專利名稱：：人禽流感特異性免疫球蛋白及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種人禽流感特異性免疫球蛋白，其制備方法、使用方法及用途。
背景技術(shù)：
：20世紀(jì)曾經(jīng)出現(xiàn)過三次世界范圍流感大流行。1918年"西班牙流感"是由H1N1亞型引起，造成全球死亡人數(shù)超過4000萬，是人類歷史上流感死亡病例最多的一次；1957年"亞洲流感"是由新出現(xiàn)的H2N2亞型引起，造成200多萬人死亡；1968年H3N2亞型引起的"香港流感"造成全球死亡人數(shù)超過100萬，H1N1和H3N2亞型流感病毒至今還在人類中流行。近年來，H5N1亞型在禽間引起流感暴發(fā)，也不斷有高病死率的人感染病例發(fā)生，是公認(rèn)的最有可能引起流感大流行的病毒亞型。H5N1是屬于禽類的病毒，人感染H5N1俗稱禽流感，禽流感人間感染與禽間疫情密切相關(guān)。1997年在香港發(fā)生人感染H5N1病毒時，禽間的高致病性H5N1疫情十分嚴(yán)重。當(dāng)這種病毒變異而引起世界范圍的暴發(fā)流行時，禽流感就演變?yōu)榇罅餍辛鞲小Ａ鞲写罅餍械娘@著特征是快速傳遍世界各地，通常在不到一年的時間使世界四分之一以上的人口患病，極高的致病性和極高的致死率，造成的經(jīng)濟(jì)損失和社會影響巨大。1997年在香港，18例中有6例死亡。2003年在香港再次出現(xiàn)2個H5N1感染病例，l例死亡。此后人類感染的個案數(shù)目不斷上升，截止2008年4月30日，已有14個國家的382人感染H5N1，其中241例死亡，中國有30例，20例死亡，病死率超過60%。2003年底由東南亞開始再次持續(xù)暴發(fā)禽間H5N1感染，并蔓延到亞洲、歐洲、非洲。世界范圍不斷有人感染H5N1病例。世界衛(wèi)生組織將流感流行程度分為6個級別，當(dāng)前狀況為3級(黃色預(yù)警),發(fā)生大流行的風(fēng)險(xiǎn)嚴(yán)重。當(dāng)流感流行情況滿足以下3個條件時，就會開始大流行新流感病毒亞型的出現(xiàn)、在受感染人群中引起嚴(yán)重病癥以及在人間快速持續(xù)傳播。H5N1病毒已經(jīng)滿足前2個條件，只欠缺人與人之間的有效和持續(xù)傳播，一旦H5N1病毒演變?yōu)橄蟪Ｒ?guī)流感病毒一樣容易傳播，流感大流行就開始了。一旦流行，會給社會和經(jīng)濟(jì)帶來巨大的破壞，所以每個國家都要有所準(zhǔn)備。流感是一種常見的急性呼吸道傳染病，由流感病毒引起。流感病毒的最大特點(diǎn)是遺傳變異性強(qiáng)，當(dāng)高致病性的流感病毒新亞型出現(xiàn)后，因全體人群對其均無免疫力而暴發(fā)流行，可能引起世界性流感大流行。流感病毒屬于正粘病毒科，共有A、B、C三型，中文稱甲、乙、丙型，甲型是引起流感的主要型別，甲型病毒變異快，除感染人外，還感染馬、豬、禽、海豹等動物，它的大量亞型在天然宿主鳥類中得到保存，形成多樣化的基因池；這些特征使甲型流感病毒不斷引起人類季節(jié)性流感流行，并不定期的導(dǎo)致人類流感大流行。流感病毒表面有血凝素H和神經(jīng)氨酸酶N兩種表面抗原。H又可分為Hl-H16，N可分為N1-N9。不同的血凝素和不同的神經(jīng)氨酸酶可以配合成一個個具有不同抗原性和致病性的流感病毒，稱之為流感病毒亞型。目前引起人類流行的甲型流感病毒屬于Hl和H3亞型。流感病毒是帶囊膜的RNA病毒，在復(fù)制過程中沒有糾錯機(jī)制，易發(fā)生復(fù)制錯誤，形成抗原漂移，從而形成基因略有不同的新病毒，人類以往的免疫對變化病毒引起的感染不具有保護(hù)性，由此引起流感季節(jié)性流行。流感病毒內(nèi)部有8個RNA節(jié)段，在這種結(jié)構(gòu)下，當(dāng)宿主同時感染兩種病毒時，易發(fā)生節(jié)段互換，形成抗原更換，從而形成人類不具備免疫力的新的病毒亞型，有可能引起大流行。流感病毒通過這兩種變異機(jī)制形成短期和長期生存機(jī)制。世界各地的禽間流感主要由高致病性的H5、H7、H9亞型引起，近年來H5亞型較為活躍。在禽間流行導(dǎo)致人類感染甚至死亡的高致病性H5N1病毒已經(jīng)演化為兩個基因組，以越南株為代表的基因組1引起2004-2005年東南亞地帶的人類感染，包括印尼株、青海株和安徽株在內(nèi)的基因組2引起2005-2006年印尼、中東、歐洲和中國等地的人類感染。人感染高致病性禽流感后，起病急，早期表現(xiàn)類似普通流感。主要表現(xiàn)為發(fā)熱，體溫大多在39攝氏度以上，持續(xù)17天，一般為34天，可伴有流涕、鼻塞、咳嗽、咽痛、頭痛、全身不適，部分患者可有惡心、腹痛、腹瀉、溪水樣便等消化道癥狀。除了上述表現(xiàn)之外，幾乎所有的病人都在臨床上表現(xiàn)為肺炎，并會出現(xiàn)急性呼吸窘迫癥，進(jìn)而發(fā)展為呼吸衰竭、多臟器衰竭。嚴(yán)重的病例可導(dǎo)致死亡。與其他病毒性疾病一樣，流感沒有特效藥可以治療，因此預(yù)防十分重要。接種疫苗作為第一道防線，可以預(yù)防人類感染H5N1病毒，降低發(fā)病率，住院率和死亡率，減少禽流感大流行對社會的破壞。