專利名稱：Atl肽的固相合成方法
技術領域：
本發明涉及多肽類藥物的制備方法，尤其涉及一種ATL肽(C85H141N27015)的固相 法合成方法。屬生物技術領域。
技術背景ATL肽化學名乙酰-精氨酰-酪氨酰-酪氨酰-精氨酰-色氨酰-賴氨酰-賴氨酰-賴氨酰-賴氨酰-賴氨酰-賴氨酰-賴氨酰胺 (Ac-Arg-Tyr-Tyr-Arg-Trp-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2 ),化學結構式為NH2分子式C85H141N27015 分子量1781.24。ATL肽是在Ac-RYYRWK-NH2六肽的基礎上改構而來的，此六肽是從合成組合化 學肽庫中被NOP(Nociceptin/orphanin FQ peptide receptor)選擇性篩選出來的肽。孤啡肽 (nocieeptin或orphanin FQ)是阿片受體樣受體(ORLl或LC 132)的內源性配體，在痛覺調 節、心血管系統、離子通道、依賴和耐受、學習和記憶等方面具有廣泛的生物學活性。 ATL肽是利用SIP (Structure inducing probes)技術設計出NOP受體的新型配體，在原 六肽的基礎上增加了其代謝穩定性。美國專利US 7,244,701中有合成本品的報道包括化學合成法和生物重組合成法， 生物合成法是近年發展起來的新合成方法，但生物表達技術目前尚不成熟。同時，產品 的純化和產率方面離產業化生產尚有較大距離。報道的化學合成法包括1，液相合成 法(solution phase peptide synthese),2，基于Menifield-類型樹脂的固相合成，包括Boc/Bzl 和Fmoc/tBu策略。3，基于TentaGel Resin(PEG-PS)類型樹脂的固相合成，Fmoc/tBu策 略。然而，液相合成法存在(1)反應步驟多，路線冗長。(2)中間體不易純化分離， 實際操作中溶劑蒸除難度較大。(3)目前試劑和所用氨基酸側鏈保護基的來源和制備難 度較大等不足。Merrifield類型樹脂為載體，合成保護ATL樹脂后，將肽從樹脂上切下 來所要求的條件比較苛刻，該方法采用HF裂解方式，必須擁有一臺HF氣體發生裝置 才能實現裂解，對于大量的肽樹脂只能分兩次裂解，生產規模受到限制。另外，HF是 一種強腐蝕性的氣體， 一旦泄漏會對人造成極大的傷害。再者，此合成i法將肽從樹脂 上裂解下來后，抽去HF用稀乙酸抽提，抽提物經冷凍干燥后，生產周期長，成本高。TentaGd Resin(PEG-PS)類型樹脂目前成本較高，不適合于大批量的制備和工業化生產。 發明內容針對上述技術不足，本發明所要解決的技術問題是提供一種操作簡便，單步縮合反 應產率高，副產物少，最終粗品純度高，雜質含量少，總收率高的ATUt(C85H141N27015)的固相法合成方法。本發明所述ATL肽固相法合成方法的技術方案是:采用MBHA樹脂作為固相載體， 首先在該樹脂上連接保護賴氨酰基Boc-Lys(2-Cl-Z)，釆用Boc保護氨基酸的程序接肽法 完成ATL的備成，用乙酸酑對N端進行乙酰化修飾，得到全保護的肽樹脂；用哌啶脫 除Trp的甲酰基(For)側鏈保護基，最后用三氟甲磺酸脫除側鏈保護基團，并切割樹 脂，得到ATL粗肽制品；然后用反相C18填料的高效液相純化該粗制品，甲醇-水梯度 洗脫方法分離純化，得ATL肽精制產品。本發明提供的ATL肽固相法合成方法的具體步驟是1)以MBHA樹脂為固相載體和起始原料，在MBHA樹脂上依次進行縮合反應 連接保護氨基酸，制備H2N-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)- Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl墨Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z). MBHA樹脂其中所述MBHA樹脂的化學結構為MBHA樹脂可采用市售產品，如天津南開和成科技公司生產的規格為subst. 0.8mmol/g,DVB:l%, Mesh 100-200的MBHA樹脂。制備步驟如下(1) 向MBHA樹脂中加入5y。三乙胺DCM溶液洗2 3次；再用二氯甲烷、乙醇交 替洗樹脂2 3次，抽干；(2) 向上述樹脂中加入1 5當量Boc-保護氨基酸，1 5當量的HOBt，而后加入1~5 當量的N，N-二環己基碳二亞胺(DCC)，室溫下攪拌1~6小時，抽干，得 Boc-Arg(Mts):Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)- MBHA樹脂；其中，所述HOBt 用二氯甲烷(DCM)或二氯甲烷與N,N-二甲基甲酰胺(DMF)的混合液溶解，所述N,N-環 己基碳二亞胺用二氯甲烷與N，N-二甲基甲酰胺(DMF)的混合液溶解；G)樹脂用二氯甲垸、乙醇交替洗3次，抽干；(4) 樹脂用50。/。