專利名稱：一種適用于對氨基偶氮苯的人工抗原合成方法
技術領域：
一種適用于對氨基偶氮苯的通用人工抗原的合成方法，屬于生物化工技術領域。
背景技術：
對氨基偶氮苯，英文名p-aminoazobenzene;Aniline Yellow,4-Aminoazobenzene ;化學名也叫4-氨基偶氮苯，苯胺黃；CAS號60-09-3 ;分子式是C12HnN3。偶氮染料(偶氮基兩端連接芳基的一類有機化合物)是紡織品服裝在印染エ藝中應用最廣泛的ー類合成染料，在特殊條件下，它能分解產生20多種致癌芳香胺，經過活化作用改變人體的DNA結構引起病變和誘發癌癥。偶氮是國際環保要求的必檢項目之一，檢驗方法有以下三種薄層色譜法(TLC)，氣相色譜及質譜聯用法(GC-MSD)及高效液相色譜法(HPLC)。標準規定被檢產品中不得含有23種偶氮染料中間體，若檢出其中ー種即為不合格產品，其限量為30ppm。對氨基偶氮苯是這些有害芳香胺中的ー種，在歐盟公布的偶氮染 料標準中，對氨基偶氮苯屬于禁用芳香胺中的MAK(III)A2組中的ー種。國外大部分現行相關標準法規都將對氨基偶氮苯列入禁用芳香胺行列。如德國《食品及日用消費品法》等，而國內在涉及紡織品、染料、皮革制品的標準都沒有將其列入。由于檢測技術的限制，常規的檢驗方法無法對其進行檢測。近年來，國內外已經開展了對偶氮類免疫分析方法的研究，但國內外尚很少有針對對氨基偶氮苯的酶聯免疫檢測的報道，有必要制備能產生更好特異性抗體的對氨基偶氮苯人工抗原。
發明內容
本發明的目的是提供一種適用于對氨基偶氮苯的通用人工抗原的合成方法。所制備的產品用于對氨基偶氮苯的免疫分析方法研究。為今后人們的研究提供了必需的人工抗原。本發明的技術方案一種適用于對氨基偶氮苯的通用人工抗原的合成方法，分別以對氨基苯丁酸和對氨基苯こ酸進行重氮化，重氮化產物分別與與苯胺進行反應，從而獲得2個針對對氨基偶氮苯的衍生物I :對氨基偶氮苯丁酸，和對氨基偶氮苯的衍生物2 :對氨基偶氮苯こ酸；同時以對氨基偶氮苯丁酸為半抗原，用活性酯法將其與載體蛋白BSA偶聯作為免疫原用來免疫兔子產生抗體；以對氨基偶氮苯こ酸為半抗原，用活性酯法將其與載體蛋白OVA偶聯作為包被原，用來建立酶聯免疫檢測方法。( I)對氨基偶氮苯衍生物的制備
在冰浴下(_5°C-0°C )將底物對氨基苯丁酸(358 mg,2mmol)溶于稀鹽酸中(1N,4 mL),然后加入亞硝酸鈉(138 mg, 2 mmol),攪拌15min后加入苯胺(186 mg, 2 mmol),整個過程保持0°C以下O. 5h，反應監測(LC/MS)原料消耗完全，將此反應溶液轉至制備色譜純化，制得對氣基偶氣苯衍生物I。同理將底物換成對氨基苯こ酸，可制得對氨基偶氮苯衍生物2。
權利要求
1.一種適用于對氨基偶氮苯的通用人工抗原的合成方法，其特征在于分別以對氨基苯丁酸和對氨基苯乙酸進行重氮化，重氮化產物分別與苯胺進行反應，從而獲得2個針對對氨基偶氮苯的衍生物I :對氨基偶氮苯丁酸，對氨基偶氮苯的衍生物2 :對氨基偶氮苯乙酸；同時以對氨基偶氮苯丁酸為半抗原，用活性酯法將其與載體蛋白BSA偶聯作為免疫原用來免疫兔子產生抗體；以對氨基偶氮苯乙酸為半抗原，用活性酯法將其與載體蛋白OVA偶聯作為包被原，用來建立酶聯免疫檢測方法； (1)對氨基偶氮苯人工抗原的制備 取0. 5mL的含有0. Immol對氨基偶氮苯衍生物I的N，N-二甲基甲酰胺DMF，加入0.15mmol碳化二亞胺EDC和0. 15mmol N-羥基琥珀酰亞胺NHS室溫避光反應3h，為A液；將0. 0025mmol牛血清蛋白BSA溶解到0. 01M、pH7. 4的磷酸鹽PBS緩沖液中，為B液；然后將A液緩慢滴加到B液中，室溫反應6h，離心去掉沉淀，取上清液即得人工抗原混合液； 透析袋前處理取10 cm的透析袋，于沸水中煮沸5m i n，再用6 (TC的去離子水沖洗3min，保存在4°C去離子水中備用； 將人工抗原混合液移入透析袋中，用2L的0. OlM的PBS溶液透析2次和2L的去離子水透析2次，總計透析3天；最后使用凍干法將透析袋中的液體制成粉末，即得對氨基偶氮苯人工抗原； (2)對氨基偶氮苯包被原的制備 將步驟(I)中的對氨基偶氮苯衍生物I替換為對氨基偶氮苯衍生物2，其余操作均與步驟(I)相同，即得對氨基偶氮苯包被原。
全文摘要
一種對氨基偶氮苯人工抗原的合成方法，屬于生物化工技術領域。本發明分別以對氨基苯丁酸和對氨基苯乙酸進行重氮化與苯胺進行反應，從而獲得2個針對對氨基偶氮苯的衍生物1和2；同時以對氨基偶氮苯衍生物1為半抗原，用活性酯法將其與載體蛋白BSA偶聯作為免疫原用來免疫兔子產生抗體；以對氨基偶氮苯衍生物2為半抗原，用活性酯法將其與載體蛋白OVA偶聯作為包被原。用紫外掃描儀測定偶聯物的偶聯比。本發明成功合成了對氨基偶氮苯的人工抗原，合成步驟簡潔，有效，并且在應用于免疫分析中獲得針對對氨基偶氮苯特異性非常好的抗體，可以滿足國內對其研究的需要。
文檔編號C07K14/77GK102827271SQ201210369910
公開日2012年12月19日 申請日期2012年9月29日 優先權日2012年9月29日
發明者胥傳來, 李灼坤, 匡華, 王風艷, 王利兵, 劉麗強, 胡擁明 申請人:江南大學