專利名稱：使用混合式或多模式樹脂來純化因子Ⅷ的制作方法
專利說明使用混合式或多模式樹脂來純化因子Ⅷ 發明領域 本發明涉及使用含有配體的多模式(multimodal)或混合式樹脂來純化重組蛋白質的方法，其中配體包含疏水性部分和帶負電荷的部分。使人感興趣的蛋白是凝血因子，尤其與重組體[凝血]因子(Factor)VIII的組合物的純化有關。

背景技術：
人類因子(Factor)VIII，亦稱抗血友病因子或FVIII:C，是由兩種多肽組成的人血漿蛋白，其中多肽具有80,000道爾頓的輕鏈分子量和從90,000至220,000變化的重鏈分子量。人們認為其在因子X轉化為它的活性形式因子Xa所必需的凝結途徑中是關鍵輔助因子之一。因子VIII在血漿中以與von Willebrand因子的非共價配合物形式(亦稱FVIII:RP)循環。血友病(出血障礙)是由于因子VIII的異常水平所導致的。在人中，低于20％正常值的因子VIII水平可以導致血友病癥。因子VIII的水平降低小于1％就會引起嚴重的出血障礙，自發性關節出血是最常見的癥狀。
過去已經描述了重組體因子VIII的結構和生物化學。
傳統地，因子VIII的分離和純化是從血漿取得渠道進行(低溫沉淀)的。從血漿取得渠道進行的純化方法包括那些使用免疫親和純化的方法，其使用多克隆和單克隆抗體來純化FVIII。然而，由于用載體基質浸提，有可能存在因子VIII排出流含有一些殘余抗體的情況，這可以在最終使用期間(即，當人或動物系統采用時)產生抗原性。
在例如瓊膠糖珠粒上使用離子交換色譜的純化方法還用于從血漿中純化因子VIII。然而，這些方法常常使所得到的FVIII:C具有某些污染水平。
然而，在過去十年中，由遺傳工程設計的重組體渠道來純化因子VIII已經贏得了重要地位。在重組體蛋白的分離過程中，最終產物的蛋白回收率和濃度是非常重要的。在重組產生的蛋白中的污染物包括在培養基中分泌的蛋白、介質組份、細胞溶解產物、細胞產生的不希望有的蛋白和核苷酸。
當純化重組蛋白時，進一步常常看到水源性物質(在其中可以得到使人感興趣的多肽)被一或多種病毒污染。使多肽混合物中的病毒失活的技術在本領域是已知的，例如使用溶劑/洗滌液的化學方法，照射方法或熱法，但將這種技術與已知的多肽提純方法相組合的努力已經產生的方法，具有許多步驟，不適合大量制備。同樣重要的是，必須注意所使用的病毒失活試劑不能使蛋白變性，或很難從使人感興趣的蛋白中分離出來。然而，這些試劑已經使感興趣的多肽變性，或難以從感興趣的多肽中分離出來，并且需要特殊處理或分離步驟。對于潛在的病毒污染，處理含有多肽的制品的其它常規方法，例如加熱或照射，已經導致感興趣的多肽的顯著變性，和/或不能使病毒充分滅活。許多可商購的重組體因子VIII產品(Advate