三氟醋酸/二氯甲垸(DCM)洗1 ~2次； ，(5) 樹脂用二氯甲烷洗2 3次，得112 ^^^(1^3)-1)0"(2-;6]^)-丁71(2-81:-2)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-CI-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)- MBHA樹脂；2) 用乙p酐對N端進行乙酰化修飾將50±2 k量的乙酸酐DMF溶液加入H2N-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)墨Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)陽Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA樹脂中，室溫攪拌5 6小時，抽干；樹脂用二氯甲烷、乙醇交 替洗2 3次，抽干，得Ac-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For) -Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-a-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-M BHA;3) 用哌啶脫除Trp的甲酰基(For)側鏈保護基向Ac-Arg(Mts)-Tyr(2-Br國Z)-Tyr(2-Br-Z)濕Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z) -Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-CI-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA中加入 20。/。哌啶/DMF溶液，室溫攪拌反應20 30分鐘除Trp的甲酰基(For)保護基，抽干，二 氯甲垸，乙醇交替洗滌2 3次后，得到除Trp外的ATL樹脂Ac-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z) -Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(H)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z》Lys(2-Cl-Z)-MBHA;4) 切割反應脫除側鏈保護基團并切割樹脂以10ml/g樹脂的量將切割試劑加入到Ac-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z) -Arg(Mts)醫Trp(H)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-C-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2需C墨 Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA中，冰水浴下攪拌反應3小時后，過濾，收集濾液，用三氟醋酸 洗滌濾除的樹脂，洗滌液與濾液合并后濃縮，之后加入其100 150倍體積量的冷乙醚， 即析出大量的白色固體，過濾，收集白色固體，干燥，即得ATL肽的粗肽制品；其中所述切割試劑是體積配比為..三氟醋酸(TFA):三氟甲磺酸(TFMSa)'.硫 代苯甲醚(thioanisole):乙二硫醇(1,2-ethanethiol) =80:8 9:8 9:4 5的混合溶液；5) ATL肽粗品的純化ATL肽粗品用5%醋酸水溶液溶解，經0.45mn微孔濾膜過濾后，直接上樣到反相 C,8鍵合硅膠裝填色譜柱，采用梯度6 9%甲醇-水流動相進行梯度洗脫分離，收集目的 組分，濃縮/1,冷凍干燥，得到純ATL肽。上述ATL肽的固相合成方法中，步驟l)所述Boc-保護氨基酸在MBHA樹脂上依 次進行縮合反應連接的氨基酸是Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH, Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH， Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH， Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH, Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH, Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH, Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH， Boc-Trp(For)-OH， Boc-Arg(Mts)-OH, Boc-Tyr(2-Br-Z)-OH， Boc-Tyr(2-Br-Z)-OH, Boc-Arg(Mts)-OH 。