專利名稱：：以聚乙二醇作為沉淀劑用于蛋白質結晶篩選96條件試劑盒的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種用于蛋白質結晶篩選的96條件試劑盒，特別是以不同分子量的聚乙二醇(PEG)作為沉淀劑用于蛋白質結晶篩選的96條件試劑盒。
背景技術：
：HamptonResearch公司公開的名為Index的96條件篩選試劑盒的具體組成如下表，包括三部分，沉淀劑、鹽、緩沖液。沉淀劑主要包括銨鹽、鈉鹽、鎂鹽、磷酸鹽、甲酸鹽、有機物、聚合物等，其濃度都較高，在2M左右；鹽主要包括鈉鹽、鎂鹽、鈣鹽、硫酸鹽、醋酸鹽、酒石酸鹽等，其濃度較低，在IM以下；緩沖液包括6種，濃度是0.1M，pH值范圍從3到9。表1:IndexTM96條件成分表<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>文獻l“CyclingTemperatureStrategy:AMethodtoImprovetheEfficiencyofCrystallizationConditionScreeningofProteins,CrystalGrowth&Design,2008,8(12):4227-4232”公開了采用上述Index的96條件篩選試劑盒對溶菌酶、刀豆球蛋白、蛋白酶K、過氧化氫酶、α-糜蛋白酶原、竹與蛋白等幾種蛋白進行了結晶條件篩選研究，統計出其成功率分別為29.2%,4.2%,58.3%U5.6%,26.0%,3.1%。但是Index的局限在于所用沉淀劑都是隨機選取，無針對性，對蛋白質結晶的成功率還有待提高；而且所用試劑種類較多，成本較高。
發明內容為了克服現有的96條件篩選試劑盒在蛋白質結晶條件篩選中成功率低的不足，本發明提供一種以聚乙二醇作為沉淀劑用于蛋白質結晶篩選96條件試劑盒，可以提高蛋白質結晶條件篩選成功率。本發明解決其技術問題所采用的技術方案為一種以聚乙二醇為基礎的96條件生物大分子結晶篩選試劑盒，其特點是成分組成如下表<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>所述沉淀是PEG4000、PEG6000、PEG8000、PEG3350、PEG400、PEG1000、PEG2000或PEG1500任一種。濃度為10%30%ν/ν。所述添加劑是硫酸銨、甲酸鈉、氯化鎂、丙二酸鈉、2-甲基-2，4戊二醇、乙二醇、異丙醇、TacsimatePH7.0、甘氨酸、酒石酸鉀鈉或乙二胺四乙酸任一種。其濃度為0.1Μ。所述緩沖液是乙酸鈉、檸檬酸鈉、2，2_雙二羥甲基苯胺或Ν-2-羥乙基哌嗪-N，-2-乙磺酸。濃度為0.1Μ。ρΗ值范圍從4到8。本發明的有益效果是①本試劑盒所選沉淀劑是BMCD數據庫中統計出的使用頻率最高的前8種PEG，不是隨機選取，所以會顯著提高生物大分子結晶的成功率，比如刀豆球蛋白的成功率從4.2%提高到81.2%，溶菌酶的成功率從29.2%提高到46.9%，蛋白酶K的成功率從58.3%提高到66.7%，過氧化氫酶的成功率從15.6%提高到30.2%。②本試劑盒只用了8種PEG，11種添加劑，4種緩沖液，所用試劑種類較少，而且濃度相對較低，所以相對
背景技術：
試劑盒成本較低，有商業推廣價值。具體實施例方式配制PEGGridScreen96篩選條件以Al(0.IM的PH4.6的三水醋酸鈉、20%的PEG4000、0.IM硫酸銨)為例第一步配好濃度為0.1M，PH4.6的醋酸鈉緩沖液；第二步稱好PEG4000和硫酸銨(假如配制體積為50ml)至50ml燒杯中，加入配制好的醋酸鈉緩沖液，使其溶解后置50ml容量瓶中定容；第三步將定容好的溶液用濾膜過濾到50ml的管中，Al條件配制完畢。同樣的方法配制其他條件。下面用幾種蛋白質的結晶實驗來驗證該試劑盒的效果。實施例1用上述配制的PEGGridScreen96條件對刀豆球蛋白(ConcanavalinA)進行條件篩選。第一步將美國Sigma公司的貨號為L7647的刀豆球蛋白，溶于ρΗ為7.0，濃度為0.025mol/L的N-2-羥乙基哌嗪-N’_2_乙磺酸-Na緩沖液中，配制成濃度為20mg/ml的刀豆球蛋白溶液，用0.22μm的濾膜濾去雜質。第二步用上述96條件對刀豆球蛋白結晶條件進行篩選。