用陽離子交換樹脂進(jìn)一步純化所得促創(chuàng)傷愈合因子濃縮物，其中所述促創(chuàng)傷愈合因子和HRGP結(jié)合到所述樹脂，其包括下述至少一個(gè)步驟(i)用緩沖液將所述促創(chuàng)傷愈合因子/HRGP級(jí)分從陽離子交換樹脂上洗脫下來，所述緩沖液具有室溫下10-450mS/cm的電導(dǎo)率，更優(yōu)選20-200mS/cm，最優(yōu)選30-100mS/cm，(ii)色鐠過程中pH保持在6-9，更優(yōu)選6.5-8，最優(yōu)選6.75-7.25，(iii)所述樹脂的帶電基團(tuán)用約10到約100個(gè)單體單元組成的弱疏水聚合物>^鏈連接到樹脂上。20.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其特征在于，使用鹽析步驟進(jìn)一步純化所得促創(chuàng)傷愈合因子濃縮物，通過該步驟沉淀HRGP,其特征在于(i)使用根據(jù)霍夫邁斯特序列的鹽，優(yōu)選地選自硫酸鈉、磷酸鈉、檸檬酸鈉、硫酸銨及其組合；(ii)所述鹽濃度選自0.3-3M的范圍內(nèi)，特別地選自0.5-2M或0.75-1.5M;(iii)所述溶液的pH選自4-10的范圍，特別地選自6-9或7-8的范圍；(iv)通過過濾或離心除去所得沉淀。21.可通過前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法得到的組合物，其包含活化和/或非活化形式的促創(chuàng)傷愈合因子或其組合。22.根據(jù)權(quán)利要求21的組合物，其特征在于包含活化和/或非活化形定性。23.根據(jù)權(quán)利要求21和/或22的組合物，其特征在于包含活化和/或非活化形式的促創(chuàng)傷愈合因子，并且已包含HRPG以增加天然促創(chuàng)傷愈合因子的體內(nèi)和體外穩(wěn)定性。24.根據(jù)權(quán)利要求21至23中任一項(xiàng)的組合物，其中另外存在選自多元醇、糖類和/或氨基酸的穩(wěn)定劑。25.—種藥物組合物，其包含權(quán)利要求21至24中任一項(xiàng)的組合物。26.權(quán)利要求25的藥物組合物，其中所述活化和/或非活化形式的促創(chuàng)傷愈合因子以液體或凍千形式存在，以^或噴霧劑形式施用。27.—種藥物制劑，其中權(quán)利要求26的組合物是剿歐、軟骨或噴霧劑的形式。28.通it^利要求1到20的方法獲得的富集了HRGP的級(jí)分。29.可通過以下方法獲得的才艮據(jù)權(quán)利要求28的級(jí)分，其中經(jīng)肝素親和和病毒滅活處理后，所得混合物再用磷酸纖維素材料處理。全文摘要本發(fā)明涉及一種從含有促創(chuàng)傷愈合因子的來源(如血液)中制備含有純化的促創(chuàng)傷愈合因子之組合物的方法，所述促創(chuàng)傷愈合因子選自肝細(xì)胞生長因子(HGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、表皮生長因子(EGF)、轉(zhuǎn)化生長因子α(TGF-α)、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)、胰島素樣生長因子(IGF-I)和成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)，其中所述制備方法包括在抗凝血酶III(AT-III)存在下實(shí)施的純化步驟。文檔編號(hào)C07K1/36GK101374855SQ200780002912公開日2009年2月25日申請(qǐng)日期2007年1月25日優(yōu)先權(quán)日2006年1月25日發(fā)明者安娜·米耶德斯坦,安德烈亞·內(nèi)塞爾-斯瓦埃,斯特凡·溫厄申請(qǐng)人:奧克塔法馬股份有限公司