專利名稱：抑制癌細胞生長的短肽及其編碼基因與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種抑制癌細胞生長的短肽及其編碼基因與應用。
背景技術：
癌癥，也稱為惡性腫瘤，是由于細胞增殖與凋亡的精準調控機制失常所引起的疾病，癌細胞除了生長失控外，還會局部侵入周遭正常組織甚至經由體內循環系統擴散或轉移到身體其他器官。癌癥已經成為全球人類健康的首要殺手之一，據世界衛生組織(WorldHealth Organization, WHO) 2010年發表的公告，全球每年有1200萬人被確診為癌癥，760萬人死于癌癥。若不加控制，預計到2030年每年癌癥死亡人數有可能達到1700萬人，且大多數發生在中低收入的發展中國家。WHO統計數據表明，2005年我國有189. 2萬人死于癌癥，其中118. 2萬人為70歲以下，胃癌為最高發癌癥種類，而近年來我國癌癥發病更是逐漸趨于低齡化。發現并發展新的癌癥治療的藥物，對于社會的穩定，人民健康生活質量的提高，社會經濟發展都具有良好的推動作用。目前，用于臨床的癌癥藥物種類繁多，但多數抗癌藥物在抑制癌癥細胞生長的同時，對于人體正常組織也有一定的損害，使癌癥病人在治療癌癥過程中承受巨大的生理和心理的折磨。癌癥細胞的調控機制失常往往是由于一些重要調控基因的失活造成的。目前，已經發現的抑癌基因根據其 在細胞中的失活機理可簡單的分為兩類。I型抑癌基因是指其在DNA層面上，基因發生突變而喪失抑制細胞生長作用的基因。II型抑癌基因是一種新穎的抑癌基因，它們在正常細胞中存在一定水平的表達，具有一定的功能，而在腫瘤細胞中DNA并沒有發生改變，而其基因的轉錄和翻譯在不同程度上下調，從而喪失抑制細胞生長的作用。II型抑癌基因對于正常細胞和個別的癌癥細胞并沒有明顯的抑制作用，而對于大多數癌癥細胞具有很明顯的抑制和誘導細胞凋亡的作用。因此，II型抑癌基因中具有抑癌作用的短肽將有望成為新型的抗癌新藥。來自人類蛋白的短肽，在細胞中能夠被多種酶降解代謝為天然氨基酸，對人體沒有毒性，也不會造成累計效應。由于II型抑癌基因的自身特點，對正常細胞不產生抑制作用，來自II型抑癌基因的短肽將不會對正常細胞或人體正常器官組織產生副作用，減少治療過程對癌癥病人造成的痛苦。因此，來自II型抑癌基因的抑癌短肽有望成為一種新型的綠色仿生藥物。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種多肽。本發明提供的多肽，是如下(a)或(b)的多肽(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的多肽；(b)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有抑制腫瘤細胞生長和/或促進腫瘤細胞凋亡功能的由(a)衍生的多肽。所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。所述多肽的編碼基因也是本發明保護的范圍。所述編碼基因為如下I)-3)中任一所述的DNA分子I)序列表中的序列I所示的DNA分子；2)在嚴格條件下可與I)限定的DNA序列雜交且編碼具有抑制腫瘤細胞生長和/或促進腫瘤細胞凋亡功能的 多肽的DNA分子；3)與I)限定的DNA序列具有70%以上的同源性且編碼具有抑制腫瘤細胞生長和/或促進腫瘤細胞凋亡功能的多肽的DNA分子。上述嚴格條件可為在0.1 X SSPE (或0.1 X SSC)，0.1 % SDS的溶液中，在65°C條件下雜交并洗膜。含有所述基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌也在本發明保護的范圍。所述重組載體為將所述多肽的編碼基因插入pcDNA3.1-BFPC-1inker中，得到表達所述多肽的重組載體。所述pcDNA3.1-BFPC-1inker按照如下方法制備I)在pcDNA3.1載體的NotI和ClaI酶切位點間插入Tag BFP編碼基因(序列3)，得到重組載體pcDNA3.1-BFPC ；2)在步驟I)得到的重組載體pcDNA3.1-BFPCLinkerClaI和BspEI酶切位點間插A Linker 基因的 DNA 片段(序列 6)，得到載體 pcDNA3. 1-BFPC-linker。所述轉基因細胞系是將所述的重組載體導入到宿主細胞中得到的轉基因細胞系，所述宿主細胞具體為子宮頸癌細胞，所述子宮頸癌細胞尤其優選為HeLa細胞。擴增所述基因的全長或其任一片段的引物對也是本發明保護的范圍，所述引物對的一條引物的核苷酸序列為序列表中的序列4，所述引物對中的另一條引物的核苷酸序列為序列表中的序列5。所述多肽、所述多肽的編碼基因、所述重組載體或所述轉基因細胞系在制備預防和/或治療腫瘤的產品的應用；或所述多肽、所述多肽的編碼基因、所述重組載體或所述轉基因細胞系在制備抑制腫瘤細胞生長和/或促進腫瘤細胞凋亡產品中的應用。所述抑制腫瘤細胞生長和/或促進腫瘤細胞凋亡體現在如下I)-5)中的任意一種I)降低腫瘤細胞線粒體膜電位、促進磷酯酰絲氨酸外翻、激活細胞凋亡蛋白胱冬蛋白酶(caspase)和促進腫瘤細胞死亡；2)促進腫瘤細胞死亡；3)降低腫瘤細胞線粒體膜電位；4)促進磷酯酰絲氨酸外翻；5)激活細胞凋亡蛋白胱冬蛋白酶(caspase)；