H5N1疫苗可以用于預(yù)防H5N1病毒引起的流感。疫苗被注入人體后，會刺激人體產(chǎn)生特異性抗體，抵抗相應(yīng)流感病毒株的侵襲。季節(jié)性流感疫苗中不含有針對H5N1型流感病毒的抗原，不能用于預(yù)防H5N1感染。目前全球制備和進(jìn)入臨床試驗(yàn)的H5N1疫苗多采用最先分離出來的越南株。但當(dāng)前主要引起人類H5N1感染的已經(jīng)不是越南株，而且最終引起大流行流感的病毒株不確定，雖然試驗(yàn)證實(shí)越南株對其他株病毒有一定的交叉免疫，越南株僅僅是世界衛(wèi)生組織建議臨床試驗(yàn)的主要疫苗株。在中國，由北京科興生物制品有限公司與中國疾病預(yù)防控制中心共同研制的大流行流感滅活疫苗于2008年4月獲得國家食品藥品監(jiān)督管理局頒發(fā)的藥品注冊批件(國藥準(zhǔn)字S20080005)，商品名為盼爾來福(PanfluTM)。采用的越南株(NIBRG-14,A/VietNam/1194/2003(H5Nl)RG)是英國國家生物制品標(biāo)準(zhǔn)與控制研究所采用反向遺傳技術(shù)制備，經(jīng)世界衛(wèi)生組織推薦的疫苗株。到目前為止，共有11個國家15個廠商的31個不同類型的原型疫苗(H5N1疫苗)向國際制藥聯(lián)合會備案并陸續(xù)進(jìn)入臨床研究階段，這些疫苗多建立在生產(chǎn)企業(yè)已有的常規(guī)流感疫苗工藝基礎(chǔ)上。大部分疫苗產(chǎn)品都處在臨床研究階段，有些已取得初步臨床結(jié)果。巴斯德、葛蘭素史克和諾華等公司的H5N1大流行流感疫苗獲得了歐美國家政府的儲備采購訂單。日本已經(jīng)公布為6000名醫(yī)療工作者進(jìn)行接種的計(jì)劃，一些國家也考慮為高危人群和醫(yī)院軍隊(duì)等國家職能機(jī)構(gòu)人員進(jìn)行預(yù)防接種。中國政府已經(jīng)有計(jì)劃地對該疫苗進(jìn)行儲備。然而，大流感疫苗是在特殊情況下或給特殊人群接種，是一種新的疫苗，其安全性、免疫原性、免疫持久性等信息相對有限。2007年10月，WHO在日內(nèi)瓦召開會議，對人用H5N1疫苗的使用和儲備進(jìn)行了討論，認(rèn)為大流感疫苗接種策略應(yīng)同時考慮大流行發(fā)生前階段的接種和大流行階段的接種；流感大流行發(fā)生前階段進(jìn)行大流感疫苗接種的影響因素主要為是否有禽間流行和人間病例這個階段接種疫苗可以限制動物源性造成的人類感染；雖然受試者接種疫苗后產(chǎn)生了特異性抗體，抗體水平達(dá)到了國際上公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)，但是疫苗的保護(hù)有效性只有在大流感來臨，人們面對H5N1病毒侵襲時才能印證。當(dāng)流感暴發(fā)流行，要分離毒株，確定型別，然后由世界衛(wèi)生組織實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建一個用于疫苗生產(chǎn)的毒株，然后分發(fā)給生產(chǎn)企業(yè)按照原型疫苗的生產(chǎn)路線制備疫苗，通過審批和檢定后在應(yīng)用到大流感疫情防控上。人群接種疫苗還需要一段時間產(chǎn)生保護(hù)性抗體，這是一個耗時的過程，從疫情出現(xiàn)到疫苗上市前的時間里，如何能夠保證醫(yī)療衛(wèi)生人員、社會功能保障人員以及其他高危人群能夠獲得有效的保護(hù)是一個具有挑戰(zhàn)意義的課題。按照傳統(tǒng)的觀點(diǎn)，接種疫苗是預(yù)防大流感流行的主要手段。許多國家的政府開始按照WHO推薦的毒株生產(chǎn)并儲備"原型疫苗"。所謂"原型疫苗"是使用WHO推薦的流感毒株制備疫苗，對生產(chǎn)工藝過程、檢定方法以及疫苗應(yīng)用等方面進(jìn)行驗(yàn)證，確保整體方案成熟可靠，當(dāng)大流感流行時，只需再遞交一個流行株變更申請，可以通過快速注冊審批通道，加快疫苗上市速度，及時應(yīng)對疫情，"原型疫苗"策略是專門針對禽流感爆發(fā)的應(yīng)急方案。然而，這個方案還是存在一些不完美的地方。真正大流行來臨的初期，即使使用WHO推薦的毒株制備疫苗也是有時間限制的，大流感爆發(fā)初期并無疫苗可用。爆發(fā)后WHO要依據(jù)全球流感監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)的數(shù)據(jù)，重新分離病毒，然后對病毒進(jìn)行檢定、重配、擴(kuò)增、分發(fā)；在疫苗株分發(fā)到生產(chǎn)廠商后，再經(jīng)過生產(chǎn)、檢定、報(bào)批、簽發(fā)；最后接種到人群，還要經(jīng)過一定時間人體才能產(chǎn)生有效保護(hù)性抗體。從確認(rèn)疫情到有疫苗可用要經(jīng)歷大約5個月以上的時間，這段時間除了啟動一些常規(guī)的重大公共安全預(yù)案以外，人們沒有更有效的辦法來應(yīng)對危機(jī)，對此幾乎只能束手無策。