，Helixate，

Kogenate FS

，ReFacto

)是使用免疫親和色譜制備的，其包含用于純化和病毒滅活的洗滌劑。
在通過重組DNA技術制備的治療蛋白的純化中，眾所周知的是，當設法將DNA和宿主細胞蛋白(HCP)的含量降低至目標極低水平時，會遇到相當大的問題。
Nordfang等人(Thrombosis and Haemostasis 58(4)，1043-1048(1987))描述了使用抗體樹脂和含有50％乙二醇和高鹽的緩沖液所進行的分離方法。
在哺乳動物細胞系統中表達的重組蛋白的純化一般需要用幾個步驟進行。不同的步驟通常可分為捕獲、中間物和精制。捕獲步驟的目的有兩層a)以穩定溶液形式獲得靶蛋白，和b)減少體積(即，與裝填到柱(“裝填”)上的溶液相比，獲得相對于蛋白含量的濃縮溶液)。
后面的步驟(減少體積)是便于后面的純化步驟的關鍵性步驟。捕獲步驟通常使用帶有離子交換樹脂的色譜達成。使用離子交換樹脂的缺點是必須調節裝填的電導率和/或pH值。當調節電導率時(大多數情況下降低)，是通過加入水進行的，這就會增加起始原料的體積，使得后面的步驟不能進行，給制備目的造成總體麻煩。此外，調節pH值常常導致形成團聚體，其可以妨礙純化步驟的效能。
捕獲步驟之后，可以進行中間物純化，純化可以除去大部分顯著的雜質，包括DNA、病毒和內毒素。這些雜質還可以在捕獲過程中除去/減少。精制步驟是指最后的純化步驟，在該步驟中，可以除去痕量染污物和雜質，并且得到活性生物制品。在精制步驟期間除去的污染物常常是靶分子的構象異構體，或可能是滲漏的產品。
本領域仍然需要快速和有效的改進的純化方法，并且要求這種純化方法基本上保留因子VIII的活性。
本發明的方法具有以下優點在一步法中，可以使體積減少，并且可以使比活性得到相當大的提高。由此，該方法用一步法組合了捕獲和純化步驟。
本發明還提供了制備重組體因子VIII的高度濃縮和非常純溶液的有效方法，其中因子VIII蛋白針對降解作用具有穩定性。對于本發明，可以組合捕獲和純化步驟，同時FVIII分子沒有嚴重的不穩定危險，并且可以在一步法中獲得粗品樣品的初始純化，獲得相當大的體積減少(由此便于更進一步的純化步驟)，以及獲得基本上純化的因子(增加FVIII比活性)和產物溶液(“捕獲池”)，其中蛋白針對降解作用是穩定的。
本發明概述 本發明涉及重組體蛋白的新的和有效的純化方法，尤其是凝血因子VIII。本發明人已經發現，用多模式(multimodal)柱來捕獲哺乳動物細胞培養液中的因子VIII分子，是從FVIII蛋白(從培養物中采集)中除去污染物的出人意外地快速和有效的純化方法，并且蛋白的活性沒有損失。
在一方面，本發明提供了純化含有一或多種污染物的凝血因子VIII蛋白的方法，該方法包括下列步驟 (a)使因子VIII蛋白與含有配體的多模式或混合式樹脂接觸，該配體包含疏水性部分和帶負電荷的部分； (b)用洗脫緩沖液將所述因子VIII蛋白洗脫，緩沖液含有至少1.5M的鹽和至少40％(w/v)的乙二醇、丙二醇或其混合物和鈣離子。
在不同的實施方案中，該方法進一步包括步驟(c)，在該步驟中，將源于步驟(b)的含有因子VIII的溶液進行收集；和/或，該方法更進一步包括步驟(a1)，在該方法中，在步驟(a)之后和在步驟(b)之前，使一或多種洗滌緩沖液通過柱。
在其各種實施方案中，一或多種所述洗滌緩沖液包含10mM至1000mM鹽，和/或步驟(b)的洗脫緩沖液含有至少2M的鹽和至少45％(w/v)的乙二醇、丙二醇或其混合物，例如2.3-2.6M的鹽和48-52％(w/v)的乙二醇、丙二醇或其混合物；和/或，包含在步驟(b)的洗脫緩沖液中的鹽選自NaCl，NH4Cl，KCl，(NH4)2SO4，CH3CO2NH4，或這些中的兩種或多種的混合物。
在另一個方面，本發明提供了純化含有一或多種污染物的因子VIII蛋白的一步方法，該方法包括下列步驟 a)使蛋白與含有配體的多模式(multimodal)樹脂接觸，該配體包含疏水性部分和帶負電荷的部分； b)用洗脫緩沖液將所述蛋白洗脫，緩沖液含有至少1.5M的鹽和至少40％(w/v)的乙二醇、丙二醇或其混合物和鈣離子； 其中所述方法可以使柱體積減少大約250倍。
在另一個方面，本發明提供了純化含有一或多種污染物的因子VIII蛋白的一步方法，該方法包括下列步驟 a)使蛋白與含有配體的多模式(multimodal)樹脂接觸，該配體包含疏水性部分和帶負電荷的部分； b)用洗脫緩沖液將所述蛋白洗脫，緩沖液含有至少1.5M的鹽和至少40％(w/v)的乙二醇、丙二醇或其混合物和鈣離子； 其中所述方法可以獲得至少30倍的“純化系數(purificationfactor)”。
在又一個方面，本發明提供了使因子VIII蛋白穩定的方法，該方法包括下列步驟 a)使蛋白與含有配體的多模式(multimodal)樹脂接觸，該配體包含疏水性部分和帶負電荷的部分； b)用洗脫緩沖液將所述蛋白洗脫，緩沖液含有至少1.5M的鹽和至少40％(w/v)的乙二醇、丙二醇或其混合物和鈣離子。
附圖的簡要說明