上述ATL肽的固相合成方法中，步驟l)中(2)優選的方法是向上述樹脂中加入 2 4當量Boc-保護氨基酸，2 4當量的HOBt，而后加入2 4當量的N,N-二環己基碳 二亞胺(DCC)，室溫下攪拌3~5小時，抽干，得 Boc-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)- MBHA樹脂。 .上述ATL肽的固相合成方法中，步驟l)中(2)所述的二氯甲烷與N,N-二甲基甲 酰胺的混合威是指二氯甲烷N,N-二甲基甲酰胺體積比為1 : 0.1 1的混合液。優選是指二氯甲烷N，N-二甲基甲酰胺體積比為1 :0.6 1的混合液。上述ATL肽的固相合成方法中，步驟3)所述室溫攪拌反應優選是30分鐘。上述ATL肽的固相合成方法中，步驟4)所述切割試劑是體積配比優選三氟醋酸 (TFA):三氟甲磺酸(TFMSa):硫代苯甲醚(thioanisole):乙二硫醇(1,2-ethanethiol) =80:8:8:4的混合溶液。上述ATL肽的固相合成方法中，步驟5)所述反相d8鍵合硅膠裝填色譜柱的裝載 量為5 200mg/克d8鍵合硅膠。本發明的方法是一種ATL全合成的新方法，為固相法， 一次完成制備側鏈保護的 ATL肽，有以下特點(1)采用Boc-保護氨基酸，配比為1 5摩爾；采用MBHA樹脂 作為固相合成載體，采用取代值為0.8mmol/克樹脂，(2)采用哌啶脫除Trp側鏈甲酰基 保護，(3)采用三氟甲磺酸切割ATL肽樹脂，同時完成對剩余側鏈保護基的去除，切割 試劑由三氟甲磺酸、三氟醋酸、苯甲硫醚、乙二硫醇組成，切割完畢后直接得到肽酰胺 的形式，(4)采用高效液相色譜方法進行純化分離，采用反相d8鍵合硅膠裝填，裝載 量為5 200mg/克C,8鍵合硅膠，采用甲醇-水作為洗脫流動相，梯度洗脫方法。


圖1為本發明工藝流程框圖。圖2為ATL肽HPLC檢測圖。圖3為ATL肽經質譜MS確證圖。
具體實施方式
實施例1H2N-Lys(2-Cl-Z)-MBHA的制備(1) 將MBHA樹脂50g (40tnmo1)放于多肽合成反應器中，用5%三乙胺DCM溶 液5 7ml/g洗2次，每次8分鐘；用二氯甲烷、乙醇各300ml交替洗2次，2分鐘/次， 抽干。(2) 將Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH 82,8g及HOBt27.0g ， N,N-環己基碳二亞胺41.2g用 500ml 二氯甲烷/DMF溶液(二氯甲烷N,N-二甲基甲酰胺體積比為1: 0.8)溶解后，' 加入樹脂中，室溫攪拌5小時，抽干。(3) 將(2)的產物用二氯甲烷、乙醇各300ml交替洗3次，每次2分鐘，抽干。(4) 用50。/。三氟醋酸/二氯甲烷(DCM) 10ml/g洗1次，20分鐘；用二氯甲烷5 7ml/g 洗2次，每次2分鐘；得H2N-Lys(2-Cl-Z)-MBHA。實施例2H2N-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA的制備(1) 向樹脂H2N-Lys(2-Cl-Z)-MBHA中加入5%三乙胺DCM溶液5~7 ml/g洗2次，每 次8分鐘；用二氯甲垸、乙醇各300ml交替洗2次，2分鐘/次，抽干。(2) 將Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH82.8g及HOBt27.0g ，N，N-環己基碳二亞胺41.2g用500ml 二氯甲垸/DMF溶液(二氯甲烷N，N-二甲基甲酰胺體積比為1: 0.9)溶解后，加入樹 脂中，室溫攪拌5小時，抽干。(3) 將(2)的產物用二氯甲烷、乙醇各300ml交替洗3次，每次2分鐘，抽干。(4)用50。/。三氟醋酸/二氯甲烷(DCM) 10ml/g洗1次，20分鐘； 用二氯甲烷5 7ml/g洗2次，每次2分鐘； 得H2N-Lys(2-CI-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA 。實施例3H2N-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA的制備 操作(O向樹脂H2N-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA中加入5%三乙胺DCM溶液5~7 ml/g洗2次，每次8分鐘；用二氯甲垸、乙醇各300ml交替洗2次，2分鐘/次，抽干。(2) 將Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH82.8g及HOBt27.0g ，N,N-環己基碳二亞胺41.2g用500ml 二氯甲垸/DMF (二氯甲烷N,N-二甲基甲酰胺體積比為1: 0.9)溶液溶解后，加入樹 脂中，室溫攪拌5小時，抽干。