專利名稱：靜注人免疫球蛋白的制備方法
靜注人免疫球蛋白的制備方法
技術領域：
本發明涉及生物制藥領域，尤其涉及一種靜注人免疫球蛋白的制備方法。背景技術：
目前，已知的血漿蛋白成分超過200種，已經能夠分離純化出來的有100余種，其中研究較多的有70多種。血漿蛋白成分除白蛋白和免疫球蛋白外，其余含量較少，而且各成分間含量差異極大。按照生理功能，血漿蛋白可分為轉輸蛋白類、免疫球蛋白類、凝血系統蛋白類和蛋白酶抑制物；按照臨床應用，血漿蛋白又可分為白蛋白類、免疫球蛋白類、凝血因子類和微量蛋白類。血漿蛋白制品原為戰爭需求的產物。在第二次世界大戰期間，由于戰事的擴大，傷員急需大量的血液進行治療，而新鮮血液的缺陷和供應不足，貽誤了傷員救治的時間。美國哈佛大學接受軍方委托E. J. Cohn教授領導一個研究組著手建立血漿蛋白的的分離工藝， 并于1941年制備出白蛋白供臨床觀察。1942年Cohn法大規模生產白蛋白供美軍使用， 之后至1943年間，免疫球蛋白、纖維蛋白原制劑、凝血酶原、抗血友病球蛋白以及凝血酶原復合物也相繼生產。Cohn等人建立了經典的低溫乙醇工藝。1962年，瑞士紅十字會的 Nitschmann和Kistler對低溫乙醇法進行改良，建立了 Nitschmann-Kistler低溫乙醇蛋白分離法。低溫乙醇法制備血漿蛋白主要是往蛋白水溶液中加入水溶性有機溶劑，如乙醇、 丙酮等。加入水溶性有機溶劑后將會產生幾種效應，主要效應是降低水分子的活度、降低溶液的介電常數，從蛋白質分子周圍排代水分子，使蛋白質分子與蛋白分子通過極性基團的相互作用，在范德華引力下發生凝聚.。絕大多數血液制品生產廠家仍在采用傳統的Cohn 和Nitschmarm-Kistler低溫乙醇工藝制備靜注人免疫球蛋白。采用上述低溫乙醇工藝制備靜注人免疫球蛋白，IgG(免疫球蛋白G)制劑中含有少量IgG聚合體、PKA (激肽釋放酶原激活劑)以及IgA (免疫球蛋白A)。IgG聚合體能啟動補體結合反應，一些被激活的補體有過敏毒素作用和細胞毒作用，使血管通透性增加，平滑肌收縮，釋放組織胺，破壞細胞膜等，從而引起病理生理反應。PKA能激活激肽釋放酶，作用于激肽原，產生緩激肽BK，緩激肽BK有平滑肌收縮，毛細血管透性增高，白細胞游走和聚集作用，可使人體血壓下降，甚至休克。IgG制劑中的少量IgA，一般無大妨礙，但是給IgA缺乏的患者注射可使之致敏產生抗體，再次注射可發生急性過敏反應。

發明內容有鑒于此，本發明提供一種提高IgG制劑的純度的靜注人免疫球蛋白的制備方法。一種靜注人免疫球蛋白的制備方法，所述制備方法包括以下步驟從血漿中沉淀組分I+II+III 將低溫冰凍血漿融化為液體狀態，加入95%的-15°C藥用乙醇至最終乙醇濃度至20 %，同時調節pH至6. 9 7. 0，血漿蛋白含量5. 0 %， 調控溫度至_5°C，攪拌1小時以上，靜置4小時以上后采用離心分離或加壓過濾，收集組分沉淀 I+II+III ；從組分I+II+III中沉淀組分I+III 在組分I+II+III沉淀加入10倍注射用水重溶解，加入95%的-15°c藥用乙醇至最終乙醇濃度至17%，同時調節PH至5. 0 5. 4，懸液蛋白含量0.8 1.2%，調控溫度至_5°C，攪拌1小時以上，靜置4小時以上后采用離心分離或加壓過濾，收集上清液；從上清液中沉淀組分II 將上清液調節PH至7. 0 7. 2，蛋白質含量0. 5%，加入 95%的_15°C藥用乙醇至最終乙醇濃度至25%，調控溫度至_7°C，攪拌1小時以上，靜置8 小時以上后采用離心分離或加壓過濾，收集組分II沉淀；將組分II進行陰離子交換層析；將層析流出液進行超濾；以及將超濾后的制品溶液進行除菌過濾。優選地，所述將組分II進行陰離子交換層析的步驟進一步包括以下步驟按組分 II沉淀重量5 8倍加入0 2°C注射用水攪拌至完全溶解，靜置30分鐘將溶解液深層過濾；以及過濾液采用0.9%氯化鈉溶液調電導率至1.9士0. 