第三步使用坐滴板，每深孔中加入90μ1的池液，使用自動移液系統將1μ1篩選結晶劑和μ1蛋白質溶液混合為結晶液滴，滴在小坐滴孔中，密封結晶板。第四步上述結晶溶液體系在20°C溫控箱中放置7天后，利用自動顯微拍照系統觀察并統計出現刀豆球蛋白晶體的條件數目。經過統計得到結果如下刀豆球蛋白結晶的成功率為81.2%，與文獻1相比其成功率提高了77.0%，有大幅提高。實施例2用上述配制的PEGGridScreen96條件對溶菌酶(Iysozyme)進行條件蹄選。第一步將經過六次重結晶的日本Seikagaku公司的貨號為100940的溶菌酶，溶于PH為7.0，濃度為0.025mol/L的N-2-羥乙基哌嗪-N’_2_乙磺酸-Na緩沖液中，配制成濃度為40mg/ml的溶菌酶溶液，用0.22μm的濾膜濾去雜質。第二步用上述96條件對溶菌酶結晶條件進行篩選。第三步使用坐滴板，每深孔中加入90μ1的池液，使用自動移液系統將1μ1篩選結晶劑和μ1蛋白質溶液混合為結晶液滴，滴在小坐滴孔中，密封結晶板。第四步上述結晶溶液體系在20°C溫控箱中放置7天后，利用自動顯微拍照系統觀察并統計出現溶菌酶晶體的條件數目。經過統計得到結果如下溶菌酶結晶的成功率為46.9%，與文獻1相比其成功率提高了17.7%，有顯著提高。實施例3用上述配制的PEGGridScreen96條件對蛋白酶!((proteinaseK)進行條件篩選。第一步將美國Sigma公司的貨號為P6556的蛋白酶K，溶于pH為7.0，濃度為0.025mol/L的N-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸-Na緩沖液中，配制成濃度為30mg/ml的蛋白酶K溶液，用0.22μm的濾膜濾去雜質。第二步用上述96條件對蛋白酶K結晶條件進行篩選。第三步使用坐滴板，每深孔中加入90μ1的池液，使用自動移液系統將1μ1篩選結晶劑和μ1蛋白質溶液混合為結晶液滴，滴在小坐滴孔中，密封結晶板。第四步上述結晶溶液體系在20°C溫控箱中放置7天后，利用自動顯微拍照系統觀察并統計出現蛋白酶K晶體的條件數目。經過統計得到結果如下蛋白酶K結晶的成功率為66.7%，與文獻1相比其成功率提高了8.4%，有顯著提高。實施例4用上述配制的PEGGridScreen96條件對過氧化氫酶(Catalase)進行條件篩選。第一步將美國Sigma公司貨號為C0615的過氧化氫酶，溶于pH為7.00，濃度為0.025mol/LN-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸-Na緩沖液中，配制成濃度為20mg/ml的過氧化氫酶溶液，用0.22μm的濾膜濾去雜質。第二步用上述96條件對過氧化氫酶結晶條件進行篩選。第三步使用坐滴板，每深孔中加入90μ1的池液，使用自動移液系統將1μ1篩選結晶劑和μ1蛋白質溶液混合為結晶液滴，滴在小坐滴孔中，密封結晶板。第四步上述結晶溶液體系在20°C溫控箱中放置7天后，利用自動顯微拍照系統觀察并統計出現過氧化氫酶晶體的條件數目。經過統計得到結果如下過氧化氫酶結晶的成功率為30.2%，與文獻1相比其成功率提高了14.6%，有顯著提高。除上述的實施例外，本發明方法也用于竹與蛋白、核糖核酸酶A、乳白蛋白、糜蛋白酶以及糜蛋白酶原等結晶條件的篩選，得到的蛋白質結晶篩選成功率也有顯著提高。權利要求一種以聚乙二醇為基礎的96條件生物大分子結晶篩選試劑盒，其特征在于成分組成如下表序號緩沖液pH沉淀劑添加劑A10.1M乙酸鈉pH4.620％PEG40000.1M硫酸銨A20.1M檸檬酸鈉PH5.620％PEG40000.1M甲酸鈉A30.1M2，2-雙二羥甲基苯胺PH6.520％PEG40000.1M氯化鎂A40.1MN-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸PH7.520％PEG40000.1M丙二酸鈉A50.1M乙酸鈉pH4.625％PEG400010％v/v2-甲基-2，4戊二醇A60.1M檸檬酸鈉PH5.625％PEG400010％v/v乙二醇A70.1M2，2-雙二羥甲基苯胺PH6.525％PEG400010％v/v異丙醇A80.1MN-