圖1A是色譜圖，其顯示了用平衡、裝填、洗滌和洗脫進行純化操作時的在280nm時的UV吸收、電導率和pH值。
圖1B顯示了圖1的色譜圖的洗滌和洗脫部分的放大圖。
圖2顯示了銀染色的SDS凝膠電泳，其舉例說明了在裝填、流過(FT)和洗脫的純化步驟中使用Capto MMC柱所獲得的純化。泳道1MW標準，泳道2細胞培養介質，泳道3空泳道，泳道4從Capto MMC柱穿過(沒有結合物質)，泳道5空泳道，泳道6捕獲池(從Capto MMC柱結合和洗脫的蛋白物質)。
圖3是矩形圖，顯示了重組體因子VIII的百分比產率，其中使用Capto MMC樹脂進行純化，用含有各種濃度的NaCl或NH4Cl和乙二醇的不同洗脫緩沖液。
圖4顯示了重復冷凍/解凍循環對捕獲池中因子VIII的穩定性的效果。
本發明的說明 純化凝血因子VIII的本方法是通過使用多元(multimodal)色譜(使用疏水性的和帶負電荷的樹脂)來進行的。將準備純化的蛋白溶液，例如，從哺乳動物細胞發酵作用中獲得的含有蛋白的上清液，通過使溶液含有所述樹脂的色譜柱，從而施加到多模式(multimodal)樹脂上。一般將溶液(裝填)過濾(例如，通過死端式過濾或交叉流過濾)和/或離心，以便在裝填到樹脂上之前除去細胞和顆粒。裝填步驟不需要調節pH值或電導率。裝填之后，一般用一或多種洗滌緩沖液洗滌柱，其中之一含有高濃度的鹽。在一個實施方案中，裝填之后，用平衡緩沖液洗滌柱，任選接著用第二個含有高濃度鹽的緩沖液洗滌。
為了回收吸附的物質，使包含高濃度鹽和有機溶劑的洗脫緩沖液通過柱來進行洗脫。
與裝填樣品的體積相比(和由其計算)，本發明提供了大約250倍的柱體積(CV)減少，由此獲得出色的體積減小。“體積減少”是指當與含有蛋白的裝填溶液(例如，得自于發酵工藝的澄清粗品樣品)的體積相比時，含有蛋白的洗脫溶液體積的減少。
本發明的純化方法進一步提供了70-100％的蛋白產率，并且純化系數(比活性增加)最高達100倍。在-70℃，得到的純化蛋白在洗脫緩沖液中至少可以穩定2個月。
此外，本發明方法可提供穩定的因子VIII溶液捕獲洗脫物可以至少冷凍和解凍3次，而活性沒有顯著損失。
本發明使用多元(multimodal)色譜樹脂從污染物中分離使人感興趣的因子VIII蛋白。已經確定多元(multimodal)色譜(其中兩種或多種不同的、但合作的(co-operative)位點與靶向相互作用)是純化因子VIII蛋白的合適系統。在本發明中純化重組蛋白所使用的色譜樹脂是可商購的，例如Capto MMCTM(GE Healthcare)或MBI HyperCelTM(Pall，原來是BioSepra)。
Capto MMC含有配體(帶有多模式(multimodal)官能團)，與傳統離子交換劑相比，其可以得到不同的選擇性，并且還可以在高達0.5M至1.0M的鹽濃度下提供結合蛋白的可能性。本文的配體顯示了與靶分子相互作用的不同的官能性，并由此呈現出離子相互作用、氫鍵合和疏水性相互作用。在本發明的一個實施方案中，多模式(multimodal)樹脂是Capto MMCTM。
MBI HyperCelTM(Pall)(另一種多元(multimodal)色譜)可有效處理穩定性問題和蛋白基親和柱的滲漏問題。更具體地說，MBIHypercelRTM(Pall)(吸附劑，包含巰基-苯并咪唑-磺酸配體)可以提供與所提供蛋白的疏水性以及離子性相互作用。可以將疏水性相互作用假設為由于芳香環系統，而離子相互作用應該由于SO3-取代基，其被稱為強陽離子交換劑。另外，在一定條件下，MBI配體的芳香系統的氮原子是帶電的，并因而可以提供與帶負電荷基團的離子性相互作用。
在一個有利的實施方案中，污染物被吸收到多模式(multimodal)配體上，并且通過隨后的選擇性洗脫，將凝血因子VIII的基本上純的餾份回收。捕獲步驟可提供至少80倍的純化系數(比活性增加)，例如80至100倍、90至100倍或100-160倍。
得到的捕獲池包含至少10％純度的因子VIII蛋白，例如至少20％或大約30％至60％的純度，例如30％至50％純度。以凝血因子VIII的量占蛋白總量的％(w/w)(例如，通過ELISA測定)來定義純度。
在本方法的一個實施方案中，裝填到多元(multimodal)色譜樹脂上的溶液是含有因子VIII的、得自于哺乳動物細胞發酵作用的采集物。在其一個實施方案中，將所述采集物過濾和/或離心，以除去細胞和顆粒；在另一個實施方案中，將采集物裝填到樹脂上，不用調節裝填溶液的pH值或電導率。
本發明具體包括一種方法，在該方法中，裝填步驟包括在與含有凝血因子VIII的采集物的pH值和電導率相類似的pH值和電導率條件下，將含有蛋白的裝填溶液裝填到樹脂上，其中采集物得自于哺乳動物細胞發酵作用，任選是經過過濾的采集物。
通過限制體積(否則需要調節(降低)裝填溶液的電導率)，這可以在初始捕獲步驟中提供更大的優點。
在一個實施方案中，通過加入咪唑(例如，每升采集物加入1-10mmol咪唑)，使含有因子VIII的采集物穩定化。與采集物的體積相比，由于所加入咪唑的數量和體積很小，采集物的pH值和/或電導率的任何變化可以忽略不計。在進一步實施方案中，然后將采集物(i)過濾和/或離心，以除去細胞和顆粒，和(ii)裝填到樹脂上，而不用進一步加入化學試劑。
本發明的方法一般進行若干步驟柱的平衡、裝填和洗脫。裝填之后和洗脫之前，可以包括一個或多個洗滌步驟。洗滌步驟一般使用至少一種含有高濃度鹽的緩沖液進行。在一個實施方案中，使用緩沖液來進行洗滌步驟，該緩沖液包含10mM至1000mM鹽，例如100-1000mM鹽，或250-1000mM鹽，或500-1000mM鹽，或500-800mM鹽。在另一個實施方案中，該方法包括洗滌步驟，在該步驟中，裝填之后，將柱首先用平衡緩沖液洗滌，然后用含有高鹽的第二個緩沖液洗滌。
在一個實施方案中，平衡緩沖液包含緩沖劑(例如，5mM至100mM范圍內的咪唑，例如20mM咪唑)，Ca鹽(1mM至100mM，例如10mMCaCl2)，洗滌劑(例如0.001％至0.1％(w/v)范圍內的TweenTM 80，例如0.02％(w/v)TweenTM 80)和鹽(10mM至1000mM，例如50mM NaCl)。平衡緩沖液保持6.0至8.0的pH值條件下；優選，pH條件保持在7.3至7.5。本領域技術人員可以理解，本文舉例說明的因子VIII蛋白在大約6.0至8.0的pH值條件下是穩定的，并由此平衡緩沖液是在7.3-7.5的pH值條件下，更優選pH7.5。
在一個實施方案中，洗滌緩沖液包含緩沖劑(例如，5mM至100mM范圍內的咪唑，例如20mM咪唑)，Ca鹽(1mM至100mM，例如10mMCaCl2)，洗滌劑(例如0.001％至0.1％(w/v)范圍內的TweenTM 80，例如0.02％(w/v)Tween 80)和鹽(例如在50mM至1000mM范圍內的NaCl)。
用洗脫緩沖液進行洗脫步驟，緩沖液包含至少1.5M的鹽和至少40％(w/v)的乙二醇、丙二醇或其混合物和鈣離子(1mM至100mM，例如10mM CaCl2)。洗脫緩沖液具有6.0至8.0的pH值；優選，pH條件保持在7.3至7.5。為了保持目標pH值條件，洗脫緩沖液還含有緩沖劑。
術語“緩沖劑”包括能夠使溶液pH值保持在目標范圍之內的那些試劑，在本發明的范圍內，目標范圍在6.0至8.0、例如7.3至7.5范圍內。為了保持溶液的優選pH值，應該選擇緩沖液濃度范圍。緩沖劑還可以是至少兩種緩沖劑的混合物，其中該混合物能夠提供特定范圍的pH值。