1ms，用0. 5mol/L鹽酸調pH值 6. 30士0. 10上平衡后的層析柱，處理至流出液電導率1. 9士0. 1ms、pH為6. 30士0. 10后上待處理制品。優選地，在所述將組分II進行陰離子交換層析的步驟中，所用凝膠的平衡程序如下2 3倍凝膠體積注射用水洗滌；3倍凝膠體積0. 5mol/L氫氧化鈉溶液處理；3倍凝膠體積注射用水洗滌；6倍凝膠體積醋酸鹽緩沖液處理；3倍凝膠體積注射用水洗滌；以及 6 9倍凝膠體積磷酸鹽緩沖液。優選地，在上述凝膠平衡程序中，所述醋酸鹽緩沖液配方為6g氫氧化鈉加上40ml 醋酸加注射用至lL，pH為4.0。優選地，在所述將組分II進行陰離子交換層析的步驟中所用的凝膠為 DEAE-Sepharose。優選地，所述DEAE-kpharose凝膠可按如下程序再生1 2倍凝膠體積磷酸鹽緩沖液處理；6倍凝膠體積醋酸鹽緩沖液處理；3倍凝膠體積注射用水洗滌；3倍凝膠體積 2mol/L氯化鈉溶液洗脫雜質蛋白；3倍凝膠體積注射用水洗滌；3倍凝膠體積0. 5mol/L氫氧化鈉溶液處理；3倍凝膠體積注射用水洗滌；以及0. lmol/L氫氧化鈉溶液保存或平衡后使用。優選地，在上述凝膠再生程序中，所述醋酸鹽緩沖液的配方為17. 5g氯化鈉加上 6g氫氧化鈉加上40ml醋酸加注射用水至1L，pH為4. 0。優選地，所述磷酸鹽緩沖液的配方為1. 2g氫氧化鈉加上1. 6ml濃磷酸加注射用水至 1L，pH 為 6. 3。優選地，在所述陰離子交換層析上待處理制品之前，目標免疫球蛋白的pH范圍為 6. 3 7. 3o優選地，所述將層析流出液進行超濾的步驟進一步包括以下步驟將組分II沉淀用3 5倍注射用水溶解，進行深層過濾，用50K分子量孔徑膜包進行透析，去除無機鹽離子和乙醇分子，最后濃縮至所需要的蛋白質濃度。。本發明的靜注人免疫球蛋白的制備方法在超濾之前采用陰離子交換層析技術，降低或去除IgG制劑中的IgG聚合體、PKA和IgA，同時防止IgG分子再聚合，大大提高IgG制劑的純度。

圖1為本發明的優選實施例靜注人免疫球蛋白的制備方法的示意圖。具體實施方式
為了更好地理解本發明，以下將結合附圖對發明的實施例進行詳細的說明。針對上述技術方案的缺點本發明提供一種靜注人免疫球蛋白的制備方法，主要是解決IgG制劑的純度問題，降低或去除IgG制劑中的IgG聚合體、PKA和IgA，同時防止IgG 分子再聚合。請參閱圖1，本發明靜注人免疫球蛋白的制備方法的優選實施例包括以下步驟如步驟Sl中所示，從血漿中沉淀組分I+II+III。將低溫冰凍血漿融化為液體狀態，加入95%的-15°C藥用乙醇至最終乙醇濃度至20%，同時調節pH至6. 9 7. 0，血漿蛋白含量5. 0%，調控溫度至-5°C，攪拌1小時以上，靜置4小時以上后采用離心分離或加壓過濾，收集組分沉淀I+II+III。如步驟S2中所示，從組分I+II+III中沉淀組分1+111。在組分I+II+III沉淀加入10倍注射用水重溶解，加入95%的-15°c藥用乙醇至最終乙醇濃度至17%，同時調節PH 至5. 0 5. 4，懸液蛋白含量0. 8 1. 2%，調控溫度至_5°C，攪拌1小時以上，靜置4小時以上后采用離心分離或加壓過濾，收集上清液。如步驟S3中所示，從上清液中沉淀組分II。將上清液調節pH至7. 0 7. 2，蛋白質含量0. 5%，加入95%的-15°C藥用乙醇至最終乙醇濃度至25%，調控溫度至_7°C，攪拌 1小時以上，靜置8小時以上后采用離心分離或加壓過濾，收集組分II沉淀。在上清液中加入0. 5g/L硅藻土壓濾分離組分II沉淀，將組分II沉淀-30°C以下凍存，上清液廢棄。如步驟S4所示，將組分II進行陰離子交換層析。按組分II沉淀重量5 8倍加入 0 2°C注射用水攪拌至完全溶解，靜置30分鐘將溶解液深層過濾。過濾液采用0. 9%氯化鈉溶液調電導率至1.9士0. 1ms，用0. 