一種重組的菲律賓蛤仔腫瘤壞死因子RpTNF及其構建和應用的制作方法
【專利摘要】本發明屬于水產生物【技術領域】，具體的說是一種重組的菲律賓蛤仔腫瘤壞死因子RpTNF及其構建和應用。重組的菲律賓蛤仔腫瘤壞死因子RpTNF的氨基酸序列如序列表SEQ?ID?NO.1中所示。本發明是通過表面展示技術將菲律賓蛤仔腫瘤壞死因子（RpTNF）展示于安全的微生物解脂耶羅威亞酵母（Yarrowia?lipolytica）上。操作簡單，改造后的酵母可直接應用菲律賓蛤仔的水產養殖，可增強養殖動物抗弧菌感染能力，明顯提高其存活率。因而實施將其應用在水產養殖領域中。
【專利說明】—種重組的菲律賓蛤仔腫瘤壞死因子RpTNF及其構建和應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于水產生物【技術領域】，具體的說是一種重組的菲律賓蛤仔腫瘤壞死因子RpTNF及其構建和應用。
【背景技術】
[0002]免疫增強劑是指能夠促進或誘發宿主防御反應，增強生物機體抗病能力的一類物質。因其具有安全、廣譜、高效、無毒、無污染、低成本等諸多優點，目前已在畜牧養殖中作為飼料添加劑廣泛應用。但快速發展的水產養殖業所需的免疫增強劑的開發和應用仍處于起步階段，其中較為關鍵的就是解決活性物質的導入技術和應用方法的難題。
[0003]表面展示(Surface display)技術是一種較新的基因工程技術,它使表達的外源肽或蛋白質以融合蛋白形式展現在噬菌體或細胞的表面，被展示的多肽或蛋白質可以保持相對獨立的空間結構和生物活性，借以研究多肽(蛋白質)的性質、相互識別和作用等。目前利用酵母菌進行表面展示的技術已發展相對成熟，其中利用酒精酵母表面展示的系統已經完全商品化。
[0004]TNF是機體免疫調控的關鍵組分,其功能活性包括誘發細胞凋亡、介導細胞毒反應、提聞吞曬細胞吞曬活性、誘導相關細胞因子和免疫效應物質的表達等多種功能，在機體的正常或病理條件下均發揮著重要的調控作用。

【發明內容】

[0005]本發明目的在于提供一種重組的菲律賓蛤仔腫瘤壞死因子RpTNF及其構建和應用。
[0006]為實現上述目的，本發明采用的技術方案為:
[0007]一種重組的菲律賓蛤仔腫瘤壞死因子RpTNF，重組的菲律賓蛤仔腫瘤壞死因子RpTNF的氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.1中所示。
[0008]進一步的說，通過表面展示技術將菲律賓蛤仔腫瘤壞死因子(RpTNF)展示于解脂耶羅威亞酵母(Yarrowia lipolytica)上，即得到具有序列表SEQ ID N0.1中氨基酸序列的重組蛋白RpTNF菌株。
[0009]所述表面展示過程為:
[0010]1)以菲律賓蛤仔腫瘤壞死因子(RpTNF)編碼區為模板，采用Pl和P2為引物進行PCR擴增，待用；
[0011]2)PCR擴增產物與？1?181載體通過T4連接酶連接，而后將連接產物與經HindIII，BamHI雙酶切后表面展示載體連接；
[0012]3)將上述構建連接載體轉入解脂耶羅維亞菌株中進行誘導培養，經免疫熒光檢測，即得到具有序列表SEQ ID N0.1中氨基酸序列的重組蛋白RpTNF菌株；
[0013]所述引物分別Pl (5’-CGCAAGCTTCTCACTGGAAAGGAACAAC-3’)和 P2 (5’-CGCGGATCCGTGGTGGTGGTGGTGGTGAAAATAATTGTCCCTTGTGTA-3’)。
[0014]所述重組的菲律賓蛤仔腫瘤壞死因子RpTNF可作為抗弧菌感染的免疫增強劑。
[0015]所述重組的菲律賓蛤仔腫瘤壞死因子RpTNF可作為提高菲律賓蛤仔存活率的免疫增強劑。
[0016]本發明所具有的優點:
[0017]本發明利用表面展示(Surface display)技術獲得重組的菲律賓蛤仔腫瘤壞死因子(RpTNF)，經表面展示的重組RpTNF酵母菌可直接應用，不需要經過提純，應用方式簡單，且具有激活機體免疫，增加抗細菌感染能力，提高宿主的存活率等多重效果。