緩沖劑可以包括但不局限于檸檬酸(鈉或鉀)鹽，乙酸(銨、鈉或鈣)鹽，組氨酸(L-組氨酸)，磷酸(鈉或鉀)鹽，酒石酸，琥珀酸，MES，HEPES，咪唑，TRIS，乙醇胺，和其兩種或多種的混合物。在一個實施方案中，使用的緩沖劑是在5mM至100mM范圍內的咪唑。
優選的鹽是NaCl，NH4Cl，KCl，(NH4)2SO4，CH3CO2NH4(乙酸銨，NH4Ac)，或其兩種或多種的混合物。在一個實施方案中，洗脫緩沖液包含大約2.5M的鹽和至少40％的二醇；在另一個實施方案中，洗脫緩沖液包含大約2.5M的鹽和大約50％的二醇。在一個實施方案中，鹽是NaCl；在另一個實施方案中，鹽是NH4Cl。在一個實施方案中，二醇是乙二醇；在另一個實施方案中，二醇是丙二醇。在又一個實施方案中，洗脫緩沖液包含NaCl和乙二醇。
在另一個實施方案中，濃度2.5M的NH4Cl與乙二醇也用于洗脫蛋白。在又一個實施方案中，洗脫緩沖液進一步包含洗滌劑。在本方法的一個具體實施方案中，洗脫液是20mM咪唑、10mM CaCl2、0.02％(v/v)Tween 80、2.5M NaCl和8M乙二醇(pH7.5)。
在另一個實施方案中，MBI HyperCelTM樹脂在本方法中用于純化因子VIII。在一個實施方案中，向采集物中加入100mM Na2SO4之后，使用MBI HyperCelTM柱進行重組體因子VIII的結合，用1M NaCl和5M丙三醇進行洗脫。
在本發明的一個具體實施方案中，本方法包括下列步驟 a)使因子VIII與含有配體的多模式(multimodal)或混合式樹脂接觸，該配體包含疏水性部分和帶負電荷的部分； b)用平衡緩沖液和洗滌緩沖液通過柱，平衡緩沖液包含20mM咪唑，10mM CaCl2，0.02％(w/v)Tween 80和50mM NaCl，洗滌緩沖液包含20mM咪唑，10mM CaCl2，0.02％(w/v)Tween 80和1.5M NaCl； c)用洗脫緩沖液洗脫所述蛋白，洗脫緩沖液包含20mM咪唑、10mMCaCl2、0.02％(v/v)Tween 80、2.5M NaCl和8M乙二醇。
在最通常的情況下，純化重組蛋白質(在哺乳動物細胞中表達)的第一步操作大的裝填體積。對于商業化的蛋白純化，重要的是減少體積，以達到容易操作。此外，對于商業或其它目的，純化步驟必須具有顯著的產率，以便獲得經濟性的方法。在第一步中，大約20至100倍的體積減少的目的在于，在蛋白純化的第一步中，認為純化是充分的體積減少。
在一個實施方案中，含有將要純化的蛋白的裝填體積超過500柱體積(CV)。洗脫后的蛋白提供超過100倍的最終體積減少。本發明包括50-600CV的裝填體積。優選，體積減少是大約100-300倍。在一個實施方案中，裝填體積大約為500CV，或大約為450-600CV，并且用大約2CV來洗脫因子VIII蛋白，獲得大約250倍的體積減少。
在另一個實施方案中，捕獲步驟可以與一或多種病毒滅活劑結合，例如Triton X-100(例如，大約1％(w/v)的濃度)。病毒滅活劑可以例如加入到一或多種所使用的緩沖液中。
除洗脫和現場清洗(CIP)步驟(其中流速是30-350cm/h)之外，對于本純化方法的所有步驟，流速控制在300-950cm/hr之間。
在一個實施方案中，裝填流速是450cm/h；在洗脫和CIP期間，流速減少到30cm/h。在本發明的一個實施方案中，裝填流速大約為450-600cm/h。
在一方面，本發明還涉及包含下列的制劑 (i)因子VIII蛋白；和(ii)緩沖液，其含有至少1.5M的鹽和至少40％(w/v)的乙二醇、丙二醇或其混合物和鈣離子； 其中因子VIII是30％至60％純度。
定義 在本發明中，“因子VIII蛋白”是指包括全長因子VIII、FVIII:C和具有凝結活性的全長因子VIII的缺失衍生物。對于缺失衍生物，它是指其中B區域的全部或部分失去、同時保留凝結活性的因子VIII。因子VIII的這種B區域缺失形式描述在例如WO91/09122中。通常，因子VIII的結構和生物化學已經由Kaufman進行了描述(Trends inBiotechnology，9，p.353-359(1991)and Hematology，63，p.155-165(1991))。還包括因子VIII序列變體和衍生物，包括因子VIII的PEG化的、酰化的和多唾液酸化(polysialylated)形式，同時保持特征性的因子VIII生物活性。因子VIII可以通過重組方法獲得。在一個實施方案中，因子VII是重組制備的因子VIII。在一個實施方案中，因子VIII是全長因子VIII；在另一個實施方案中，因子VIII蛋白是B區域缺失的因子VIII。在又一個實施方案中，因子VIII是PEG化的、酰化的或多唾液酸化的因子VIII。
衍生自人血漿的因子VIII濃縮物含有一些不完整的完全活性的因子VIII形式，如下列所描述Andersson等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83，p.2979-2983(1986))。最小的活性形式具有170kDa的分子量，并且由90kDa和80kDa的兩個鏈組成，兩個鏈通過金屬離子結合在一起(參見，例如EP197901)。還包括這種因子VIII片段，這種片段的純化構成本發明的一個實施方案。
按照例如實驗部分中描述的方法來試驗因子VIII的生物活性(見下文)。
術語“洗脫液”是指本領域所確定的其常規含義，其是具有合適的pH值和/或離子強度的緩沖液，以便從分離基質中釋放一或多種蛋白或化合物。
在洗脫步驟中，本文使用的“鹽”是指堿土金屬鹽、堿金屬鹽或銨鹽，即，具有源于堿土或堿金屬元素的陽離子或銨陽離子和具有無機或有機(基于烴)陰離子的鹽。這種鹽的實例包括氯化鈉，氯化銨，枸櫞酸鈉，檸檬酸鉀，氯化鉀，氯化鎂，氯化鈣，磷酸鈉，磷酸鈣，磷酸銨，磷酸鎂，磷酸鉀，硫酸鈉，硫酸銨，硫酸鉀，硫酸鎂，硫酸鈣，等等。本文優選的鹽是氯化物或硫酸鹽。本文最優選的鹽是氯化鈉。
術語“多元色譜配體”是指能夠提供至少兩種不同的、但合作的位點的配體，該位點與所要結合的蛋白相互作用。這些位點之一在配體和感興趣的物質之間給出吸引類型的電荷-電荷相互作用。另一個位點一般提供電子受體-供體相互作用和/或疏水和/或親水相互作用。本發明尤其涉及疏水性相互作用。電子供體-受體相互作用包括例如下列相互作用氫鍵，.pi-.pi，cation-.pi，電荷轉移，偶極-偶極，誘導偶極等等。本文或其它地方使用的多元色譜配體亦稱為“混合模式”色譜配體。
在液相色譜的范圍內，術語“捕獲步驟”指的是分離方法的初始步驟。最通常，捕獲步驟包括從可溶性污染物中凈化、濃縮、穩定和顯著的純化。捕獲步驟之后，可以接著進行中間物純化，純化可以除去大部分顯著的雜質，包括DNA、病毒和內毒素。這些雜質還可以在捕獲過程中除去/減少。
術語“精制步驟”是指最后的純化步驟，在該步驟中，除去痕量染污物和雜質，并且得到活性生物制品。在精制步驟期間除去的污染物常常是靶分子的構象異構體，或可能是滲漏的產品。
色譜領域已知的術語“柱體積”是指含有填裝物的管部分的幾何體積。按照本發明，裝填體積超過50柱體積(CV)或多于或小于大約300-600CV或450-600CV。在純化的最后步驟洗脫的蛋白大約為2-5CV，獲得大約100倍至350倍的體積減少，例如250倍。
“純化系數”定義為比活性的增加也就是說，純化步驟之前的U/mg蛋白與純化步驟之后的U/mg蛋白相比值。
利用商業上可得到的活性試驗，例如按照制造商的方案使用CoaTest

