一種人細胞色素酶p450基因多態性檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種人細胞色素酶P450基因多態性檢測試劑盒，該試劑盒采用從外周血細胞中提取基因組DNA的方法，用CYP2C9*3、CYP2C19*2、CYP2C19*3基因特異引物進行PCR擴增后，將帶生物素標記的擴增產物與固定在醛基片上的相應基因型檢測探針進行特異雜交反應，洗去未結合產物后加入標記液，反應一段時間再清洗后對芯片進行掃描，得到樣品DNA擴增產物與每個相應基因位點的野生型和突變型探針雜交形成的雜交圖像，經過軟件分析圖像，判斷待檢品的基因型。上述試劑盒提供的利用基因芯片法檢測基因多樣性，操作過程簡單，包含的信息量大，具有良好的市場前景。
【專利說明】—種人細胞色素酶P450基因多態性檢測試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，具體涉及一種檢測人細胞色素酶P450基因多態性的試劑盒。
【背景技術】
[0002]人細胞色素P450酶(CYP)是定位在內質網膜(微粒體)上的一類結合有亞鐵血紅素的蛋白。CYP酶系是由超基因家族編碼的一組結構與功能相關的同工酶，該酶系能夠催化許多不同類型的氧化反應，包括羥基化、環氧化、雜環原子氧化、雜環原子脫烷基化、氧化基團遷移、脫酯化和脫氫反應。因此該酶家族是人體中重要的一類單氧化酶，在體內發揮著許多功能，特別在藥物代謝過程中具有重要作用，是人體內主要的藥物代謝酶。
[0003]大量的研究結果表明，細胞色素P450酶系的基因多態性在個體對藥物的代謝及處置、對環境毒物的敏感性、以及與代謝相關的疾病發生等方面都有著重要的影響。細胞色素P450酶系也已經成為了臨床上指導個體化給藥，研究毒物暴露引起的疾病，以及遺傳代謝相關疾病的重要生物標記物。
[0004]CYP有多個亞家族，其中CYP2C9是第二亞家族中的一個重要成員，占肝微粒體P450蛋白總量的20%。CYP2C9能羥化代謝許多不同性質的藥物，主要是酸性底物。據統計，目前約有16%的的臨床藥物由CYP2C9負責代謝。CYP2C9的基因頻率在不同人種和不同民族之間差異很大。在中國人口中，除了野生型CYP2C9*1，已發現的最主要的基因型是CYP2C9*3，其基因頻率約為3.3%。CYP2C19也是CYP450酶第二亞家族中的重要成員，是人體重要的藥物代謝酶，在肝臟中有很多表達。CYP2C19具有很多基因多態(SNP)位點，最常見的是 CYP2C19*2 和 CYP2C19*3。`
[0005]因此，分析CYP2C9和CYP2C9基因多態性可推斷代謝表型，從而預測解毒能力和患病風險，在臨床研究上意義重大。可見，尋求一種能夠快速檢測識別CYP2C9*3、CYP2C19*2、CYP2C19*3基因的方法在實現上述目的時尤為重要。

【發明內容】

[0006]為實現上述目的，本發明提供了一種用于快速檢測人細胞色素酶P450( CYP2C9*3、CYP2C19*2、CYP2C19*3)基因多態性的試劑盒。
[0007]本發明的另一個目的是上述試劑盒在檢測CYP2C9*3、CYP2C19*2、CYP2C19*3基因
多態性上的應用。
[0008]為了實現以上目的，本發明采用如下技術方案:
[0009]本發明提供一種基因芯片，該基因芯片上連接有CYP2C9*3、CYP2C19*2、CYP2C19*3
基因特異檢測探針。
[0010]上述基因芯片上連接的CYP2C9*3、CYP2C19*2、CYP2C19*3基因特異檢測探針是:
[0011]CYP2C9*3 野生型 ACTCATCACGCAGCTCATTTTTTTTTTTTT;
[0012]CYP2C9*3 突變型 ACTCATCATGCAGCTCATTTTTTTTTTTTT;[0013]CYP2C19*2 野生型 GATGGCCAGCGTGGACAATTTTTTTTTTTT;