5mol/L鹽酸調pH值6. 30士0. 10上平衡后的層析柱。 凝膠平衡程序如下2 3倍凝膠體積注射用水洗滌；3倍凝膠體積0. 5mol/L氫氧化鈉溶液處理；3倍凝膠體積注射用水洗滌；6倍凝膠體積醋酸鹽緩沖液(6g氫氧化鈉+40ml醋酸加注射用至lL，pH4. 0)處理；3倍凝膠體積注射用水洗滌；6 9倍凝膠體積磷酸鹽緩沖液 (1. 2g氫氧化鈉+1. 6ml濃磷酸加注射用水至lL，pH6. 3)。處理至流出液電導率1. 9 士0. Ims, pH6. 30 士0. 10后上待處理制品。上述層析純化用凝膠為DEAE-kpharose，用于人免疫球蛋白IgG的純化。目標蛋白IgG流穿凝膠，雜質蛋白與凝膠結合，凝膠經再生后復原。在層析上待處理制品之前，目標蛋白IgG的酸堿度范圍為pH6. 3 7. 3。DEAE-Sepharose凝膠可再生，凝膠再生程序如下1 2倍凝膠體積磷酸鹽緩沖液 (1. 2g氫氧化鈉+1. 6ml濃磷酸加注射用水至1L，pH6. 3)處理；6倍凝膠體積醋酸鹽緩沖液(17. 5g氯化鈉+6g氫氧化鈉+40ml醋酸加注射用水至1L，pH4. 0)處理；3倍凝膠體積注射用水洗滌；3倍凝膠體積2mol/L氯化鈉溶液洗脫雜質蛋白；3倍凝膠體積注射用水洗滌；3 倍凝膠體積0. 5mol/L氫氧化鈉溶液處理；3倍凝膠體積注射用水洗滌；0. lmol/L氫氧化鈉溶液保存或平衡后使用。如步驟S5所示，將層析流出液進行超濾。將層析流出液進用3 5倍注射用水溶解，進行深層過濾，用50K分子量孔徑膜包進行透析，去除無機鹽離子和乙醇分子，最后濃縮至所需要的蛋白質濃度，即可得到靜注人免疫球蛋白原液。透析完成后，在靜注人免疫球蛋白原液中加入0. 5mol/L鹽酸溶液，調pH至4. 0士0. 1，調蛋白質含量至50 100g/L，并按照90 110g/L加入麥芽糖。如步驟S6所示，除菌、分裝。將超濾后的制品溶液進行除菌過濾，灌裝至最終容
ο如步驟S7所示，成品檢定。對分裝后成品進行抽樣，進行理化和生物學檢定，合格后即可包裝至成品，上市銷售。本發明的靜注人免疫球蛋白的制備方法在提取組分II沉淀至超濾之前增加陰離子交換層析技術。層析純化用凝膠為DEAE-kpharose凝膠自身帶正電荷，將目標蛋白IgG 調至pH6. 3，小于其等電點的pH7. 3而帶正電荷，其它等電點在pH6. 3以下的雜質蛋白帶負電荷，根據同種電荷相排斥，異種電荷向吸引的原理，目標蛋白IgG流穿凝膠，雜質蛋白與凝膠結合，凝膠經再生后復原。上述制備方法在超濾之前采用陰離子交換層析技術，解決IgG制劑的純度問題， 降低或去除IgG制劑中的IgG聚合體、PKA和IgA，同時防止IgG分子再聚合。以上所述實施例僅表達了本發明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對本發明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發明的保護范圍。因此，本發明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。
權利要求
1.一種靜注人免疫球蛋白的制備方法，其特征在于所述制備方法包括以下步驟 從血漿中沉淀組分I+II+III 將低溫冰凍血漿融化為液體狀態，加入95%的-15°c藥用乙醇至最終乙醇濃度至20%，同時調節pH至6. 9 7.0，血漿蛋白含量5.0%，調控溫度至_5°C，攪拌1小時以上，靜置4小時以上后采用離心分離或加壓過濾，收集組分沉淀 I+II+III ；從組分I+II+III中沉淀組分I+III 在組分I+II+III沉淀加入10倍注射用水重溶解， 加入95%的-15°c藥用乙醇至最終乙醇濃度至17%，同時調節PH至5. 0 5. 4，懸液蛋白含量0. 8 1. 2%，調控溫度至_5°C，攪拌1小時以上，靜置4小時以上后采用離心分離或加壓過濾，收集上清液；從上清液中沉淀組分II 將上清液調節PH至7. 0 7. 2，蛋白質含量0. 5%，加入95% 的-15°C藥用乙醇至最終乙醇濃度至25%，調控溫度至-71，攪拌1小時以上，靜置8小時以上后采用離心分離或加壓過濾，收集組分II沉淀； 將組分II進行陰離子交換層析； 將層析流出液進行超濾；以及將超濾后的制品溶液進行除菌過濾。