ChromogenixTM(Instrumentation Laboratory，Belgium)，或下面實驗部分中描述的方法，可以試驗凝血因子VIII的比活性。
術語“一步法”是指純化含有一或多種污染物的因子VIII蛋白的方法，其中該方法可同時獲得體積減少和比活性增加(純化系數＞1)。
在本發明的一個實施方案中，該方法可提供(i)大約250倍的柱體積減少，和(ii)至少30倍的“純化系數”。
參考下列實施例，可以更充分地理解本發明。然而，不應該將這些實施例理解為限制本發明的范圍。
實施例 過去已經描述了重組體因子VIII的結構和生物化學。(參見，例如Trends in Biotechnol.1991，9353-359，Transfus.Med.Rev.1992，6235-246。
此外，本領域還描述了因子VIII的分離以及因子VIII的重組體生成(全長和變體/截短形式) 重組DNA技術已經可以構成質粒，其在轉染哺乳動物細胞中控制因子VIII蛋白的融合產物的表達。在細胞培養物中的因子VIII的重組體生成由Wood等人進行了報道(參見Nature，1984，312330-337)。還報道了因子VIII蛋白的活性變體和類似物和編碼它們的DNA序列(US4868112，EP0786474，WO 86/06101和WO 87/07144)。遺傳序列的各種操作已經表明，因子VIII的B區域對于促凝血活性不是關鍵性的，并且活性促凝血蛋白可以通過表達編碼因子VIII的、缺乏B區域的核苷酸區域來表達。在這種變體和類似物中，重要的修飾包括部分或所有B區域失去，和/或具體氨基酸位置發生改變，例如，這樣就可以使正常蛋白酶-不穩定位點對解朊作用(例如通過凝血酶或活化蛋白C)具有抗性。其它類似物包括在一或多種賴氨酸和/或酪氨酸殘基處的修飾。蛋白的截短形式是由1438個氨基酸組成的170kDa糖蛋白。這種B區域缺失的蛋白是血漿衍生的因子VIII的翻譯后修飾，并且在抗血友病活性方面可以與母體相比。
因子VIII活性試驗 評價凝血因子VIII的生物活性的試驗對技術人員來說是眾所周知的，并且這種試驗可以在商業上得自于許多供應者。
純化因子VIII的活性可以例如按照制造商的方案、使用CoaTest