本發(fā)明是使用大流感H5N1病毒"原型疫苗"株制備疫苗，免疫志愿者，再采集志愿者血漿來制備的抗大流感病毒的靜脈注射用特異性免疫球蛋白制品，在大流感流行時，只需更換WHO推薦的流行株即可制備出用于治療大流感病毒感染者以及高危人群應(yīng)急被動免疫的血液制品。在特殊情況下，針對大流感流行期間的疫情控制需要，在疫苗上市前采集自然感染者的血槳進(jìn)行制備特免球蛋白的方法以及實(shí)施方案，用于最及時的病人治療與健康人群和醫(yī)護(hù)人員的被動免疫。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提出了一個具有創(chuàng)新意義的"原型抗體"概念，并通過動物實(shí)驗(yàn)和國內(nèi)病人臨床救治實(shí)驗(yàn)得到了很好的驗(yàn)證。"原型抗體"的定義是使用WHO合作中心或WHO批準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室推薦的H5Nl疫苗株按照藥監(jiān)部門批準(zhǔn)的工藝制備"原型疫苗"，再免疫健康志愿者，采集血衆(zhòng)，按照本發(fā)明的提供的技術(shù)路線制備出靜脈注射用特異性免球蛋白，即"原型抗體"，用于大流感病毒感染者的治療和疫情的防控，在大流行發(fā)生時，視疫情的需要既可以直接采集自然感染者的血清，也可以使用WHO新推薦的流行株免疫健康志愿者，采集血清，按照本發(fā)明的"原型抗體"的工藝路線制備特異性免疫球蛋白。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一種人禽流感特異性免疫球蛋白。本發(fā)明要解決的又一技術(shù)問題在于提供人禽流感特異性免疫球蛋白的制備方法。本發(fā)明要解決的又一技術(shù)問題在于提供一種藥物組合物，其中包括人禽流感特異性免疫球蛋白以及藥用載體和/或輔料。本發(fā)明要解決的再一技術(shù)問題在于提供人禽流感特異性免疫球蛋白制備在預(yù)防和/或治療禽流感藥物中的應(yīng)用。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為本發(fā)明涉及一種以禽流感NIBRG-14(H5N1)病毒株為免疫原制備的人禽流感特異性免疫球蛋白。本發(fā)明的人禽流感特異性免疫球蛋白是以禽流感NIBRG-14(H5N1)病毒株免疫健康人所獲得的血漿，經(jīng)硫酸銨鹽析、溴化鉀鹽析和蔗糖密度梯度離心，分離提取后再經(jīng)病毒滅活處理制備而成的特異性免疫球蛋白。本發(fā)明的人禽流感特異性免疫球蛋白還可以采用低溫乙醇分離法，分離禽流感NIBRG-14(H5N1)病毒株免疫健康人所獲得的血漿，再經(jīng)病毒滅活處理制備而成的特異性免疫球蛋白。本發(fā)明的另一優(yōu)選方案為以禽流感NIBRG-14(H5N1)病毒株免疫哺乳動物來制備人禽流感特異性免疫球蛋白。其中，哺乳動物選自豬、牛或羊。本發(fā)明的人禽流感特異性免疫球蛋白是肌肉注射用的特異性免疫球蛋白。其中，本發(fā)明的人禽流感特異性免疫球蛋白采用的分離提取方法為(1)將抗禽流感病毒血漿于04。C，1乂104轉(zhuǎn)/分鐘離心2040分鐘；(2)在04。C溫度條件下，取上清加入飽和硫酸銨溶液，使硫酸銨的質(zhì)量百分比濃度為4050%;攪拌1220小時后50008000轉(zhuǎn)/分鐘離心2050分鐘，收集沉淀；(3)在04"溫度條件下，將步驟(2)得到的沉淀加入0.01mol/LPBS溶液，完全吹溶后6000轉(zhuǎn)/分鐘離心2040分鐘，得到上清；在上清中添加固體溴化鉀使?jié)舛葹?.21.8mol/L，攪拌14小時后50008000轉(zhuǎn)/分鐘離心13小時；(4)重復(fù)步驟(3)的操作13次；(5)將步驟(4)的產(chǎn)物加入0.01mol/LPBS溶液吹溶，蔗糖密度梯度離心，轉(zhuǎn)速為2乂104轉(zhuǎn)/分鐘，蔗糖梯度質(zhì)量百分比濃度為810%、1216%、1822%、3540%，收集梯度離心產(chǎn)物；(6)超濾，采用0.200.25jLim的濾膜過濾。本發(fā)明采用的分離提取方法的優(yōu)選方案為(1)將抗禽流感病毒血漿于04。C，1乂104轉(zhuǎn)/分鐘離心2535分鐘；(2)在04。C溫度條件下，取上清邊攪拌邊加入飽和硫酸銨溶液，使硫酸銨的質(zhì)量百分比濃度為50%;攪拌1518小時后6000轉(zhuǎn)/分鐘離心2535分鐘，收集沉淀；(3)在04。C溫度條件下，將步驟(2)得到的沉淀中加入體積為抗病毒血漿2540%的0.01mol/LPBS溶液，完全吹溶后6000轉(zhuǎn)/分鐘離心2535分鐘，得到上清；在上清中添加固體溴化鉀使?jié)舛葹?.5mol/L，攪拌2~3小時后6000轉(zhuǎn)/分鐘離心2小時，收集沉淀；(4)重復(fù)步驟(3)的操作2次；(5)將步驟(4)的產(chǎn)物加入體積為抗病毒血漿2540%的0.01mol/LPBS溶液吹溶，蔗糖密度梯度離心，轉(zhuǎn)速為2乂104轉(zhuǎn)/分鐘，蔗糖梯度質(zhì)量百分比濃度為910%、1215%、1820%、3840%，收集產(chǎn)物；(6)超濾，采用0.200.24(im的濾膜過濾。