所述腫瘤細胞具體為子宮頸癌細胞，所述子宮頸癌細胞尤其優選為HeLa細胞；所述產品為藥物。本發明的另一個目的是提供一種抑制腫瘤生長產品。本發明提供的產品，其活性成分為所述多肽、所述多肽的編碼基因、所述重組載體或所述轉基因細胞系。本發明的實驗證明，本發明通過對II型抑癌基因功能區域的研究，發現一種可以抑制人類癌細胞的生長并誘導細胞凋亡的三十七肽，通過對HeLa細胞的施用實驗，發現該短肽能夠造成人類子宮頸癌細胞HeLa細胞的凋亡，因此該短肽可能成為良好的低副作用的抗癌藥物。


圖1為短肽引起人類子宮頸癌細胞HeLa細胞線粒體膜電位的降低圖2為短肽誘導人類子宮頸癌細胞HeLa細胞的凋亡圖3為短肽誘導細胞死亡的死亡率統計
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例1、短肽的獲得

本發明所用短肽序列來自一種人類第二類腫瘤抑制因子，其DNA片段可以通過以人類肝臟cDNA文庫為模板的PCR擴增獲得。以人類肝臟cDNA文庫為模板，以h2cm7-N/h2cm7-C為引物，進行PCR擴增，得到該短肽基因片段的PCR產物，該基因片段兩端分別帶有BspEI和XbaI酶切位點。h2cm7-N :5，-CGATTCTCCGGACGCAGTGACCAGGTCAGAGAT-3，(序列 4)；h2cm7-C :5，-CTAGTCTAGATTATTGCTTTTGTCGCTTGTTTC-3’ (序列 5)。具體PCR反應體系如下
人類肝臟cDNA文庫0.5 ^iL
正向引物2.5 ^iL(IpM)
反向引物2.5 ^iL(IpM)
2XPfu MasterMix25 [iL (購于天根生化科技有限公司)
H2O_19 uL_
50 JiL反應條件940C 5min2 94°C 40sec3 60°C 40sec4 72 °C 45min72 °C 30min
4 °C IOmin2, 3,4 為 cycle 反應需要 30cycles得到136bp的PCR產物，經過測序該PCR產物具有序列表中序列I所示的核苷酸，其編碼的多肽具有序列表中序列2所示的氨基酸，將該多肽命名為REVC37。也可人工合成序列I作為模板，以h2cm7_N和h2cm7_C為引物，同樣得到136bp的PCR 產物 REVC37。也可直接人工合成序列2作為REVC37。實施例2、短肽REVC37的功能鑒定一、含有短肽REVC37基因序列的重組載體的構建1、融合Tag BFP熒光蛋白載體pcDNA3.1-BFPC的構建I) Tag BFP基因片段的制備Tag BFP根據Gene Bank的序列由博邁德科技發展有限公司全基因合成。Tag BFP的Gene Bank號為ABP88744.1 (核苷酸序列為序列3)。以全基因合成得到的含有Tag BFP序列的質粒為模板(也可人工合成序列3作為模板)，以BFP-N/BFP-C為引物，進行PCR擴增，得到PCR產物即為Tag BFP基因片段，該基因片段兩端分別帶有NotI和ClaI酶切位點。BFP-N :5’ -TAATGCGGCCGCATGAGCGAGCTGATTAAGGAG-3’
`
BFP-C :5’ -ACATATCGATATTAAGCTTGTGCCCCAGTT-3’具體PCR擴增反應體系
Tag BFP模板基因I隊(20 ng)
正向引物2.5 ^iL(IpM)
反向引物2.5 ^iL(IpM)
2XPfu MasterMix25 [iL (購于天根生化科技有限公司)
H2O_19 uL_