[0018]本發明是通過表面展示技術將菲律賓蛤仔腫瘤壞死因子(RpTNF)展示于安全的微生物解脂耶羅威亞酵母(Yarrowia lipolytica)上。操作簡單,改造后的酵母可直接應用菲律賓蛤仔的水產養殖，可增強養殖動物抗弧菌感染能力，明顯提高其存活率。因而實施將其應用在水產養殖領域中。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1為本發明實施例提供的不同劑量RpTNF酵母提高菲律賓蛤仔弧菌感染后存活率的情況圖。
【具體實施方式】
[0020]下面的實驗例中將對本發明作進一步的闡述，但本發明不限于此。
[0021]實驗例I
[0022]菲律賓蛤仔RpTNF酵母表面展示氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.1中所示。
[0023]SEQ ID N0.1
[0024]MKPAAKLTGKEQPDLRKTDSNADMVPIREWRNGRELYDTKGFIRYGIRYRNGRLVVPVDGTYFI
[0025]YSNIDFFESCNPSSGLPDIKDINKPIKHGIFKFNILEGEENELVSNVQPHTISTNRYYNSYSSY
[0026]VSSLAELKAGDELSVKVSNITYIRYTRDNYFGVNLI
[0027]序列特征: [0028]長度:164個氨基酸
[0029]類型:蛋白
[0030]鏈型:單鏈
[0031]拓撲結構:線形
[0032]特性:編碼的成熟多肽分子量為18.86kDa，等電點為8.54，具有一個完整的THD結構域。
[0033]來源:菲律賓給仔Ruditapes phiIippinarum
[0034]菲律賓蛤仔RpTNF酵母表面展示的載體構建:
[0035]1.重組載體的構建:
[0036]本發明中采用酵母菌表面展示的表達載體的具體信息參見文獻(Yue L, ChiZj WangLj Liu Jj Madzak C，Li Jj Wang X:Construction of a new plasmid for surfacedisplay on cells of Yarrowia lipolytica.J Microbiol Methods 2008，72:116-123)。
[0037]通過PCR技術，使用5’末端分別添加了 HindIII，BamHI特定酶切位點的基因特異性引物 PI (5 ’ -CGCAAGCTTCTCACTGGAAAGGAACAAC-3 ’)和 P2 (5 ’ -CGCGGATCCGTGGTGGTGGTGGTGGTGAAAATAATTGTCCCTTGTGTA-3’ )擴增菲律賓蛤仔腫瘤壞死因子(RpTNF)基因含THD結構域的編碼區片段。
[0038]反應條件為:首先94°C預變性5分鐘，然后進入下列循環:94°C變性30秒，58°C退火30秒，72 °C延伸I分鐘，共進行35個循環，最后72°C延伸10分鐘。
[0039]將PCR產物純化回收，與pMD18-T載體連接。轉化后，挑取單克隆利用上述載體引物進行菌落PCR篩選并測序，驗證測序正確后用質粒提取試劑盒提取陽性克隆質粒(大連寶生物工程有限公司)，待用；使用Hindlll，BamHI雙酶切亞克隆質粒，用膠回收純化試劑盒(大連寶生物工程有限公司)對酶切產物純化回收；純化片段與經HindIII，BamHI雙酶切的酵母表面展示載體連接，完成載體的構建。
[0040]2.目的蛋白的表面展示:將上述構建的重組載體和空載體轉化到解脂耶羅威亞酵母(Yarrowia lipolytica),挑取單克隆,經測序驗證讀碼框正確,如序列表SEQ ID N0.1中氨基酸所示的菲律賓蛤仔腫瘤壞死因子(RpTNF)。將單克隆接種于200mL PBB液體培養基中，28°C震蕩搖床中培養3-5天，然后取50 μ L涂片于多聚賴氨酸包被的載玻片上，通過免疫熒光的方法檢測RpTNF在酵母菌的表達情況。