Chromogenix(Instrumentation Laboratory，Belgium)來試驗。
實施例1 因子VIII的重組體生成在本領域是眾所周知的；參考文獻可以是例如US 5633150(Genentech)和US 7138505(Novo Nordisk/Novartis)。
在可商購的不含血清的介質中，在CHO細胞中表達重組體因子VIII。得自于發酵作用的蛋白采集物進一步用于純化。
實施例2 重組體因子VIII的純化 Capto MMC(GE Healthcare，Uppsala，Sweden)樹脂用于重組蛋白的純化。用12cm的床高度和24ml床體積填裝柱。
對于第一步，純化方法包括裝填，其中將得自于發酵作用的采集物施加到柱上。裝填的柱體積(CV)是450CV(表1)。而后，使平衡緩沖液通過柱，平衡緩沖液由20mM咪唑、10mM CaCl2、0.02％(v/v)Tween 80和50mM NaCl組成。將平衡緩沖液的pH值調節至7.5。在pH值等于平衡緩沖液的pH值(即7.5)的條件下，將柱進一步用洗滌緩沖液(20mM咪唑，10mM CaCl2，0.02％(v/v)Tween 80和1.5M NaCl)洗滌。平衡和洗滌步驟的柱體積是3CV(表1)。
表1.在因子VIII純化的各個步驟中使用的柱體積(CV) 使洗脫緩沖液通過柱，進行洗脫。洗脫緩沖液由20mM咪唑、10mMCaCl2、0.02％(v/v)Tween 80和2.5M NaCl和8M乙二醇組成。
除洗脫和CIP(在此期間，流速是30cm/h)之外，在純化的所有步驟中，流速保持在450cm/h。
在通過平衡、裝填、洗滌和洗脫進行操作的純化過程中，表明在280nm處的UV吸收的色譜圖，提供于圖1中。
實施例3 活性試驗 使用CoaTest