(3) 將(2)的產物用二氯甲烷、乙醇各300ml交替洗3次，每次2分鐘，抽干。(4) 用50。/。三氟醋酸/二氯甲烷(DCM) 10ml/g洗1次，20分鐘； 用二氯甲烷5 7ml/g洗2次，每次2分鐘；得H2N-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA。實施例4H2N-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl隱Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA的制備 操作(1)向樹脂H2N-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA中加入5%三乙胺 DCM溶液5~7 ml/g洗2次，每次8分鐘；用二氯甲垸、乙醇各300ml交替洗2次，2 分鐘/次，抽干。(2) 將Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH82.8g及HOBt27.0g ，N,N-環己基碳二亞胺41.2g用500ml 二氯甲烷/DMF溶液(二氯甲垸N,N-二甲基甲酰胺體積比為1: 0.8)溶解后，加入樹 脂中，室溫攪拌5小時，抽干。(3) 將(2)的產物用二氯甲烷、乙醇各300ml交替洗3次，每次2分鐘，抽干。(4) 用50。/。三氟醋酸/二氯甲烷(DCM) 10ml/g洗1次，20分鐘； ' 用二氯甲垸5 7ml/g洗2次，每次2分鐘；得H2N-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA。實施例5H2N-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA的制備 操作(1)向樹脂H2N-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA中加入 5。/o三乙胺DCM溶液5 7ml/g洗2次，每次8分鐘；用二氯甲烷、乙醇各300ml交替 洗2次，2分鐘/次，抽干。(2) 將Boc-Lys(2-CI-Z)-OH82.8g及HOBt27.0g ，N,N-環己基碳二亞胺41.2g用500ml 二氯甲垸/DMF溶液(二氯甲烷N,N-二甲基甲酰胺體積比為1: 0.9)溶解后，加入樹 脂中，室溫攪拌5小時，抽干。 .(3) 將(2)的產物用二氯甲烷、乙醇各300ml交替洗3次，每次2分鐘，抽干。(4) 用50。/。三氟醋酸/二氯甲烷(DCM) 10ml/g洗1次，20分鐘；用二氯甲烷5 7ml/g洗2次，每次2分鐘；得H2N-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA 。實施例6H2N-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBH A的制備跳(1),旨H2N-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)德HA 中加入5。/。三乙胺DCM溶液5-7ml/g洗2次，每次8分鐘；用二氯甲烷、乙醇各300ml 交替洗2次，2分鐘/次，抽干。(2) 將Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH82.8g及HOBt27.0g ，N,N-環己基碳二亞胺41.2g用500ml 二氯甲垸ZDM.F溶液(二氯甲烷N,N-二甲基甲酰胺體積比為1: 0.9)溶解后，加入樹 脂中，室溫攪拌5小時，抽干。(3) 將(2)的產物用二氯甲烷、乙醇各300ml交替洗3次，每次2分鐘，抽干。(4) 用50。/。三氟醋酸/二氯甲垸(DCM) 10ml/g洗1次，20分鐘； 用二氯甲垸5 7ml/g洗2次，每次2分鐘；實施例7H2N-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-C1-Z)-MBHA的制備跳(1) I^^H2N-Lys(2"a-Z)iys(2"Cl-Z>Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-a-Z)-Lys(2-Cl-Z)--MBHA中加入5。/。三乙胺DCM溶液5 7ml/g洗2次，每次8分鐘；用二氯甲垸、乙 醇各300ml交替洗2次，2分鐘/次，抽干。 -(2) 將Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH 82.8g及HOBt27.0g ，N，N-環己基碳二亞胺41.2g用500ml 二氯甲烷/DMF溶液(二氯甲烷N,N-二甲基甲酰胺體積比為1: 1)溶解后，加入樹脂 中，室溫攪拌5小時，抽干。