本發(fā)明采用的病毒滅活處理采用巴氏消毒法病毒滅活，包括以下步驟將分離提取后的產(chǎn)物在pH5.0條件下6(TC滅活10小時。本發(fā)明的人禽流感特異性免疫球蛋白的制備方法包括以下步驟(1)用NIBRG-14病毒株接種培養(yǎng)病毒的組織，經(jīng)培養(yǎng)、收獲病毒液、滅活病毒和純化后制成禽流感疫苗；(2)將制備的禽流感疫苗免疫接種供血漿者，在最后一次免疫后第06個月采血；(3)將抗禽流感病毒血漿于04'C，1乂104轉(zhuǎn)/分鐘離心2040分鐘；(4)在04'C溫度條件下，取上清加入飽和硫酸銨溶液，使硫酸銨的質(zhì)量百分比濃度為4050%;攪拌1220小時后50008000轉(zhuǎn)/分鐘離心2050分鐘，收集沉淀；(5)在04'C溫度條件下，將步驟(4)得到的沉淀加入0.01mol/LPBS溶液，完全吹溶后50008000轉(zhuǎn)/分鐘離心2040分鐘，得到上清；在上清中添加固體溴化鉀使?jié)舛葹?.21.8mol/L，攪拌14小時后50008000轉(zhuǎn)/分鐘離心13小時；(6)重復(fù)步驟(5)的操作13次；(7)取沉淀加入0.01mol/LPBS溶液吹溶；(8)將步驟(6)的產(chǎn)物進(jìn)行蔗糖密度梯度離心，轉(zhuǎn)速為2乂104轉(zhuǎn)/分鐘，蔗糖梯度質(zhì)量百分比濃度為810%、1215%、1820%、3540%，收集梯度離心產(chǎn)物；(9)將梯度離心產(chǎn)物用0.01mol/LpH7.2的PBS溶液超濾，0.200.25nm的濾膜過濾；(10)將過濾后的產(chǎn)物在pH5.0條件下，60'C滅活10小時；(11)將滅活后的產(chǎn)物用O.Olmol/LpH7.2的PBS溶液進(jìn)行超濾，得到禽流感免疫球蛋白原液。本發(fā)明制備方法的優(yōu)選方案為培養(yǎng)病毒的組織選自雞胚、非洲綠猴腎細(xì)胞、人胚肺二倍體細(xì)胞或地鼠腎細(xì)胞；優(yōu)選為雞胚；供血漿者優(yōu)選為供血漿的人。本發(fā)明制備方法的另一優(yōu)選方案為當(dāng)大流感流行發(fā)生時，以世界衛(wèi)生組織推薦的流行的人禽流感病毒株為免疫原，對供血漿者進(jìn)行免疫，制備特異性免疫球蛋白；或者以世界衛(wèi)生組織推薦的流行的人禽流感病毒株為免疫原，對哺乳動物進(jìn)行免疫，制備特異性免疫球蛋白。其中，哺乳動物選自牛、豬或羊。本發(fā)明的另一優(yōu)選方案為當(dāng)大流感流行發(fā)生時，直接從自然感染者體內(nèi)采集血漿，制備特異性免疫球蛋白。本發(fā)明的另一優(yōu)選方案為在步驟(2)中對供血漿者免疫110次，每次免疫接種間隔735天；免疫接種供血漿者的疫苗中血凝素含量0.1100pg/ml;優(yōu)選為7.520pg/ml。其中，在步驟(2)中，篩選人禽流感病毒血凝抑制抗體效價為大于1:10的血漿；優(yōu)選血凝抑制抗體效價大于l:40的血漿。本發(fā)明還涉及一種藥物組合物，含有有效劑量的人禽流感特異性免疫球蛋白和藥學(xué)上可接受的載體和/或輔料。其中，藥物組合物選自注射劑或凍干粉劑；藥學(xué)上可接受的載體和/或輔料選自麥芽糖或蔗糖。本發(fā)明還涉及人禽流感特異性免疫球蛋白在制備預(yù)防和/或治療禽流感藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的人禽流感特異性免疫球蛋白來源于人或者哺乳動物。本發(fā)明還涉及一種含有本發(fā)明的人禽流感特異性免疫球蛋白的血漿或血清。在本發(fā)明中，為了表述方便，將血漿或特異性免疫球蛋白的血凝素抑制抗體(HI)效價的倒數(shù)，記為H5N1特異性免疫球蛋白效價，單位為SU/ml。例如將HI抗體1:40的H5N1血漿效價定義為40SU/ml。本發(fā)明的禽流感特異性免疫球蛋白治療感染者的劑量為13200SU/kg;優(yōu)選為80160SU/kg體重；用于被動免疫的劑量為13200SU/kg;優(yōu)選為80160SU/kg體重。本發(fā)明所具備的技術(shù)優(yōu)勢為一、本發(fā)明純化方法制備的人禽流感特異性免疫球蛋白原液的濃度高、活性高，其比活性，即單位蛋白濃度中的H5N1特異性免疫球蛋白的效價》22.8SU/mg，高于常規(guī)乙醇低溫純化法的18.0SU/mg左右。二、本發(fā)明純化方法制備的人禽流感特異性免疫球蛋白原液的純度更高，經(jīng)HPLC檢測，IgG純度由常規(guī)乙醇低溫純化法的卯°%提高到99%。三、本發(fā)明提供的技術(shù)方案可以當(dāng)其他亞型的大流感流行發(fā)生時，以世界衛(wèi)生組織推薦的流行株為免疫原對供血漿者進(jìn)行免疫，或者從自然感染者體內(nèi)直接采集血漿，制備特異性免疫球蛋白。使從疫情出現(xiàn)到制備出臨床可用的抗體可以在一個月內(nèi)完成，并且注射到受種者體內(nèi)立即起作用，既可用于高危人群預(yù)防又可以治療危重感染者。本發(fā)明提供的制品可以作為政府應(yīng)對大流感的儲備，是應(yīng)對大流感流行的一種有效策略。本發(fā)明的解決方案與目前國際上通行的儲備"原型疫苗"的策略有著獨(dú)特的共同的優(yōu)越性。