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸PH7.525％PEG40000.1M丙二酸鈉A90.1M乙酸鈉pH4.630％PEG40000.1M甘氨酸A100.1M檸檬酸鈉PH5.630％PEG40000.1M酒石酸鉀鈉A110.1M2，2-雙二羥甲基苯胺PH6.530％PEG40000.01M乙二胺四乙酸A120.1MN-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸PH7.530％PEG400010％v/vTacsimatePH7.0B10.1M乙酸鈉pH4.610％PEG80000.1M硫酸銨B20.1M檸檬酸鈉PH5.610％PEG80000.1M甲酸鈉B30.1M2，2-雙二羥甲基苯胺PH6.510％PEG80000.1M氯化鎂B40.1MN-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸PH7.510％PEG80000.1M丙二酸鈉B50.1M乙酸鈉pH4.615％PEG800010％v/v2-甲基-2，4戊二醇B60.1M檸檬酸鈉PH5.615％PEG800010％v/v乙二醇B70.1M2，2-雙二羥甲基苯胺PH6.515％PEG800010％v/v異丙醇B80.1MN-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸PH7.515％PEG80000.1M丙二酸鈉B90.1M乙酸鈉pH4.620％PEG80000.1M甘氨酸B100.1M檸檬酸鈉PH5.620％PEG80000.1M酒石酸鉀鈉B110.1M2，2-雙二羥甲基苯胺PH6.520％PEG80000.01M乙二胺四乙酸B120.1MN-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸PH7.520％PEG800010％v/vTacsimatePH7.0C10.1M乙酸鈉pH4.610％PEG60000.1M硫酸銨C20.1M檸檬酸鈉PH5.610％PEG60000.1M甲酸鈉C30.1M2，2-雙二羥甲基苯胺PH6.510％PEG60000.1M氯化鎂C40.1MN-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸PH7.510％PEG60000.1M丙二酸鈉C50.1M乙酸鈉pH4.615％PEG600010％v/v2-甲基-2，4戊二醇C60.1M檸檬酸鈉PH5.615％PEG600010％v/v乙二醇C70.1M2，2-雙二羥甲基苯胺PH6.515％PEG600010％v/v異丙醇C80.1MN-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸PH7.515％PEG60000.1M丙二酸鈉C90.1M乙酸鈉pH4.620％PEG60000.1M甘氨酸C100.1M檸檬酸鈉PH5.620％PEG60000.1M酒石酸鉀鈉C110.1M2，2-雙二羥甲基苯胺PH6.520％PEG60000.01M乙二胺四乙酸C120.1MN-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸PH7.520％PEG600010％v/vTacsimatePH7.0D10.1M乙酸鈉pH4.620％PEG33500.1M硫酸銨D20.1M檸檬酸鈉PH5.620％PEG33500.1M甲酸鈉D30.1M2，2-雙二羥甲基苯胺PH6.520％PEG33500.1M氯化鎂D40.1MN-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸PH7.520％PEG33500.1M丙二酸鈉D50.1M乙酸鈉pH4.625％PEG335010％v/v2-甲基-2，4戊二醇D60.1M檸檬酸鈉PH5.625％PEG335010％v/v乙二醇D70.1M2，2-雙二羥甲基苯胺PH6.525％PEG335010％v/v異丙醇D80.1MN-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸PH7.525％PEG33500.1M丙二酸鈉D90.1M乙酸鈉pH4.630％PEG33500.1M甘氨酸D100.1M檸檬酸鈉PH5.630％PEG33500.1M酒石酸鉀鈉D110.1M2，2-雙二羥甲基苯胺PH6.530％PEG33500.01M乙二胺四乙酸D120.1MN-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸PH7.530％PEG335010％v/vTacsimatePH7.0E10.1M乙酸鈉pH4.615％PEG4000.1M硫酸銨E20.1M檸檬酸鈉PH5.615％PEG4000.1M甲酸鈉E30.1M2，2-雙二羥甲基苯胺PH6.515％PEG4000.1M氯化鎂E40.1MN-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸PH7.515％PEG4000.1M丙二酸鈉E50.1M乙酸鈉pH4.620％PEG40010％v/v2-甲基-2，4戊二醇E60.1M檸檬酸鈉PH5.620％PEG40010％v/v乙二醇E70.1M2，2-雙二羥甲基苯胺PH6.520％PEG40010％v/v異丙醇E80.1MN-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸PH7.520％PEG4000.1M丙二酸鈉E90.1M乙酸鈉pH4.625％PEG4000.1M甘氨酸E100.1M檸檬酸鈉PH5.625％PEG4000.1M酒石酸鉀鈉E110.1M2，2-雙二羥甲基苯胺PH6.525％PEG4000.01M乙二胺四乙酸E120.1MN-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸PH7.525％PEG40010％v/vTacsimatePH7.0F10.1M乙酸鈉pH4.615％PEG10000.1M硫酸銨F20.1M檸檬酸鈉PH5.615％PEG10000.1M甲酸鈉F30.1M2，2-雙二羥甲基苯胺PH6.515％PEG10000.1M氯化鎂F40.1MN-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸PH7.515％PEG10000.1M丙二酸鈉F50.1M乙酸鈉pH4.620％PEG100010％v/v2-甲基-2，4戊二醇F60.1M檸檬酸鈉PH5.620％PEG100010％v/v乙二醇F70.1M2，2-雙二羥甲基苯胺PH6.520％PEG100010％v/v異丙醇F80.1MN-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸PH7.520％PEG10000.1M丙二酸鈉F90.1M乙酸鈉pH4.625％PEG10000.1M甘氨酸F100.1M檸檬酸鈉PH5.625％PEG10000.1M酒石酸鉀鈉F110.1M2，2-雙二羥甲基苯胺PH6.525％PEG10000.01M乙二胺四乙酸F120.1MN-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸PH7.525％PEG100010％v/vTacsimatePH7.0G10.1M乙酸鈉pH4.610％PEG20000.1M硫酸銨G20.1M檸檬酸鈉PH5.610％PEG20000.1M甲酸鈉G30.1M2，2-雙二羥甲基苯胺PH6.510％PEG20000.1M氯化鎂G40.1MN-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸PH7.510％PEG200010％v/vTacsimatePH7.0G50.1M乙酸鈉pH4.615％PEG200010％v/v2-甲基-2，4戊二醇G60.1M檸檬酸鈉PH5.615％PEG200010％v/v乙二醇G70.1M2，2-雙二羥甲基苯胺PH6.515％PEG200010％v/v異丙醇G80.1MN-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸PH7.515％PEG200010％v/