(3) 將(2)的產物用二氯甲烷、乙醇各300ml交替洗3次，每次2分鐘，抽干。(4) 用50。/。三氟醋酸/二氯甲烷(DCM) 10ml/g洗1次，20分鐘； 用二氯甲烷5 7ml/g洗2次，每次2分鐘；得H2N-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z) -Lys(2-Cl-Z)-MBHA。實施例8H2N-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA的制備操作(1)向樹脂H2N-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2"Cl-Z) -Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)- MBHA中加入5%三乙胺DCM溶液5~7 ml/g洗2次，每次8分 鐘；用二氯甲烷、乙醇各300nU交替洗2次，2分鐘/次，抽干。 (2)將Boc-Trp(For)-OH66.5g及HOBt27.0g ，N,N-環己基碳二亞胺41.2g用500ml 二氯甲垸/DMF溶液(二氯甲烷N,N-二甲基甲酰胺體積比為1: 1)溶解后，加入樹脂中，室溫攪拌5小時，抽干。(3) 將(2)的產物用二氯甲垸、乙醇各300ml交替洗3次，每次2分鐘，抽干。(4) 用50。/。三氟醋酸/二氯甲烷(DCM) 10ml/g洗1次，20分鐘； 用二氯甲烷5 7ml/g洗2次，每次2分鐘；得H2N-Trp(For)-Lys(2-CI-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z) -Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)德HA。實施例9H2N-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Ci-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-CI-Z)-Lys(2-Cl-Z) -Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA的制備操作U)向樹脂H2N-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z) -Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA中加入5%三乙胺DCM溶液5~7 mi/g洗2 次，每次8分鐘；用二氯甲垸、乙醇各300ml交替洗2次，2分鐘/次，抽千。(2) 將Boc-Arg(Mts)-OH91.3g及HOBt27.0g ，N,N-環己基碳二亞胺41.2g用500ml 二 氯甲烷/DMF溶液(二氯甲烷N，N-二甲基甲酰胺體積比為h 1)溶解后，加入樹脂中， 室溫攪拌5小時，抽干。(3) 將(2);的產物用二氯甲烷、乙醇各300ml交替洗3次，每次2分鐘，抽干。(4) 用50。/。三氟醋酸/二氯甲烷(DCM) 10ml/g洗1次，20分鐘； 用二氯甲垸5 7ml/g洗2次，每次2分鐘；得H2N-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z) -Lys(2-Cl-Z)-Ly s(2-Cl-Z)-MBH A 。實施例10H2N-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-a-Z) -Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA的制備操作(1)向樹脂H2N-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z) -Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA中加入5%三乙胺DCM溶液 5 7ml/g洗2次，每次8分鐘；用二氯甲烷、乙醇各300ml交替洗2次，2分鐘/次，抽干。 .—，(2) 將Boc-Tyr(2-Br-Z)-OH98.9g及HOBt27.0g ，N,N-環己基碳二亞胺41.2g用500ml 二氯甲烷/DMF溶液(二氯甲烷N,N-二甲基甲酰胺體積比為1: 0.9)溶解后，加入樹 脂中，室溫攪拌5小時，抽干。(3) 將(2)的產物用二氯甲烷、乙醇各300ml交替洗3次，每次2分鐘，抽干。(4) 用50。/。三氟醋酸/二氯甲烷(DCM) 10ml/g洗1次，20分鐘； 用二氯甲烷5 7ml/g洗2次，每次2分鐘；得H2N-Tyr(2-Br-Z)-Aig(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-ClrZ) -Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-p-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA。實施例11H2N-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-CI-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl陽Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA的制備 操作(1)向樹脂H2N-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z) -Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA中加入5%三乙胺 DCM溶液5~7 ml/g洗2次，每次8分鐘；用二氯甲垸、乙醇各300ml交替洗2次，2 分鐘/次，抽干。(2) 將Boc-Tyr(2-Br-Z)-OH98.9g及HOBt27.0g ，N,N-環己基碳二亞胺41.2g用500ml 二氯甲烷/DMF溶液(二氯甲垸N，N-二甲基甲酰胺體積比為1: 0.9)溶解后，加入樹 脂中，室溫攪拌5小時，抽干。(3) 將(2)的產物用二氯甲垸、乙醇各300ml交替洗3次，每次2分鐘，抽干。(4) 用50。/。三氟醋酸/二氯甲烷(DCM) 10ml/g洗1次，20分鐘； 用二氯甲垸5匸7ml/g洗2次，每次2分鐘；得H2N-Tyrj;2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z) -Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA。實施例12H2N-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2國Cl國Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2國Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA的制備 操作(1)向樹脂H2N-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z) -Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA中加入 5%三乙胺DCM溶液5~7 ml/g洗2次，每次8分鐘；用二氯甲烷、乙醇各300ml交替 洗2次，2分鐘/次，抽干。 -(2)將Boc-Arg(Mts)-OH91.3g及HOBt27.0g ，N,N-環己基碳二亞胺41.2g用500ml 二 氯甲烷/DMF溶液(二氯甲垸N,N-二甲基甲酰胺體積比為1: 1)溶解后，加入樹脂中， 室溫攪拌5^時，抽干。G)將(2)的產物用二氯甲烷、乙醇各300ml交替洗3次，每次2分鐘，抽干。(4)用50。/。三氟醋酸/二氯甲垸(DCM) 10ml/g洗1次，20分鐘； 用二氯甲烷5 7ml/g洗2次，每次2分鐘得H2N-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z) 誦Lys(2-Cl-Z)-Lys(2陽Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-CI-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)德HA。實施例13Ac-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys (2-CI-Z)-Lys(2陽Cl-Z)-Lys(2-Cl隱Z)墨Lys(2國Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA的制備 操作(1)向樹脂H2N-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For) -Lys(2-Cl-Z)墨Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-M BHA中加入i。/。三乙胺DCM溶液5 7ml/g洗2次，每次8分鐘；用二氯甲垸、乙醇各 300ml交替洗2次，2分鐘/次，抽干。(2) 將乙酸酐142ml禾Q 400 ml DMF加入樹脂(H2N-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Tip(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA)中，室溫攪拌5小時。(3) 抽干。樹脂用二氯甲垸、乙醇各600ml交替洗3次，每次2分鐘，抽干。