[0014]CYP2C19*2 突變型 GATGGCCATCGTGGACAATTTTTTTTTTTT;
[0015]CYP2C19*3 野生型 CAACCCCCACGTGTGCCGTTTTTTTTTTT;
[0016]CYP2C19*3 突變型 ACCCCCACCACGTGTGCCGTTTTTTTTTTT。
[0017]上述基因芯片上還連接有質控探針，該質控探針是:TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT。
[0018]本發明還提供包含上述基因芯片的一種用于人細胞色素酶Ρ450基因多態性的檢測試劑盒。
[0019]本發明的試劑盒還包括以下部分:PCR反應液，酶混合物(Emix)，野生型質控品，突變型質控品，陰性對照，雜交液，標記液，洗滌母液A，洗滌母液B，洗滌母液C，顯色液A，顯色液B。
[0020]上述試劑盒各部分的組分與配比如下:
[0021]PCR 反應液:KC1，Tris-HCl 緩沖液，MgCl2, NTP, CYP2C9*3、CYP2C19*2、CYP2C19*3基因特異引物對的混合液
[0022]酶混合物(Emix)=Taq 酶
[0023]野生型質控品:含CYP2C9*3、CYP2C19*2、CYP2C19*3野生型基因的重組DNA片段
[0024]突變型質控品:含CYP2C9*3、CYP2C19*2、CYP2C19*3突變型基因的重組DNA片段
[0025]陰性對照:TE緩沖液
[0026]雜交液:8X SSC, 0.2%SDS，甲酰胺
[0027]標記液:辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素復合物
[0028]洗滌母液A:10%SDS
[0029]洗滌母液B:20 X SSC
[0030]洗滌母液C:磷酸鹽吐溫緩沖液
[0031]顯色液A:魯米諾溶液
[0032]顯色液B:過氧化氫水溶液
[0033]上述PCR反應液中的CYP2C9*3、CYP2C19*2、CYP2C19*3基因特異引物對是:
[0034]CYP2C9*3 上游引物 ATCGCATTCATGCGTCTTCA ；
[0035]CYP2C9*3 下游引物 ATCCCCATGGCAAACTCTTG;
[0036]CYP2Cl9*2 上游引物 GACTGAATATAAACTTGTGG;
[0037]CYP2Cl9*2 下游引物 CTGTATCAAAGAATGGTCCT;
[0038]CYP2Cl9*3 上游引物 GACTGTGTTTCTCCCTTCT;
[0039]CYP2C19*3 下游引物 TGGCAAATACACAAAGAAAG。
[0040]本發明試劑盒檢測人細胞色素酶P450基因多態性，包括如下步驟:
[0041]1、核酸提取
[0042]DNA的濃度應達到10-60ng/ul，A260/A280比值在1.5~2.0之間，如果DNA必須稀釋，使用PH7.6的TE緩沖液作為稀釋液。
[0043]2、PCR 反應
[0044]在分別包含 有野生型質控品、突變型質控品，PCR反應液和酶混合物的體系中進行目的基因的擴增，擴增后進行雜交反應。
[0045]3、芯片雜交[0046](I)預處理芯片:首先在洗滌母液A漂洗30s，再在純化水中漂洗30s。甩去芯片表面的純化水，于室溫晾干備用；
[0047](2)配置雜交液:將PCR產物置95°C中熱變性5min后，立即置于冰水浴中5min后，取變性的擴增產物4 μ 1，與4 μ I雜交液充分混勻。
[0048](3)雜交反應:立即吸取全部雜交混合液加入芯片反應區中，使其分布均勻，然后將芯片平置于濕盒或雜交盒中，于45°C水浴中雜交I小時。
[0049](4)配置洗液:在雜交反應過程中，按下述配方配制洗滌液1、I1、II1、IV，將洗滌液1、I1、II1、IV分別盛于三個250ml燒杯中。
[0050]洗滌液1:4ml洗滌母液A、IOml洗滌母液B，加蒸餾水稀釋至200ml ；