首先，可以采用自然感染者血漿的純化制備特免球蛋白用于病人與特殊需要防護(hù)的人員的被動免疫，以最快的速度應(yīng)對大流感疫情的流行；同時在疫苗用于人體后可以獲得更大量的抗病毒血漿，制備除更多的特免球蛋白，用于更大人群的被動保護(hù)。因此，該方案是對目前全球應(yīng)對禽流感"原型疫苗"策略的最好補(bǔ)充。具體實(shí)施例方式下面的實(shí)施例用來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但這并不意味著對本發(fā)明的任何限制。1、制備禽流感疫苗采用世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦的并提供的NIBRG-14(A/Vietnam/1194/2004(H5N1))病毒株接種雞胚，經(jīng)培養(yǎng)、收獲病毒液、滅活病毒和純化后制成。在大流感流行發(fā)生時，如果WHO確認(rèn)流行株非H5N1病毒亞型，則按照國家有關(guān)規(guī)定申請毒株變更，以WHO推薦并提供的，經(jīng)國家藥品管理部門批準(zhǔn)的大流行流感病毒株來替代。疫苗0.5ml/瓶，含病毒血凝素10Mg。疫苗的制備流程為(1)取10日齡SPF級雞胚，照檢，挑選發(fā)育正常的胚，消毒；(2)將0.2ml的病毒液接種于雞胚的尿囊腔，38t:孵化72小時；(3)將孵育好的雞胚轉(zhuǎn)移至4'C恒溫箱中過夜；(4)收獲尿囊液；(5)按h4000比例加入甲醛溶液，4"C滅活7天;(6)連續(xù)流離心，^104轉(zhuǎn)/分鐘，去除雜蛋白；(7)濃縮適當(dāng)倍數(shù)，密度梯度離心；(8)收獲抗原、除菌、稀釋分裝。2、抗禽流感血漿的采集(1)選擇合格的血漿者健康供血漿者免疫接種前應(yīng)檢查項(xiàng)目包括對血槳進(jìn)行乙型肝炎表面抗原(HBsAg)，丙型肝炎病毒(HCV)抗體、梅毒、艾滋病毒(fflV)抗體、轉(zhuǎn)氨酶檢測，要求呈陰性；并檢查血常規(guī)、肝功能、血壓、心率、脈搏、身高、體重；(2)于上臂三角肌肌內(nèi)注射，在第一針免疫后第14天驗(yàn)血，篩選出人禽流感H5N1病毒的HI抗體大于40SU/ml者，采血，分血漿，并將紅細(xì)胞還輸給體內(nèi)；每個過程采血漿不超過580ml(不包括抗凝劑)。采血必須用無菌密閉系統(tǒng)，在潔凈的環(huán)境中嚴(yán)格按照規(guī)程無菌操作；采血過程中應(yīng)該及時將抗凝劑與全血混勻，血液應(yīng)無凝塊；單采漿術(shù)過程中，所用的器材如注射器，輸血器材等均應(yīng)為一次性的，用后銷毀。供血漿者的兩次采漿時間應(yīng)間隔14天以上，每年采漿不超過12次。3、H5N1特異性免疫球蛋白純化流程(1)將抗禽流感病毒血漿共3Xl(^ml于4。C，1乂104轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘；(2)在O'C條件下，取上清邊攪拌邊加入飽和硫酸銨溶液，使硫銨的質(zhì)量百分比濃度為50%;攪拌18小時后6000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘，收集沉淀；(3)在(TC溫度條件下，將步驟(2)得到的沉淀加入lX104ml的0.01mol/LPBS溶液，完全吹溶后6000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘，得到上清；在上清中添加溴化鉀使?jié)舛葹?.5mol/L，攪拌2小時后6000轉(zhuǎn)/分鐘離心2小時，收集沉淀；(4)重復(fù)步驟(3)的操作2次；(5)將步驟(4)的產(chǎn)物加入lxl()4ml的0.01mol/LPBS吹溶；蔗糖密度梯度離心，轉(zhuǎn)速為2乂104轉(zhuǎn)/分鐘，蔗糖梯度質(zhì)量百分比濃度為10%、15%、20%、40%;(6)每100ml每管分段收集梯度離心樣品，檢測各收集樣品的免疫球蛋白效價；混合ffl》50SU/ml的各管，將混合樣品進(jìn)行超濾，超濾液為0.01mol/LpH7.2的PBS溶液；樣品首先濃縮至2000ml，超濾換液5次，最后濃縮至2000ml;采用0.22pim的濾膜過濾樣品；(7)將過濾后產(chǎn)物用巴氏消毒法進(jìn)行病毒滅活，調(diào)節(jié)pH5.0，60。C滅活I(lǐng)O小時；(8)將滅活產(chǎn)物用0.01mol/LpH7.2的PBS進(jìn)行超濾換液6次，獲得特異性免疫球蛋白原液；4、檢驗(yàn)、分裝(1)對原液進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測測特免球蛋白效價，不小于4100SU/ml，蛋白濃度低于180mg/ml，比活性>22.8SU/mg;(2)加入麥芽糖做保護(hù)劑，使麥芽糖的質(zhì)量百分比濃度為10%，按照4000SU/瓶和8000SU/瓶的規(guī)格無菌分裝。于28'C保存。