得 Ac-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl -Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA。實施例14Ac-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(H)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2 -Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA的制備 操作向樹脂Ac-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2墨Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z) -Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA中加入 20。/。哌啶/DMF溶液500 ml,室溫攪拌反應20分鐘，抽干。樹脂用二氯甲垸、乙醇300ml 交替洗3次，2分鐘/次，抽干。得Ac-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(H)陽Lys(2陽Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z) -Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA。實施例15Ac-Arg-Tyr-Tyr-Arg-Trp-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2的審U備 操作(1)辨樹脂Ac國Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(H)-Lys(2-Cl-Z) -Lys(2-Cl-Z)-tys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA真空干 燥，稱重得194.4g淡黃色樹脂。肽樹脂收率95%。 -(2)量取苯甲硫醚160ml、乙二硫醇80ml，加入樹脂中，冰水浴攪拌下加入三氟醋酸1600 ml，反應10分鐘后，緩慢滴加160ml三氟甲磺酸，滴加完畢后室溫反應3小時，過濾， 濾除樹脂，用150ml三氟醋酸洗滌樹脂，洗滌液與濾液合并后濃縮，之后加入15L冷 乙醚，即析出大量的白色固體，過濾，收集白色固體，干燥，得ATL肽的粗肽制品57.02 g 。粗品收率79%。粗品純度經HPLC檢測為83%，見圖2。實施例16分離純化 裝置d8制斧柱(150xl000mm) 裝載量5 2^)mg/克d8鍵合硅膠 洗脫液A: 0.1%TFA/H2O 洗脫液B:甲醇 流速400ml/min 紫外檢測波長:220 nm操作(1) ATL肽粗品30 g用500ml 5%醋酸水溶液溶解， (2) 0.45pm微孔濾膜過濾，(3) 濾液直接上樣，(4) 6~9%甲醇-水流動相進行梯度洗脫，收集保留時間為10.340分鐘組分峰的洗 脫液(見圖l)，(5) 濃縮，冷凍干燥；得ATL白色疏松粉末20.3g。(6) 其他低于98%洗脫液合并，濃縮后，回收。(7) 依此方法處理完畢所有肽粗品后，合并得ATL肽共計2L2g ，分離純化收率 70.6%。產品經質譜MS確證(譜圖見圖3)，總收率為56.5%。
權利要求
1.一種ATL肽的固相合成方法，包括下列步驟1)以MBHA樹脂為固相載體和起始原料，在MBHA樹脂上依次進行縮合反應連接保護氨基酸，制備H2N-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA樹脂(1)向MBHA樹脂中加入5％三乙胺DCM溶液洗2～3次；再用二氯甲烷、乙醇交替洗樹脂2～3次，抽干；(2)向上述樹脂中加入1～5當量Boc-保護氨基酸，1～5當量的HOBt，而后加入1～5當量的N，N-二環己基碳二亞胺，室溫下攪拌1～6小時，抽干，得Boc-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA樹脂；其中，所述HOBt用二氯甲烷或二氯甲烷與N，N-二甲基甲酰胺的混合液溶解，所述N，N-環己基碳二亞胺用二氯甲烷與N，N-二甲基甲酰胺的混合液溶解；(3)樹脂用二氯甲烷、乙醇交替洗3次，抽干；(4)樹脂用50％三氟醋酸/二氯甲烷洗1～2次；(5)樹脂用二氯甲烷洗2～3次，得H2N-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA樹脂；2)用乙酸酐對N端進行乙酰化修飾將50±2當量的乙酸酐DMF溶液加入H2N-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA樹脂中，室溫攪拌5～6小