[0051]洗滌液II:2ml洗滌母液B加蒸餾水稀釋至200ml ；
[0052]洗滌液III: Iml洗滌母液B加蒸餾水稀釋至200ml ；
[0053]洗滌液IV:5ml洗滌母液C加超純水稀釋至100ml ；
[0054](5)清洗芯片:雜交反應結束后，將雜交反應區中的雜交混合液吸出；芯片依次置于洗滌液1、I1、III中各漂洗30s，其間不斷攪動。取出芯片，甩去殘留在芯片上的液體，室溫避光晾干。
[0055](6)標記顯色:在芯片的每個雜交區加入標記液10μ 1，37°C溫育25min，取出后用洗滌液IV清洗3次，每次20s，輕輕甩去芯片上的洗液，再用超純水清洗3次后置于室溫晾干后在芯片的每個雜交區加入`混合液25 μ I。
[0056](7)芯片掃描。
[0057]本發明選取檢測相應基因的SNP位點作為增靶區域，設計特異性引物及各型特異型探針，采用PCR體外擴增法結合DNA雜交技術，可同時用于檢測細胞色素酶中的CYP2C9*3、CYP2C19*2、CYP2C19*3基因多態性，此方法檢測基因多樣性，操作相對簡單，包含的信息量大。本發明的試劑盒可用于有相應基因主導的藥物代謝能力的輔助診斷，檢測結果可供臨床參考，具有良好的市場前景和應用價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0058]圖1是基因芯片掃描圖；其中白色實框內是CYP2C19*3基因檢測結果，白色虛框內是CYP2C9*3基因檢測結果。
[0059]圖2是基因芯片掃描圖；其中白色實框內是CYP2C19*3基因檢測結果，白色虛框內是CYP2C9*3基因檢測結果。
[0060]圖3是是基因芯片掃描圖；其中白色實框內是CYP2C19*3基因檢測結果，白色虛框內是CYP2C9*3基因檢測結果。
【具體實施方式】
[0061]以下實施例用于進一步說明本發明，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的前提下，對本發明所作的修飾或者替換，均屬于本發明的范疇。
[0062]實施例1人細胞色素酶P450基因多態性基因芯片法檢測試劑盒的建立
[0063]1、引物
[0064]將合成好的引物結合PCR緩沖液和酶系，以企業工作參考品中最低檢出量參考品為樣本，在適用的儀器上，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。檢測結果表明:最低檢出量參考品檢測能區分相應的基因型。
[0065]2、探針
[0066]取每條探針IOD分別溶于探針buffer，配制成終濃度分別為100 μ mol/L，-20±5°C保存。將保存濃度的探針用探針buffer稀釋成工作濃度，分別點制在芯片的相應位置上。將制備好的芯片結合質檢合格的細胞色素酶P450 (CYP)基因多態性基因芯片法檢測試劑盒的其它組分，以企業工作參考品中最低檢出量參考品為樣本，在適用的儀器上，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。檢測結果表明:最低檢出量參考品檢測能區分相應的基因型。
[0067]3、分型陰性質控品的制備
[0068]為無DNA的TE緩沖溶液，按每管20 μ I分裝，制備成分型陰性質控品，-20±5°C保存。
[0069]在確定無任何外源性污染的條件下，用人細胞色素酶P450(CYP450)基因多態性基因芯片法檢測試劑盒，以分型陰性質控品為樣本，在適用的儀器上，嚴格按照試劑盒說明書操作。檢測結果顯示為陰性，無DNA擴增。
`[0070]4、野生型質控品的制備
[0071]為人工構建的質粒提取的DNA樣本，樣本經測序證實為CYP2C9*3野生型、CYP2C19*2野生型、CYP2C19*3野生型，用TE緩沖液稀釋約至104copies/ul，按每管20 μ I分裝，-20 ±5 °C保存。