50 JiLPCR反應條件94°C 5min2 94°C 40sec3 60°C 40sec4 72。。1. 5min72 °C 30min4 °C IOmin2, 3,4 為 cycle 反應需要 30cycles得到731bp的PCR產物，經過測序，該PCR產物具有序列表中序列3所示的核苷酸，即為Tag BFP基因片段。2)融合Tag BFP熒光蛋白載體的構建將步驟I)得到的Tag BFP基因片段經過NotI和ClaI酶切，得到酶切產物，將該酶切產物與經過同樣酶切得到的pcDNA3.1載體(購自Invitrogen，產品目錄號為V860-20)連接，得到連接產物，取5 u L連接產物加入大腸桿菌TOPlO感受態細胞中(購于天根生化科技有限公司)，冰浴30min，42°C熱擊90s，冰浴5min，加入Iml LB培養基，37°C溫箱溫浴lh，涂布于Amp+平板，37°C溫箱培育過夜，得到轉化子。挑取轉化子的單克隆接種于LB液體培養基培養并提取質粒，將該質粒用NotI和ClaI酶切，能得到731bp核苷酸片段的為陽性質粒，選擇陽性質粒使用T7和BGHrev通用引物進行測序，測序結果與Tag BFP編碼基因相符的即為構建成功的質粒，該質粒為在pcDNA3.1載體的NotI和ClaI酶切位點間插入Tag BFP編碼基因(序列3)的重組載體，將該重組載體記作pcDNA3.1-BFPC0上述酶切反應體系如下
權利要求
1.一種多肽，是如下(a)或(b)的多肽(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的多肽；(b)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有抑制腫瘤細胞生長和/或促進腫瘤細胞凋亡功能的由(a)衍生的多肽。
2.權利要求1所述多肽的編碼基因。
3.根據權利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述編碼基因為如下1)-3)中任一所述的DNA分子1)序列表中的序列I所示的DNA分子；2)在嚴格條件下可與I)限定的DNA序列雜交且編碼具有抑制腫瘤細胞生長和/或促進腫瘤細胞凋亡功能的多肽的DNA分子；3)與I)限定的DNA序列具有70%以上的同源性且編碼具有抑制腫瘤細胞生長和/或促進腫瘤細胞凋亡功能的多肽的DNA分子。
4.含有權利要求2或3所述基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。
5.根據權利要求4所述的重組載體，其特征在于所述重組載體為將權利要求1所述多肽的編碼基因插入pcDNA3.1-BFPC-1inker中，得到表達所述多肽的重組載體。
6.根據權利要求4所述的轉基因細胞系，其特征在于所述轉基因細胞系是將權利要求5所述的重組載體導入到宿主細胞中得到的轉基因細胞系，所述宿主細胞具體為子宮頸癌細胞，所述子宮頸癌細胞尤其優選為HeLa細胞。
7.擴增權利要求2或3所述基因的全長或其任一片段的引物對，所述引物對的一條引物的核苷酸序列為序列表中的序列4，所述引物對中的另一條弓I物的核苷酸序列為序列表中的序列5。
8.權利要求1所述的多肽、權利要求2或3所述多肽的編碼基因、權利要求4或5所述重組載體或權利要求4或6所述轉基因細胞系在制備預防和/或治療腫瘤的產品的應用；或權利要求1所述的多肽、權利要求2或3所述多肽的編碼基因、權利要求4或5所述重組載體或權利要求4或6所述轉基因細胞系在制備抑制腫瘤細胞生長和/或促進腫瘤細胞凋亡產品中的應用。
9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于所述抑制腫瘤細胞生長和/或促進腫瘤細胞凋亡體現在如下I)-5)中的任意一種1)降低腫瘤細胞線粒體膜電位、促進磷酯酰絲氨酸外翻、激活細胞凋亡蛋白胱冬蛋白酶和促進腫瘤細胞死亡；2)促進腫瘤細胞死亡；3)降低腫瘤細胞線粒體膜電位；4)促進磷酯酰絲氨酸外翻；5)激活細胞凋亡蛋白胱冬蛋白酶；所述腫瘤細胞具體為子宮頸癌細胞，所述子宮頸癌細胞尤其優選為HeLa細胞。
10.一種抑制腫瘤生長產品，其活性成分為權利要求1所述的多肽、權利要求2或3所述多肽的編碼基因、權利要求4或5所述重組載體或權利要求4或6所述轉基因細胞系。
全文摘要
本發明公開了一種抑制癌細胞生長的短肽及其編碼基因與應用。本發明提供的多肽，是如下(a)或(b)的多肽(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的多肽；(b)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有抑制腫瘤細胞生長和/或促進腫瘤細胞凋亡功能的由(a)衍生的多肽。本發明的實驗證明，本發明提供的多肽能夠造成人類子宮頸癌細胞HeLa細胞的凋亡，因此該短肽可能成為良好的低副作用的抗癌藥物。
文檔編號C07K14/47GK103030688SQ20111029791
公開日2013年4月10日 申請日期2011年9月30日 優先權日2011年9月30日
發明者夏斌, 林堅, 任曉白, 魏賀佳 申請人:北京大學