時，抽干；樹脂用二氯甲烷、乙醇交替洗2～3次，抽干，得Ac-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA；3)用哌啶脫除Trp的甲酰基側鏈保護基向Ac-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA中加入20％哌啶/DMF溶液，室溫攪拌反應20～30分鐘除Trp的甲酰基保護基，抽干，二氯甲烷，乙醇交替洗滌2～3次后，得到除Trp外的ATL樹脂Ac-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(H)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA；4)切割反應脫除側鏈保護基團并切割樹脂以10ml/g樹脂的量將切割試劑加入到Ac-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(H)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA中，冰水浴下攪拌反應3小時后，過濾，收集濾液，用三氟醋酸洗滌濾除的樹脂，洗滌液與濾液合并后濃縮，之后加入其100～150倍體積量的冷乙醚，即析出大量的白色固體，過濾，收集白色固體，干燥，即得ATL肽的粗肽制品；其中所述切割試劑是體積配比為三氟醋酸∶三氟甲磺酸∶硫代苯甲醚∶乙二硫醇＝80∶8～9∶8～9∶4～5的混合溶液；5)ATL肽粗品的純化ATL肽粗品用5％醋酸水溶液溶解，經0.45μm微孔濾膜過濾后，直接上樣到反相C18鍵合硅膠裝填色譜柱，采用梯度6～9％甲醇-水流動相進行梯度洗脫分離，收集目的組分，濃縮后，冷凍干燥，得到純ATL肽。
2. 如權利要求1所述ATL肽的固相合成方法，其特征在于，步驟l)所述Boc-保護 氨基酸在MBHA樹脂上依次進行縮合反應連接的氨基酸是Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH， Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH, Boc-Lys(2-Cl-Z)國OH， Boc-Lys(2-Cl-Z)隱OH， Boc-Lys(2-Cl-Z)國OH, Boc墨Lys(2-C1-Z)-OH， Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH, Boc-Trp(For)-OH, Boc-Arg(Mts)-OH, Boc-Tyr(2-Br-Z)-OH, Boc-Tyr(2-Br-Z)-OH, Boc-Arg(Mts)-OH。
3. 如權利要求1所述ATL肽的固相合成方法，其特征在于，步驟l)中(2)是向上 述樹脂中加入2 4當量Boc-保護氨基酸，2 4當量的HOBt，而后加入2 4當量的 N,N- 二環己基碳二亞胺，室溫下攪拌3 5小時，抽干，得 Boc-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)- MBHA樹脂。
4. 如權利要求1所述ATL肽的固相合成方法，其特征在于，步驟l)中(2)所述的 二氯甲垸與N,N-二甲基甲酰胺的混合液是指二氯甲烷N,N-二甲基甲酰胺體積比為1 : 0.1 1的混合液。
5. 如權利要求4所述ATL肽的固相合成方法，其特征在于，步驟l)中(2)所述的 二氯甲垸與N，N-二甲基甲酰胺的混合液是指二氯甲烷N,N-二甲基甲酰胺體積比為1 : 0.6 1的混合液。
6. 如權利要求1所述ATL肽的固相合成方法，其特征在于，步驟3)所述室溫攪拌 反應是30分鐘。
7. 如權利要求1所述ATL肽的固相合成方法，其特征在于，步驟4)所述切割試劑 是體積配比為三氟醋酸:三氟甲磺酸:硫代苯甲醚:乙二硫醇=80:8:8:4的混合溶液。
8. 如權利要求1所述ATL肽的固相合成方法，其特征在于，步驟5)所述反相C18 鍵合硅膠裝填色譜柱的裝載量為5 200mg/克ds鍵合硅膠。
全文摘要
本發明公開了一種ATL肽的固相合成方法。采用MBHA樹脂作為固相載體，首先在該樹脂上連接保護賴氨酰基Boc-Lys(2-Cl-Z)，采用Boc保護氨基酸的程序接肽法完成ATL的合成，用乙酸酐對N端進行乙酰化修飾，得到全保護的肽樹脂；用哌啶脫除Trp的甲酰基(For)側鏈保護基，最后用三氟甲磺酸脫除側鏈保護基團，并切割樹脂，得到ATL粗肽制品；然后用反相C18填料的高效液相純化該粗制品，甲醇-水梯度洗脫方法分離純化，得ATL肽精制產品。本發明的方法條件具有單步縮合反應產率高，副產物少，最終粗品純度高，雜質含量少，操作簡單易行，總收率高的特點。
文檔編號C07K1/06GK101255187SQ20081001426
公開日2008年9月3日 申請日期2008年2月18日 優先權日2008年2月18日
發明者厲保秋 申請人:濟南環肽醫藥科技有限公司