[0072]在確定無任何外源性污染的條件下，用人細胞色素酶P450 (CYP)基因多態性基因芯片法檢測試劑盒，以野生型質控品為樣本，在適用的儀器上，嚴格按照試劑盒說明書操作。檢測結果顯示為CYP2C9*3野生型、CYP2C19*2野生型、CYP2C19*3野生型。
[0073]5、突變型質控品的制備
[0074]為人工構建的質粒提取的DNA樣本，樣本經測序證實為CYP2C9*3突變型、CYP2C19*2突變型、CYP2C19*3突變型，用TE緩沖液稀釋約至104copies/ul,按每管20 μ I分裝，-20 ±5 °C保存。
[0075]在確定無任何外源性污染的條件下，用人細胞色素酶P450(CYP450)基因多態性基因芯片法檢測試劑盒，以突變型質控品為樣本，在適用的儀器上，嚴格按照試劑盒說明書操作。檢測結果顯示為CYP2C9*3突變型、CYP2C19*2突變型、CYP2C19*3突變型。
[0076]6、PCR 反應液
[0077]將配制好的PCR反應液(購自天根生物)結合質檢合格的人細胞色素酶P450 (CYP)基因多態性基因芯片法檢測試劑盒的其它組分，以企業工作參考品中最低檢出量參考品為樣本，在適用的儀器上，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。檢測結果表明:最低檢出量參考品檢測能區分相應的基因型。
[0078]7、酶系的配制
[0079]配制好的酶系(購自天根生物)結合PCR反應液及質檢合格的人細胞色素酶P450 (CYP)基因多態性基因芯片法檢測試劑盒的其它組分，以企業工作參考品中最低檢出量參考品為樣本，在適用的儀器上，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。檢測結果表明:最低檢出量參考品檢測能區分相應的基因型。[0080]8、雜交試劑的配制
[0081]雜交試劑由雜交液、洗滌母液A、洗滌母液B組成。
[0082]雜交液:成分為8 X SSC,0.2%SDS和4%甲酰胺。
[0083]洗滌母液A: 10%SDS。
[0084]洗滌母液B:20XSSC。
[0085]將雜交液、洗滌母液A、洗滌母液B配制成工作液后，結合質檢合格的人細胞色素酶P450(CYP)基因多態性基因芯片法檢測試劑盒的其它組分，以企業工作參考品中最低檢出量參考品為樣本，在適用的儀器上，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。檢測結果表明:最低檢 出量參考品檢測能區分相應的基因型。
[0086]9、基因芯片制備
[0087]按設計好的分隔膜貼在醛基片上，然后按規定的陣列點上探針，經過固定后裝入芯片盒中完成基因芯片的制備。
[0088]將制備好的基因芯片結合質檢合格的人細胞色素酶P450 (CYP)基因多態性基因芯片法檢測試劑盒的其它組分，以企業工作參考品中最低檢出量參考品為樣本，在適用的儀器上，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。檢測結果表明:最低檢出量參考品檢測能區分相應的基因型。
[0089]10、試劑盒重復性試驗
[0090]分別用野生型企業參考品和突變型企業參考品重復檢測5次，用信號值計算變異系數(CV)均不大于20%。
[0091]11、試劑盒保存后敏感性試驗
[0092]試劑盒到達效期后一個月，用企業靈敏度參考品檢測，靈敏度符合產品標準要求。
[0093]實施例2人細胞色素酶P450基因多態性基因芯片法檢測試劑盒的組裝
[0094]本發明的試劑盒由以下部分組成:基因芯片，PCR反應液，酶混合物(Emix)，野生型質控品，突變型質控品，陰性對照，雜交液，標記液，洗滌母液A，洗滌母液B，洗滌母液C，顯色液A，顯色液B。
[0095]上述試劑盒各部分的組分與配比如下:
[0096]基因芯片:連接有CYP2C9*3、CYP2C19*2、CYP2C19*3基因特異檢測探針和質控探
針的醛基芯片。