(3)質(zhì)量檢測-按照上述工藝制備3批肌內(nèi)注射用大流感特異性免疫球蛋白，質(zhì)檢結(jié)果如下:表l:肌內(nèi)注射用人禽流感特異性免疫球蛋白質(zhì)檢驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>結(jié)論三批制品經(jīng)檢定判為合格實(shí)施例2H5N1免疫球蛋白對禽流感的預(yù)防效果實(shí)驗(yàn)1.實(shí)驗(yàn)動物選取40只雄性SPF級昆明鼠，體重1822g;將實(shí)驗(yàn)動物分成4組空白對照組、攻毒對照組、30SU組、6SU組，每組10只。2.實(shí)驗(yàn)過程小鼠分別腹腔注射生理鹽水0.2ml、生理鹽水0.2ml、30SUH5N1免疫球蛋白、6SU免疫球蛋白。2天后對攻毒對照組、30SU組、6SU組的實(shí)驗(yàn)鼠乙醚麻醉滴鼻攻毒，攻毒量10XLD50(病毒的LD50為l(T6'7/0.05ml)。14天內(nèi)觀察小鼠的發(fā)病與死亡情況，并記錄體重。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)空白對照組正常；(2)攻毒對照組攻毒3天開始出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、皺毛、食欲下降、呼吸急促癥狀，體重急劇下降，46天全部死亡。(3)30SU組小鼠無發(fā)病，全部存活。(4)6SU組攻毒后8天體重開始下降，3只死亡，存活率70%。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明注射了高劑量特異性免疫球蛋白的小鼠全部存活，低劑量小鼠雖有死亡，但是發(fā)病時間比對照組有所推遲，并起到一定的保護(hù)效果。該免疫球蛋白具有預(yù)防保護(hù)的效果。實(shí)施例3:H5N1免疫球蛋白對禽流感患病動物的治療效果實(shí)驗(yàn)1.實(shí)驗(yàn)動物及分組選取40只雄性SPF級昆明鼠，體重1822g;將實(shí)驗(yàn)動物分成4組空白對照組、攻毒對照組、30SU組、68SU組，每組10只。2.實(shí)驗(yàn)過程對小鼠采用乙醚麻醉法，第一組麻醉小鼠采用生理鹽水滴鼻；后三組分別采用10XLD5o(病毒的LDso為l(T67/0.05ml)的H5N1滴鼻攻毒。三天時攻毒小鼠出現(xiàn)皺毛、反應(yīng)遲鈍、減食、弓背、呼吸稱重等癥狀。然后對40SU組、8SU組分別腹腔注射H5N1特異性免疫球蛋白30SU、6SU。注射后再14天內(nèi)觀察小鼠的發(fā)病與死亡情況，并記錄體重。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)結(jié)果空白對照組正常；(2)攻毒對照組小鼠攻毒46天全部死亡；(3)30U組小鼠全部存活，7天時全部恢復(fù)正常；(4)6SU組小鼠攻毒9天后死亡4只，其他小鼠恢復(fù)正常。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，該免疫球蛋白對于感染動物具有很好的治療效果。實(shí)施例4:臨床試驗(yàn)2007年至2009年，對國內(nèi)公布大流感患者信息與我公司H5N1大流感血漿救治患者統(tǒng)計(jì)表2:國內(nèi)2007-2009年8例人感染禽流感(H5N1)病例情況匯總<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>結(jié)果顯示臨床數(shù)據(jù)說明，我公司輸漿救治病人均成功康復(fù)出院，而死亡的病例均未輸漿，可見該治療方式對H5N1病人的成功救治可起到積極作用；禽流感病例的早發(fā)現(xiàn)、早診斷有利于及早應(yīng)用血漿進(jìn)行治療以發(fā)揮其最大的治療效果。如能及早進(jìn)行該疾病特免球蛋白的儲備，對于全國各地可能出現(xiàn)的新的禽流感病例將能更好應(yīng)對。臨床醫(yī)生與各級疾病預(yù)防控制中心的人員在病人的救治與疾病的流行病調(diào)査過程中，尤其是在早期，防護(hù)可能不夠充分，面臨著較大的危險(xiǎn)，提前對定點(diǎn)醫(yī)院的醫(yī)生接種疫苗，可以有效降低暴露后的感染危險(xiǎn)；同時可用H5N1特免球蛋白對其他高危人群或健康進(jìn)行被動免疫。注本臨床效果觀察結(jié)果發(fā)表于Lancet.2008Apr26;371(9622):1427-34。實(shí)施例5:血漿效價與治療、保護(hù)相關(guān)性推導(dǎo)通過H5N1針對試驗(yàn)小鼠的預(yù)防與治療保護(hù)數(shù)據(jù)進(jìn)行人的免疫計(jì)量的推導(dǎo)。關(guān)于小鼠免疫的數(shù)據(jù)推導(dǎo)采用人和動物的體表面積計(jì)算法、不同種類動物之間藥物劑量換算法，引自章元沛編(秀邏學(xué)實(shí)驗(yàn)(V/入乂厲if幼廢私"S^)。按體表面積計(jì)算劑量的概念為藥理學(xué)家普遍接受，被認(rèn)為尤其適用于不同動物之間劑量的換算。