2.根據權利要求1所述的靜注人免疫球蛋白的制備方法，其特征在于所述將組分II 進行陰離子交換層析的步驟進一步包括以下步驟按組分II沉淀重量5 8倍加入0 2°C注射用水攪拌至完全溶解，靜置30分鐘將溶解液深層過濾；過濾液采用0.9%氯化鈉溶液調電導率至1.9士0. 1ms，用0. 5mol/L鹽酸調pH值 6. 30士0. 10上平衡后的層析柱，處理至流出液電導率1. 9士0. 1ms、pH為6. 30士0. 10后上待處理制品。
3.根據權利要求2所述的靜注人免疫球蛋白的制備方法，其特征在于在所述將組分 II進行陰離子交換層析的步驟中，所用凝膠的平衡程序如下2 3倍凝膠體積注射用水洗滌； 3倍凝膠體積0. 5mol/L氫氧化鈉溶液處理； 3倍凝膠體積注射用水洗滌； 6倍凝膠體積醋酸鹽緩沖液處理； 3倍凝膠體積注射用水洗滌；以及 6 9倍凝膠體積磷酸鹽緩沖液。
4.根據權利要求3所述的靜注人免疫球蛋白的制備方法，其特征在于在上述凝膠平衡程序中，所述醋酸鹽緩沖液配方為6g氫氧化鈉加上40ml醋酸加注射用至lL，pH為4. 0。
5.根據權利要求2所述的靜注人免疫球蛋白的制備方法，其特征在于在所述將組分 II進行陰離子交換層析的步驟中所用的凝膠為DEAE-kpharose。
6.根據權利要求5所述的靜注人免疫球蛋白的制備方法，其特征在于所述 DEAE-Sepharose凝膠可按如下程序再生1 2倍凝膠體積磷酸鹽緩沖液處理； 6倍凝膠體積醋酸鹽緩沖液處理； 3倍凝膠體積注射用水洗滌；3倍凝膠體積2mol/L氯化鈉溶液洗脫雜質蛋白； 3倍凝膠體積注射用水洗滌； 3倍凝膠體積0. 5mol/L氫氧化鈉溶液處理； 3倍凝膠體積注射用水洗滌；以及 0. lmol/L氫氧化鈉溶液保存或平衡后使用。
7.根據權利要求6所述的靜注人免疫球蛋白的制備方法，其特征在于在上述凝膠再生程序中，所述醋酸鹽緩沖液的配方為17. 5g氯化鈉加上6g氫氧化鈉加上40ml醋酸加注射用水至lL，pH為4.0。
8.根據權利要求3或6中任一項所述的靜注人免疫球蛋白的制備方法，其特征在于 所述磷酸鹽緩沖液的配方為1. 2g氫氧化鈉加上1. 6ml濃磷酸加注射用水至lL，pH為6. 3。
9.根據權利要求2所述的靜注人免疫球蛋白的制備方法，其特征在于在所述陰離子交換層析上待處理制品之前，目標免疫球蛋白的PH范圍為6. 3 7. 3。
10.根據權利要求1所述的靜注人免疫球蛋白的制備方法，其特征在于所述將層析流出液進行超濾的步驟進一步包括以下步驟將組分II沉淀用3 5倍注射用水溶解，進行深層過濾，用50K分子量孔徑膜包進行透析，去除無機鹽離子和乙醇分子，最后濃縮至所需要的蛋白質濃度。
全文摘要
本發明提供一種靜注人免疫球蛋白的制備方法，所述制備方法包括以下步驟從血漿中沉淀組分I+II+III；從組分I+II+III中沉淀組分I+III；從上清液中沉淀組分II；將組分II進行陰離子交換層析；將層析流出液進行超濾；以及將超濾后的制品溶液進行除菌過濾。本發明的靜注人免疫球蛋白的制備方法在超濾之前采用陰離子交換層析技術，降低或去除IgG制劑中的IgG聚合體、PKA和IgA，同時防止IgG分子再聚合，大大提高IgG制劑的純度。
文檔編號C07K1/34GK102443059SQ201110348210
公開日2012年5月9日 申請日期2011年11月7日 優先權日2011年11月7日
發明者徐建生, 王保林, 田健生 申請人:武漢中原瑞德生物制品有限責任公司