[0097]PCR 反應液:KC1，Tris-HCl 緩沖液，MgCl2, NTP, CYP2C9*3、CYP2C19*2、CYP2C19*3基因特異引物對的混合液
[0098]酶混合物(Emix):Taq 酶
[0099]野生型質控品:含CYP2C9*3、CYP2C19*2、CYP2C19*3野生型基因的重組DNA片段
[0100]突變型質控品:含CYP2C9*3、CYP2C19*2、CYP2C19*3突變型基因的重組DNA片段
[0101]陰性對照:TE緩沖液
[0102]雜交液:8XSSC，0.2%SDS，甲酰胺
[0103]標記液:辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素復合物
[0104]洗滌母液A:10%SDS
[0105]洗滌母液B:20 X SSC
[0106]洗滌母液C:磷酸鹽吐溫緩沖液[0107]顯色液A:魯米諾溶液
[0108]顯色液B:過氧化氫水溶液
[0109]該試劑盒，上述組分的量為:PCR反應液:450 μ I ;酶混合物Taq酶6 μ I野生型質控品:20μ I ;突變型質控品:20μ I ;陰性對照:20μ I ;雜交液:60 μ I ;標記液:120 μ I ;洗漆母液A:5ml ;洗漆母液B:6.5ml ;洗漆母液C:6.5ml ；PBST:5ml ;顯色液A:120 μ I ;顯色液 B:120 μ I。
[0110]實施例3人細胞色素酶Ρ450基因多態性基因芯片法檢測試劑盒的檢測程序
[0111]3.1測定步驟
[0112]3.1.1核酸提取
[0113]1.按照血液基因組DNA提取試劑盒使用說明書提取和純化DNA，進行樣本基因組DNA提取時，尤其是大樣本量提取時，應采用必要的標記方法，避免試劑漏加。
[0114]2.DNA的濃度應達到10-60ng/ μ 1，Α260/Α280比值在1.5~2.0之間，如果DNA必須稀釋，使用ΡΗ7.6的TE緩沖液作為稀釋液，樣品DNA提取后一 20°C冰箱保存或直接進入下一步。
[0115]3.-20°C冷藏的DNA樣品使用前置于室溫待融后混勻，且反復凍融不超過5次。
[0116]3.1.2 PCR 反 應
[0117]1.取出PCR反應液放置室溫待凍融后，漩渦振蕩混勻片刻，離心，放置在冰上；
[0118]2.取0.2ml的PCR反應管，每管加入19.5ul PCR反應液，做好標記、編號；
[0119]3.加入5 μ I核酸模板，0.5ul酶混合物(Emix)，蓋緊離心管蓋，混勻；
[0120]4.質控品使用:取PCR反應液分別加入5μ I的野生型質控品、突變型質控品，
0.5ul酶混合物(Emix)，做好標記后蓋緊離心管蓋，混勻；
[0121]5.陰性對照-M PCR反應液加入5 μ I的TE緩沖液，再加0.5ul酶混合物(Emix)，做好標記后蓋緊離心管蓋，混勻；
[0122]6.離心:6000rpm，離心片刻。
[0123]7.擴增:放入基因擴增儀，按以下條件進行PCR反應。
[0124]預變性:95°C,15min
[0125]
變性:94V, 30s 、
退火:60°C，Imin >擴增35次循環
延伸:72O, ,Os.[0126]延伸:72°C，5min
[0127]保持:4°C，——
[0128]擴增完成后立即進行雜交反應或者4°C暫時保存。
[0129]3.1.3芯片雜交
[0130]1.將試劑盒中的雜交液、洗滌母液A、洗滌母液B置于45°C水浴中，至其中析出的晶體或沉淀全部溶解，搖勻。
[0131]2.取4ml洗滌母液A加純水至200ml作為芯片預洗液，盛于250ml燒杯中，取另一 250ml燒杯盛裝純化水；取出基因芯片，先在芯片預洗液中漂洗30s后，再在純化水中漂洗30s。甩去芯片表面的純化水，于室溫晾干備用。
[0132]3.將PCR產物置95°C中熱變性5min后，立即置于冰水浴中5min，以形成單鏈便于雜交反應(注意:熱變性過程中將反應管封好，以免液體蒸發)。