對于該方法為使用方便，可按"mg/kg折算mg/n^的轉(zhuǎn)換因子"進(jìn)行換算表3:不同種類動物間劑量換算時的常用數(shù)據(jù)動物Meeh-Rubner公式值的K值Mg/kg-mg/m2轉(zhuǎn)換因子與小鼠轉(zhuǎn)換因子的比值小鼠9.131(20g)大鼠9.162(200g)豚鼠9.882.67(400g)家兔10.1124(2kg)猴11.8124(3kg)人10.63612(50kg)上表可見，按mg/kg劑量折算成等效劑量，人為小鼠的1/12。因此30SUA2成人需求量=-X50kg=6250SU3125SU。2040g(6250SU3125SU)X(1+0.28)=8000SU4000SU其中，0.28是取0.250.3的附加量的近似中間值。單位質(zhì)量最佳免疫劑量為80160SU/kg體重。理論推導(dǎo)成人單位重量需要注射80~160SUH5N1特異性免疫球蛋白方具有預(yù)防與治療H5N1感染者或自然人群的效果，但是具體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)尚需該制品經(jīng)過大量的臨床試驗(yàn)方可獲得。權(quán)利要求1、一種以禽流感NIBRG-14(H5N1)病毒株為免疫原制備的人禽流感特異性免疫球蛋白。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的人禽流感特異性免疫球蛋白，其特征在于，是以禽流感NIBRG-14(H5N1)病毒株免疫健康人所獲得的血漿，經(jīng)硫酸銨鹽析、溴化鉀鹽析和蔗糖密度梯度離心，分離提取后再經(jīng)病毒滅活處理制備而成的特異性免疫球蛋白。3、根據(jù)權(quán)利要求l所述的人禽流感特異性免疫球蛋白，其特征在于，是以禽流感NIBRG-14(H5N1)病毒株免疫健康人所獲得的血漿，采用低溫乙醇分離法分離，再經(jīng)病毒滅活處理制備而成的特異性免疫球蛋白。4、根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的人禽流感特異性免疫球蛋白，其特征在于，以禽流感NIBRG-14(H5N1)病毒株免疫哺乳動物。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的人禽流感特異性免疫球蛋白，其特征在于，所述的哺乳動物選自牛、豬或羊。6、根據(jù)權(quán)利要求l所述的人禽流感特異性免疫球蛋白，其特征在于，是肌肉注射用的特異性免疫球蛋白。7、根據(jù)權(quán)利要求2所述的人禽流感特異性免疫球蛋白，其特征在于，所述的提取方法包括以下步驟(1)將抗禽流感病毒血漿于04。C,1乂1()4轉(zhuǎn)/分鐘離心2040分鐘；(2)在04。C溫度條件下，取上清加入飽和硫酸銨溶液，使硫酸銨的質(zhì)量百分比濃度為4050%;攪拌1220小時后50008000轉(zhuǎn)/分鐘離心2050分鐘，收集沉淀；(3)在0fC溫度條件下，將步驟(2)得到的沉淀加入0.01mol/LPBS溶液，完全吹溶后6000轉(zhuǎn)/分鐘離心2040分鐘，得到上清；在上清中添加固體溴化鉀使?jié)舛葹?.21.8mol/L，攪拌14小時后50008000轉(zhuǎn)/分鐘離心13小時；(4)重復(fù)步驟(3)的操作13次；(5)將步驟(4)的產(chǎn)物沉淀加入0.01mol/LPBS溶液吹溶，蔗糖密度梯度離心，轉(zhuǎn)速為2乂104轉(zhuǎn)/分鐘，蔗糖梯度質(zhì)量百分比濃度為810%、1216%、1822%、3540。％，收集梯度離心產(chǎn)物；(6)超濾，采用0.200.25pm的濾膜過濾。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的人禽流感特異性免疫球蛋白，其特征在于，所述的分離提取方法包括以下步驟(1)將抗禽流感病毒血漿于04。C，1乂104轉(zhuǎn)/分鐘離心2535分鐘；(2)在04'C溫度條件下，取上清邊攪拌邊加入飽和硫酸銨溶液，使硫酸銨的質(zhì)量百分比濃度為50%;攪拌1518小時后6000轉(zhuǎn)/分鐘離心2535分鐘，收集沉淀；(3)在04。C溫度條件下，將步驟(2)得到的沉淀中加入體積為抗病毒血漿2540°/。的0.01mol/LPBS溶液，完全吹溶后6000轉(zhuǎn)/分鐘離心2535分鐘，得到上清；在上清中添加固體溴化鉀使?jié)舛葹?.5mol/L，攪拌23小時后6000轉(zhuǎn)/分鐘離心2小時，收集沉淀；(4)重復(fù)步驟(3)的操作2次；(5)將步驟(4)的產(chǎn)物加入體積為抗病毒血漿2540%的0.01mol/LPBS溶液吹溶，蔗糖密度梯度離心，轉(zhuǎn)速為2乂104轉(zhuǎn)/分鐘，蔗糖梯度質(zhì)量百分比濃度為910%、1215%、1820%、3840%，收集產(chǎn)物；(6)超濾，采用0.200.24|im的濾膜過濾。9、根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的人禽流感特異性免疫球蛋白，其特征在于，所述的病毒滅活處理采用巴氏消毒法病毒滅活，包括以下步驟將分離提取后的產(chǎn)物在pH5.0條件下6(TC滅活10小時。