載玻片上的酵母菌依次通過5%脫脂奶粉37°C封閉I小時，RpTNF多克隆抗體(RpTNF多克隆抗體參見如下文獻中的記載進行構建，Cheng SF, Zhan WB, Xing J, Sheng XZ:Development and characterization of monoclonalantibody to the lymphocystis disease virus of Japanese flounder Paralichthysolivaceus isolated from China.Journal of Virological Methods 2006, 135:173-180)在37°C孵育30分鐘，Invitrogen Axla488標記的突光抗體(Invitrogen公司的產品,抗體標記Axla488熒光蛋白)在37°C孵育30分鐘后，利用熒光顯微鏡在488nm的激發波長下觀察RpTNF在酵母菌表面的表達情況，酵母菌表面呈現綠色熒光，即得到具有序列表SEQ IDN0.1中氨基酸所示的櫛孔扇貝肽聚糖識別重組蛋白RpTNF的菌株，進而表明RpTNF已被正確表達，并成功展不于細胞表面。
[0041]實施例2
[0042]表面展示RpTNF重組酵母提高提高菲律賓蛤仔抗弧菌感染的能力
[0043]實驗中將蛤仔隨機分為6組，除了每天投喂單胞藻飼料(？？)外，還按照以下設定添加上述展示的酵母菌:第1-3組分為投喂 含有RpTNF的上述展示的酵母菌，第4組投喂不含任何插入片段的IO5Cfu mL-1空白酵母菌，第5和6組不投喂酵母菌。每組有三個平行，每個平行含有28只蛤仔。第6天時，第1-5組加入IO6Cfuml/1.鰻弧菌，每日觀察蛤仔的死亡率。實驗結果如圖1所示，10天后RpTNF酵母投喂組蛤仔的存活率明顯高于空白和對照組，中劑量的RpTNF酵母投喂組的死亡率小于高劑量和低劑量組，且幾乎沒有死亡的蛤仔，顯示了較強的免疫保護作用
[0044]上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。
【權利要求】
1.一種重組的菲律賓蛤仔腫瘤壞死因子RpTNF，其特征在于:重組的菲律賓蛤仔腫瘤壞死因子RpTNF的氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.1中所示。
2.按權利要求1所述的重組的菲律賓蛤仔腫瘤壞死因子RpTNF的構建方法，其特征在于: 通過表面展示技術將菲律賓蛤仔腫瘤壞死因子(RpTNF)展示于解脂耶羅威亞酵母(Yarrowia Iipolytica)上，即得到具有序列表SEQ ID N0.1中氨基酸序列的重組蛋白RpTNF菌株。
3.按權利要求2所述的重組的菲律賓蛤仔腫瘤壞死因子RpTNF的構建方法，其特征在于: 所述表面展示過程為: O以菲律賓蛤仔腫瘤壞死因子(RpTNF)編碼區為模板，采用Pl和P2為引物進行PCR擴增，待用； 2)PCR擴增產物與pMD18-T載體通過T4連接酶連接，而后將連接產物與經Hindlll，BamHI雙酶切后表面展示載體連接； 3)將上述構建連接載體轉入解脂耶羅維亞菌株中進行誘導培養，經免疫熒光檢測，即得到具有序列表SEQ ID N0.1中氨基酸序列的重組蛋白RpTNF菌株； 所述引物分別 Pl (5，-CGCAAGCTTCTCACTGGAAAGGAACAAC-3，)和 P2 (5，-CGCGGATCCGTGGTGGTGGTGGTGGTGAAAATAATTGTCCCTTGTGTA-3，)。
4.按權利要求1所述的重組的菲律賓蛤仔腫瘤壞死因子RpTNF的應用，其特征在于:所述重組的菲律賓蛤仔腫瘤壞死因子RpTNF可作為抗弧菌感染的免疫增強劑。
5. 按權利要求4所述的重組的菲律賓蛤仔腫瘤壞死因子RpTNF的應用，其特征在于:所述重組的菲律賓蛤仔腫瘤壞死因子RpTNF可作為提高菲律賓蛤仔存活率的免疫增強劑。
【文檔編號】C07K14/525GK103467589SQ201310408959
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月10日 優先權日:2013年9月10日
【發明者】宋林生, 邱麗梅, 劉瑞, 岳峰, 孫瑞, 蔣秋芬, 楊傳艷, 衣啟麟 申請人:中國科學院海洋研究所