[0133]4.取變性的擴增產物4 μ I，與4 μ I雜交液充分混勻(共8 μ I )，配制雜交混合液；立即吸取全部雜交混合液加入芯片反應區中，使其分布均勻(以雜交混合液覆蓋雜交反應區且不溢出為準)。
[0134]5.將芯片平置于濕盒或雜交盒中，于45°C水浴中雜交I小時。
[0135]注意:雜交反應時應防止冷凝水滴落在芯片上；移動雜交盒時應充分注意，以防各反應區的反應液交叉污染。
[0136]6.在雜交反應過程中，按下述配方配制洗滌液1、I1、II1、IV，將洗滌液1、11、111、IV分別盛于三個250ml燒杯中。
[0137]洗滌液1:4ml洗滌母液A、IOml洗滌母液B，加蒸餾水稀釋至200ml ；
[0138]洗滌液II:2ml洗滌母液B加蒸餾水稀釋至200ml ；
[0139]洗滌液III: Iml洗滌母液B加蒸餾水稀釋至200ml ；
[0140]洗滌液IV:5ml洗滌母液C加超純水稀釋至100ml ；
[0141]7.雜交反應結束后，將雜交反應區中的雜交混合液吸出；芯片依次置于洗滌液
1、I1、III中各漂洗30s，其間不斷攪動。取出芯片，甩去殘留在芯片上的液體，室溫避光晾干。注意:洗滌過程應連續進行，避免在洗滌過程中芯片干燥。
[0142]8.在芯片的每個雜交區加入標記液10μ 1，37°C溫育25min，取出后用洗滌液IV清洗3次，每次20s，輕輕甩去芯片上的洗液，再用超純水清洗3次后置于室溫晾干；
[0143]9.取130 μ I顯色液A和130 μ I顯色液B混勻后，在芯片的每個雜交區加入混合液 25 μ I。
[0144]10.芯片掃描
[0145]3.2結果分析
[0146]芯片掃描結束后進行數據化處理并導出、保存掃描數據文件，應用結果分析判讀軟件對檢測結果進行自動判讀分析。
[0147]3.2.1質控結果有效性
[0148]I)引物互補序列探針信號值> 10 ；
[0149]2)基片質控信號值≥10 ；
[0150]3)內陰性對照信號值〈10 ；
[0151]4)野生型質控品檢測結果為CYP2C9*3野生型(CYP2C9*1/*1)、CYP2C19野生型(CYP2C19*1/*1)；
[0152]5)野生型質控品檢測結果為CYP2C9*3突變型(CYP2C9*3/*3)、CYP2C19*2突變型(CYP2C19*2/*2), CYP2C19*3 突變型(CYP2Cl9*3/*3)；
[0153]6)陰性對照檢測結果為陰性:所有檢測的野生型探針和突變型探針的信號值<100 ；
[0154]7)野生型、突變型檢測探針的信號值均〈100時，無目的基因擴增，需重新檢測。
[0155]3.2.2 CYP2C9*3 基因型判定:
[0156]I)基因芯片上CYP2C9*3野生型、突變型檢測探針的均值之比≥1.0，實驗結果判定為野生型基因(CYP2C9*1/*1)；
[0157]2)基因芯片上CYP2C9*3野生型、突變型檢測探針的均值之比為0.4-1.0,實驗結果判定為雜合型基因(CYP2C9*l/*3)；
[0158]3)基因芯片上CYP2C9*3野生型、突變型檢測探針的均值之比≤ 0.4，實驗結果判定為突變型基因(CYP2C9*3/*3) 。
[0159]3.2.3 CYP 2C19*2 基因型判定:
[0160]I)基因芯片上CYP 2C19*2野生型、突變型檢測探針的均值之比≥1.0，實驗結果判定為野生型基因(CYP2C19*1/*1)；
[0161]2)基因芯片上CYP 2C19*2野生型、突變型檢測探針的均值之比為0.2-1.0，實驗結果判定為雜合型基因(CYP2C19*l/*2)；
[0162]3)基因芯片上CYP 2C19*2野生型、突變型檢測探針的均值之比≤0.2，實驗結果判定為突變型基因(CYP2C19*2/*2)；
[0163]3.2.4 CYP 2C19*3 基因型判定:
[0164]I)基因芯片上CYP 2C19*3野生型、突變型檢測探針的均值之比≥1.0，實驗結果判定為野生型基因(CYP2C19*1/*1)；
[0165]2)基因芯片上CYP 2C19*3野生型、突變型檢測探針的均值之比為0.2-1.0，實驗結果判定為雜合型基因(CYP2C19*l/*3)；
[0166]3)基因芯片上CYP 2C19*3野生型、突變型檢測探針的均值之比≤ 0.2，實驗結果判定為突變型基因(CYP2C19*3/*3)。
[0167]實施例3人細胞色素酶P450基因多態性基因芯片法檢測試劑盒的應用
[0168]用本發明制備的人細胞色素酶P450基因多態性基因芯片法檢測試劑盒對送檢血清樣品進行檢測，圖1-3為80個血清樣本的檢測結果，檢測結果發現本批樣品中存在一定的檢出率。其中CYP2C19*3野生型樣品為28份，CYP2C19*3雜合型樣品為26份，CYP2C19*3突變型樣品為26份；且在本批樣本中CYP2C9*3全部都是野生型。隨機抽取每個基因型內的20個樣本進行測序，結果證實本發明方法檢測正確率為100%。可見，本發明制備的人細胞色素酶P450基因多態性基因芯片法檢測試劑盒可用于對血清樣品的檢測，這將為基因多態性的快速檢測提供有力的數據參考。
[0169]序列表
<ilO>北京普利耐特生物科技有限公司
<120> 一種人細胞色素酶P450基因多態性檢測i式剤盒
<130> PN1306346-01
<160> 13
<170> PatcntIn version 3.5
<210> I^11> 30<212〉 DNA<213>人工序列
<400>I
actcatcacg cagctcattt tttttttttt30
<2i0>2`<211>30
<212> DNA
<213>人工序列
<400>2`
acieatcgitg cagctcattt tttttttttt30
<210> 3
<211〉 30
<212> DNA
<213>人工序列
^400> 3
gatggccagc gtggacaatt ttttt/ttttt30
<210>I<211> 30
[0170]
【權利要求】
1.一種基因芯片，其特征在于，該芯片上連接有CYP2C9*3、CYP2C19*2、CYP2C19*3基因特異檢測探針。
2.根據權利要求1所述的基因芯片，其特征在于，芯片上的CYP2C9*3、CYP2C19*2、CYP2C19*3基因特異檢測探針分別是: CYP2C9*3 野生型 ACTCATCACGCAGCTCATTTTTTTTTTTTT ； CYP2C9*3 突變型 ACTCATCATGCAGCTCATTTTTTTTTTTTT ； CYP2C19*2 野生型 GATGGCCAGCGTGGACAATTTTTTTTTTTT ； CYP2C19*2 突變型 GATGGCCATCGTGGACAATTTTTTTTTTTT ； CYP2C19*3 野生型 CAACCCCCACGTGTGCCGTTTTTTTTTTT ； CYP2C19*3 突變型 ACCCCCACCACGTGTGCCGTTTTTTTTTTT。
3.根據權利要求1所述的基因芯片，其特征在于，該芯片上還連接有質控探針。
4.根據權利要求3所述的基因芯片，其特征在于，芯片上的質控探針是:`rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp rp
5.一種人細胞色素酶P450基因多態性基因芯片法檢測試劑盒，其特征在于，包括權利要求I所述的基因芯片。
6.根據權利要求5所述的基因芯片法檢測試劑盒，其特征在于，其還包括PCR反應液，酶混合物，野生型質控品，突變型質控品，陰性對照，雜交液，標記液，洗滌母液A，洗滌母液B,洗滌母液C，顯色液A，顯色液B的其中一種或多種。