SP試驗的改型來測定純化因子VIII的活性 使用得自于CoaTest

SP試劑盒的試劑和緩沖液儲備溶液。在開始實驗之前，使所有的試劑達到室溫。將樣品在CoaTest試驗緩沖液(50mMTris，150mM NaCl，1％BSA，pH7.3，含有防腐劑)中稀釋至大約2mU/ml。將參比血漿在試驗緩沖液中稀釋至5-0.5mU/ml。將樣品在試驗緩沖液中稀釋至12和9U/ml，然后在缺乏FVIII的血漿(含有VWF(DadeBehring))中稀釋10倍，最后在CoaTest

試驗緩沖液中稀釋10和20倍((每種試樣產生4個稀釋度)。將50μl樣品、標準樣品和緩沖液陰性對照加入到96孔微孔板(Nunc)中，一式兩份。將因子IXa/因子X試劑、磷脂試劑和CaCl2(得自于CoaTest

SP試劑盒)以5∶1∶3(vol∶vol∶vol)的比例混合，并將其75μl加入到孔中。在室溫下培養15min之后，加入50μl因子Xa底物S-2765/凝血酶抑制劑I-2581的混合物，在室溫下培養反應10min，而后加入25μl 2％枸櫞酸。在Spectramax

微孔板讀數器(Molecular Devices)上測定415nm處的吸光度，以及用作參考波長的620nm處的吸光度。從所有樣品中減去陰性對照值，通過吸光度值對FVIII濃度(mU/ml)作圖的線性回歸制作標準曲線。
ELISA試驗 基本上按照制造商所描述的方法，使用商業ELISA試劑盒(得自于Affinity Biologicals(VisuLize因子VIII抗原試劑盒，Lot AG8-0006))測定因子VIII抗原。
從上面實施例2中描述的發酵采集物中純化重組體因子VIII。利用上述CoA和ELISA，測定因子VIII蛋白的純化系數和產率 純化凝血因子和產率(利用CoA試驗測定)(表2) 從上面的結果可知，有可能將含有FVIII的介質從11000ml濃縮至45ml(244倍)，同時比活性從55U/mg增加至5300U/mg，例如，獲得96倍的純化系數(通過活性測量法測定)。
純化系數和產率(利用ELISA測定)(表3) 從上面的結果可知，有可能將含有FVIII的介質從11000ml濃縮至45ml(244倍)，同時比活性從0.0046mg因子VIII/mg總蛋白增加至0.6mg因子VIII/mg總蛋白，例如，獲得130倍的純化系數(通過ELISA測定)。
實施例4 蛋白凝膠電泳 基本上按照制造商(Invitrogen)的描述，使用7％NuPage

tris乙酸鹽凝膠，使用tris乙酸鹽作為運行緩沖液，進行SDS凝膠電泳。簡要地說，在150伏特將凝膠電泳進行50min，并按照制造商說明書中描述的方法，將樣品用SilverQuest

染色試劑盒(Invitrogen)進行染色。使用的分子量(MW)標準是Mark12(得自于Invitrogen)。
示于圖2的結果顯示，在捕獲池中重組體因子VIII的富集程度很高，這可以通過存在高數量的重鏈(HC)和輕鏈(LC)譜帶而得到說明(通過圖2中的箭頭表明)。
實施例5 通過SDS-凝膠電泳顯現的純化 在含有50mM DTT的LDS樣品緩沖液(Invitrogen)中，將用于電泳的蛋白樣品在70℃下變性和還原10分鐘。分離凝膠是7％tris-乙酸鹽(TA)Pre-Cast Novex聚丙烯酰胺凝膠(Invitrogen)，并在150V的極限電壓下進行電泳60min，用tris-乙酸鹽緩沖液(Invitrogen)作為陽極和陰極緩沖液。按照制造商的說明書，使用SilverQuest

(Invitrogen)進行銀染色。
凝膠舉例說明了使用捕獲MMC柱獲得的大量純化。細胞介質含有一系列蛋白。使這些蛋白的大部分通過柱，而因子VIII在柱的捕獲池中高度濃縮。
實施例6 洗脫條件 對于Capto MMC樹脂試驗各種洗脫條件。向含有重組體因子VIII的采集物中加入丙三醇(5％最后濃度)和CHAPS(5mM)。用20mM咪唑、10mM CaCl2、Tween 80(0.2％v/v)、50mM NaCl、5mM CHAPS和5％丙三醇的平衡緩沖液(pH7.5)進行平衡。
使用20mM乙醇胺、10mM CaCl2、Tween 80(0.2％v/v)的洗脫緩沖液(pH8.3)，含有不同的鹽和乙二醇濃度，其包括a.不加入；b.1MNH4Cl；c.2.5M NH4Cl；d.3M乙二醇；e.1M NH4Cl+3M乙二醇；f.2.5MNH4Cl+3M乙二醇；g.8M乙二醇；h.1M NH4Cl+8M乙二醇；I.2.5MNH4Cl+8M乙二醇；2.5M NaCl+8M乙二醇。基于百分比產率測定洗脫條件。圖3表明，在2.5M NH4Cl或2.5M NaCl和8M乙二醇的濃度條件下，蛋白的百分比產率最大(圖3)。
實施例7 捕獲池的冷凍/解凍穩定性 對捕獲池的等分樣品(從實施例2中描述的Capto MMC樹脂中洗脫)進行多次冷凍/解凍循環，在-80℃冷凍過夜，而后在第二天、在4℃解凍。在實驗的最后，使用CoA試驗(實施例3中描述的CoaTest