vTacsimatePH7.0G90.1M乙酸鈉pH4.620％PEG20000.1M甘氨酸G100.1M檸檬酸鈉PH5.620％PEG20000.1M酒石酸鉀鈉G110.1M2，2-雙二羥甲基苯胺PH6.520％PEG20000.01M乙二胺四乙酸G120.1MN-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸PH7.520％PEG200010％v/vTacsimatePH7.0H10.1M乙酸鈉pH4.615％PEG15000.1M硫酸銨H20.1M檸檬酸鈉PH5.615％PEG15000.1M甲酸鈉H30.1M2，2-雙二羥甲基苯胺PH6.515％PEG15000.1M氯化鎂H40.1MN-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸PH7.515％PEG150010％v/vTacsimatePH7.0H50.1M乙酸鈉pH4.620％PEG150010％v/v2-甲基-2，4戊二醇H60.1M檸檬酸鈉PH5.620％PEG150010％v/v乙二醇H70.1M2，2-雙二羥甲基苯胺PH6.520％PEG150010％v/v異丙醇H80.1MN-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸PH7.520％PEG150010％v/vTacsimatePH7.0H90.1M乙酸鈉pH4.625％PEG15000.1M甘氨酸H100.1M檸檬酸鈉PH5.625％PEG15000.1M酒石酸鉀鈉H110.1M2，2-雙二羥甲基苯胺PH6.525％PEG15000.01M乙二胺四乙酸H120.1MN-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸PH7.525％PEG150010％v/vTacsimatePH7.02.根據權利要求1所述的以聚乙二醇為基礎的96條件生物大分子結晶篩選試劑盒，其特征在于所述沉淀劑是PEG4000、PEG6000、PEG8000、PEG3350、PEG400、PEG1000、PEG2000或PEG1500任一種。3.根據權利要求1或2所述的以聚乙二醇為基礎的96條件生物大分子結晶篩選試劑盒，其特征在于所述沉淀劑濃度是10%30%v/v。4.根據權利要求1所述的以聚乙二醇為基礎的96條件生物大分子結晶篩選試劑盒，其特征在于所述添加劑是硫酸銨、甲酸鈉、氯化鎂、丙二酸鈉、2-甲基-2，4戊二醇、乙二醇、異丙醇、TacsimatePH7.0、甘氨酸、酒石酸鉀鈉或乙二胺四乙酸任一種。5.根據權利要求1或4所述的以聚乙二醇為基礎的96條件生物大分子結晶篩選試劑盒，其特征在于所述添加劑濃度是0.1M。6.根據權利要求1所述的以聚乙二醇為基礎的96條件生物大分子結晶篩選試劑盒，其特征在于所述緩沖液是乙酸鈉、檸檬酸鈉、2，2-雙二羥甲基苯胺或N-2-羥乙基哌嗪-N，-2-乙磺酸。7.根據權利要求1或6所述的以聚乙二醇為基礎的96條件生物大分子結晶篩選試劑盒，其特征在于所述緩沖液濃度是0.1M。8.根據權利要求1、6或7所述的以聚乙二醇為基礎的96條件生物大分子結晶篩選試劑盒，其特征在于所述緩沖液PH值是48。全文摘要本發明公開了一種以聚乙二醇作為沉淀劑用于蛋白質結晶篩選96條件試劑盒，其目的是解決現有的96條件篩選試劑盒在蛋白質結晶條件篩選中成功率低的技術問題。技術方案是采用的PEG是BMCD數據庫中統計出的使用頻率最高的前8種，不是隨機選取，顯著地提高了生物大分子結晶的成功率。如刀豆球蛋白的成功率由
背景技術：
的4.2％提高到81.2％，溶菌酶的成功率由
背景技術：
的29.2％提高到46.9％，蛋白酶K的成功率由
背景技術：
的58.3％提高到66.7％，過氧化氫酶的成功率由
背景技術：
的15.6％提高到30.2％。另外由于本試劑盒是以PEG為沉淀劑的，所用試劑種類較少，相對
背景技術：
試劑盒成本較低。文檔編號C07K1/30GK101817869SQ20101014713公開日2010年9月1日申請日期2010年4月15日優先權日2010年4月15日發明者劉君,尹大川,張仙芳,郭云珠,鹿芹芹申請人:西北工業大學