7.根據權利要求6所述的基因芯片法檢測試劑盒，其特征在于，所述PCR反應液是KCl, Tris-HCl 緩沖液，MgCl2, NTP, CYP2C9*3、CYP2C19*2、CYP2C19*3 基因特異引物對的混合液；所述酶混合物是Taq酶；所述野生型質控品含CYP2C9*3、CYP2C19*2、CYP2C19*3野生型基因的重組DNA片段；所述突變型質控品含CYP2C9*3、CYP2C19*2、CYP2C19*3突變型基因的重組DNA片段；所述陰性對照是TE緩沖液；所述雜交液是8XSSC，0.2%SDS，甲酰胺的混合液；所述標記液是辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素復合物；所述洗滌母液A是10%SDS ；所述洗滌母液B是20 X SSC ;所述洗滌母液C是磷酸鹽吐溫緩沖液；所述顯色液A是魯米諾溶液；所述顯色液B是過氧化氫水溶液。
8.根據權利要求7所述的基因芯片法檢測試劑盒，其特征在于，所述PCR反應液中的CYP2C9*3、CYP2C19*2、CYP2C19*3 基因特異引物對是: CYP2C9*3 上游引物 ATCGCATTCATGCGTCTTCA ； CYP2C9*3 下游弓丨物 ATCCCCATGGCAAACTCTTG ； CYP2C19*2 上游引物 GACTGAATATAAACTTGTGG ； CYP2C19*2 下游引物 CTGTATCAAAGAATGGTCCT ； CYP2C19*3 上游引物 GACTGTGTTTCTCCCTTCT ； CYP2C19*3 下游引物 TGGCAAATACACAAAGAAAG。
9.權利要求1-8任一項所述的基因芯片法檢測試劑盒在檢測CYP2C9*3、CYP2C19*2、CYP2C19*3基因多態性上的應用。
10.根據權利要求9所述的應用，包括以下步驟: O核酸提取 DNA的濃度應達到10-60ng/ μ 1，Α260/Α280比值在1.5~2.0之間，如果DNA必須稀釋，使用PH7.6的TE緩沖液作為稀釋液； 2)PCR反應 分別以野生型質控品或突變型質控品為模板，加入PCR反應液和酶混合物進行目的基因的擴增，擴增后進行雜交反應； 3)芯片雜交 (1)預處理芯片:首先在洗滌母液A中漂洗30s，再在純化水中漂洗30s，甩去芯片表面的純化水，于室溫晾干備用； (2)配置雜交液:將PCR產物置95°C中熱變性5min后，立即置于冰水浴中5min后，取變性的擴增產物4 μ 1，與4 μ I雜交液充分混勻； (3)雜交反應:立即吸取全部雜交混合液加入芯片反應區中，使其分布均勻，然后將芯片平置于濕盒或雜交盒中，于45°C水浴中雜交I小時； (4)配置洗液:在雜交反應過程中，按下述配方配制洗滌液1、I1、II1、IV，將洗滌液1、I1、II1、IV分別盛于三個250ml燒杯中； 洗滌液1:4ml洗滌母液A、IOml洗滌母液B，加蒸餾水稀釋至200ml ； 洗滌液II:2ml洗滌母液B加蒸餾水稀釋至200ml ； 洗滌液III =Iml洗滌母液B加蒸餾水稀釋至200ml ； 洗滌液IV:5ml洗滌母液C加`超純水稀釋至100ml ； (5)清洗芯片:雜交反應結束后，將雜交反應區中的雜交混合液吸出；芯片依次置于洗滌液1、I1、111中各漂洗30s，其間不斷攪動。取出芯片，甩去殘留在芯片上的液體，室溫避光晾干； (6)標記顯色:在芯片的每個雜交區加入標記液IOy1，37°C溫育25min，取出后用洗滌液IV清洗3次，每次20s，輕輕甩去芯片上的洗液，再用超純水清洗3次后置于室溫晾干后在芯片的每個雜交區加入顯色混合液25 μ I ; (7)芯片掃描。
【文檔編號】C12Q1/68GK103509858SQ201310317804
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年7月26日 優先權日:2013年7月26日
【發明者】王巍, 劉琪琦, 林曉云, 李洪強, 李洪生 申請人:北京普利耐特生物科技有限公司, 中國人民解放軍軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所