10、一種人禽流感特異性免疫球蛋白的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(1)用NIBRG-14病毒株接種雞胚，經(jīng)培養(yǎng)、收獲病毒液、滅活病毒和純化后制成禽流感疫苗；(2)將制備的禽流感疫苗免疫接種供血漿者，在最后一次免疫后第06個月采血；(3)將抗禽流感病毒血漿于04。C，1乂104轉(zhuǎn)/分鐘離心2040分鐘；(4)在04。C溫度條件下，取上清加入飽和硫酸銨溶液，使硫酸銨的質(zhì)量百分比濃度為4050%;攪拌1220小時后50008000轉(zhuǎn)/分鐘離心2050分鐘，收集沉淀；(5)在04°(3溫度條件下，將步驟(4)得到的沉淀加入0.01mol/LPBS溶液，完全吹溶后50008000轉(zhuǎn)/分鐘離心2040分鐘，得到上清；在上清中添加固體溴化鉀使?jié)舛葹?.21.8mol/L，攪拌14小時后50008000轉(zhuǎn)/分鐘離心13小時；(6)重復(fù)步驟(5)的操作13次；(7)將步驟(6)的產(chǎn)物加入O.Olmol/LPBS溶液吹溶后進(jìn)行蔗糖密度梯度離心，轉(zhuǎn)速為2乂104轉(zhuǎn)/分鐘，蔗糖梯度質(zhì)量百分比濃度為810%、1215%、1820%、3540%，收集梯度離心產(chǎn)物；(8)將梯度離心產(chǎn)物用0.01mol/LpH7.2的PBS溶液超濾，0.200.25nm的濾膜過濾；(9)在pH5.0條件下，6(TC滅活10小時；(10)將滅活后的產(chǎn)物用O.Olmol/LpH7.2的PBS溶液進(jìn)行超濾，得到禽流感免疫球蛋白原液。11、根據(jù)權(quán)利要求10所述的制備方法，其特征在于，在步驟(1)中，將禽流感NIBRG-14病毒株接種于非洲綠猴腎細(xì)胞、人胚肺二倍體細(xì)胞或地鼠腎細(xì)胞。12、根據(jù)權(quán)利要求10所述的制備方法，其特征在于，當(dāng)大流感流行發(fā)生肘，以世界衛(wèi)生組織推薦的流行的人禽流感病毒株為免疫原，對供血漿者進(jìn)行免疫，制備特異性免疫球蛋白。13、根據(jù)權(quán)利要求12所述的制備方法，其特征在于，當(dāng)大流感流行發(fā)生時，以世界衛(wèi)生組織推薦的流行的人禽流感病毒株為免疫原，對哺乳動物進(jìn)行免疫，制備特異性免疫球蛋白。14、根據(jù)權(quán)利要求13所述的制備方法，其特征在于，所述的哺乳動物選自牛、豬或羊。15、根據(jù)權(quán)利要求10所述的制備方法，其特征在于，當(dāng)大流感流行發(fā)生時，直接從自然感染者體內(nèi)采集血漿，制備特異性免疫球蛋白。16、根據(jù)權(quán)利要求10所述的制備方法，其特征在于，在步驟(2)中對供血漿者免疫110次，每次免疫接種間隔735天。17、根據(jù)權(quán)利要求10所述的制備方法，其特征在于，在步驟(2)中免疫接種供血漿者的疫苗中血凝素含量0.1100jig/ml。18、根據(jù)權(quán)利要求17所述的制備方法，其特征在于，免疫接種供血漿者的疫苗中血凝素含量為7.520pg/ml。19、根據(jù)權(quán)利要求10所述的制備方法，其特征在于，在步驟(2)中篩選人禽流感病毒血凝抑制抗體效價為大于1:10的血漿。20、根據(jù)權(quán)利要求19所述的制備方法，其特征在于，篩選人禽流感病毒血凝抑制抗體效價大于l:40的血漿。21、一種藥物組合物，其特征在于，含有有效劑量的如權(quán)利要求1所述的人禽流感特異性免疫球蛋白和藥學(xué)上可接受的載體和/或輔料。22、根據(jù)權(quán)利要求21所述的藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物選自注射劑或凍干粉劑。23、根據(jù)權(quán)利要求21所述的藥物組合物，其特征在于，所述的藥學(xué)上可接受的載體和/或輔料選自麥芽糖或蔗糖。24、根據(jù)權(quán)利要求1所述的人禽流感特異性免疫球蛋白在制備預(yù)防和/或治療禽流感藥物中的應(yīng)用。25、根據(jù)權(quán)利要求1所述的人禽流感特異性免疫球蛋白，其特征在于，所述的人禽流感特異性免疫球蛋白來源于人或者哺乳動物。26、一種包含權(quán)利要求1所述的人禽流感特異性免疫球蛋白的血漿或血清。全文摘要本發(fā)明涉及一種人禽流感特異性免疫球蛋白，其制備方法、使用方法及用途。本發(fā)明的人禽流感特異性免疫球蛋白是以禽流感NIBRG-14(H5N1)病毒株免疫健康人所獲得的血漿，經(jīng)硫酸銨鹽析、溴化鉀鹽析和蔗糖密度梯度離心，分離提取后再經(jīng)病毒滅活處理制備而成的特異性免疫球蛋白，具有純度高，活性高的優(yōu)點(diǎn)。同時，本發(fā)明提供了一種在大流感流行發(fā)生時，以世界衛(wèi)生組織推薦的流行株為免疫原對供血漿者進(jìn)行免疫，或者從自然感染者體內(nèi)直接采集血漿，制備特異性免疫球蛋白的技術(shù)方案，使得流感的傳播得到及時有效的控制。文檔編號C07K16/10GK101508733SQ200910080588公開日2009年8月19日申請日期2009年3月23日優(yōu)先權(quán)日2009年3月23日發(fā)明者丘遠(yuǎn)征,尹衛(wèi)東,張小梅,芳蔡,陳江婷,高正倫申請人:北京科興生物制品有限公司