ChromogenixTM)同時對所有樣品測定因子VIII活性。
表4.重復冷凍/解凍循環之后的捕獲池中的因子VIII的比活性
權利要求
1.純化含有一或多種污染物的凝血因子VIII蛋白的方法，該方法包括下列步驟
(a)使因子VIII蛋白與含有配體的多模式或混合模式樹脂接觸，該配體包含疏水性部分和帶負電荷的部分；
(b)用洗脫緩沖液將所述因子VIII蛋白洗脫，緩沖液含有至少1.5M的鹽和至少40％(w/v)的乙二醇、丙二醇或其混合物和鈣離子。
2.按照權利要求1的方法，進一步包括步驟(c)其中將源于步驟(b)的含有因子VIII的溶液進行收集。
3.按照權利要求1的方法，進一步包括步驟(a1)其中在步驟(a)之后和步驟(b)之前，使一或多種洗滌緩沖液通過柱。
4.按照權利要求3的方法，其中一或多種洗滌緩沖液包含10mM至1000mM鹽。
5.按照權利要求4的方法，其中洗滌緩沖液含有0.5-0.8M鹽。
6.按照權利要求1-5的任一項的方法，其中步驟(b)的洗脫緩沖液含有至少2M的鹽和至少45％(w/v)的乙二醇、丙二醇或其混合物。
7.按照權利要求6的方法，其中步驟(b)的洗脫緩沖液含有2.3-2.6M的鹽和48-52％(w/v)的乙二醇、丙二醇或其混合物。
8.按照權利要求1-7的任一項的方法，其中包含在步驟(b)的洗脫緩沖液中的鹽選自NaCl，NH4Cl，KCl，(NH4)2SO4，CH3CO2NH4，或這些中的兩種或多種的混合物。
9.按照權利要求8的方法，其中所述洗脫緩沖液含有NaCl和乙二醇。
10.按照權利要求1的方法，其中洗脫緩沖液含有1mM至100mM濃度的鈣離子。
11.按照權利要求1-10的任一項的方法，其中步驟(a)是如下進行的
(i)在pH值等于裝填溶液的pH值的條件下，和/或
(ii)不調節電導率。
12.按照權利要求1-11的任一項的方法，其中因子VIII蛋白選自全長因子VIII，FVIII:C，因子VIII的B區域缺失形式，因子VIII的PEG化的衍生物，因子VIII的多唾液酸化(polysialylated)的衍生物，和其組合，優選因子VIII的B區域缺失形式。
13.按照權利要求1-12的任一項的方法，其中步驟(b)中的洗脫緩沖液由下列組成20mM咪唑，10mM CaCl2，0.02％(w/v)Tween 80和2.5MNaCl和gM乙二醇，pH值大約7.5。
14.純化含有一或多種污染物的因子VIII蛋白的一步法，該方法包括下列步驟
a)使蛋白與含有配體的多模式樹脂接觸，該配體包含疏水性部分和帶負電荷的部分；
b)用洗脫緩沖液將所述蛋白洗脫，緩沖液含有至少1.5M的鹽和至少40％(w/v)的乙二醇、丙二醇或其混合物，和鈣離子；
其中所述方法使柱體積減少大約250倍。
15.純化含有一或多種污染物的因子VIII蛋白的一步法，該方法包括下列步驟
a)使蛋白與含有配體的多模式樹脂接觸，該配體包含疏水性部分和帶負電荷的部分；
b)用洗脫緩沖液將所述蛋白洗脫，緩沖液含有至少1.5M的鹽和至少40％(w/v)的乙二醇、丙二醇或其混合物，和鈣離子；
其中所述方法獲得至少30倍的“純化系數”。
16.使因子VIII蛋白穩定的方法，該方法包括下列步驟
a)使蛋白與含有配體的多模式樹脂接觸，該配體包含疏水性部分和帶負電荷的部分；
b)用洗脫緩沖液將所述蛋白洗脫，緩沖液含有至少1.5M的鹽和至少40％(w/v)的乙二醇、丙二醇或其混合物，和鈣離子。
全文摘要
本文描述了使用含有配體的多模式或混合式樹脂來純化重組蛋白質的方法，其中配體包含疏水性部分和帶負電荷的部分。本發明具有以下優點它是單步色譜方法，在裝填步驟期間不需要調節pH值或電導率，并且具有高的產率和效能。該方法用于凝血因子的重組體組合物的純化，尤其是重組體因子VIII。
文檔編號C07K14/755GK101730707SQ200880023645
公開日2010年6月9日 申請日期2008年7月11日 優先權日2007年7月11日
發明者S·邦, L·西姆, J·卡爾森 申請人:諾沃-諾迪斯克有限公司