一種菲律賓蛤仔寡肽的制備方法及其在抗前列腺癌中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種菲律賓蛤仔寡肽，其氨基酸序列為Asp-Trp-Pro-His，公開了該種寡肽的制備方法，即利用胰蛋白酶酶解獲得目標寡肽酶解液，再經超濾、陰離子交換、及反相高效液相色譜進一步分離純化獲得目標寡肽；同時還公開了該種寡肽在抗前列腺癌中的應用，具體的，可有效抑制體外培養前列腺癌PC-3、DU-145細胞生長，誘導凋亡，改變細胞周期。與現有技術相比，本發明制備菲律賓蛤仔寡肽的方法，工藝過程簡單，雜質少，效率高，同時在現有技術的基礎上，揭示了該種寡肽在抗前列腺癌上的效用。
【專利說明】一種菲律賓蛤仔寡肽的制備方法及其在抗前列腺癌中的應 用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種菲律賓蛤仔寡肽，尤其涉及這種菲律賓蛤仔寡肽的制備方法及其 在抗前列腺癌領域中的應用。

【背景技術】
[0002] 菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinarum)屬軟體動物門雙殼綱簾蛤目簾蛤科，一 種廣溫性的小型雙殼貝類，南方俗稱花蛤，與牡蠣、縊蟶、蚶類并列為我國四大養殖貝類，是 近岸灘涂和淺海的主要貝類之一，其味道鮮美，營養豐富，蛋白含量高。
[0003] 研究表明，菲律賓蛤仔提取物具有很多生理功效，如抗腫瘤、抗氧化、抑菌和增強 免疫力等，近年來對菲律賓蛤仔提取物的抗腫瘤研究有很大進展，如范秀萍等(食品工業 科技，2003)利用菲律賓蛤仔糖胺聚糖的粗制品（CRG)作用于體外培養的HL-60細胞，發 現CRG在I. Omg/ml濃度下對HL-60細胞具有顯著抑制作用，在24h、48h、72h抑瘤率分別 可達59. 8%、67. 7%和96. 2%。張莉等(海洋與湖沼，2007)利用菲律賓蛤仔肉提取兩種蛋白 聚糖PGl和PG2,其中PGl在200ug/ml濃度時對人肝癌細胞SMMC7721的生長抑制率達到 73. 30%，且不影響人正常肝細胞HL-7002的生長與功能。前列腺癌是男性最常見的惡性腫 瘤之一，在歐美國家由前列腺癌導致的死亡人數占惡性腫瘤引起死亡人數的第二位，僅次 于肺癌。近年來隨著人民平均壽命的延長和診斷技術的提高，我國前列腺癌的發病率呈顯 著增長的趨勢，已經嚴重影響著我國50歲以上男性的生活質量和壽命，成為泌尿外科領域 一個越來越重要的研究課題，但關于菲律賓蛤仔活性提取物對前列腺癌癌細胞抑制作用的 報道較少，且關于菲律賓蛤仔活性肽的抗前列腺癌上的應用的更少。
[0004] 目前，生物活性肽的制備主要有三種方式：一是從自然界的生物體中提取其本身 固有的各種天然活性肽類物質；二是通過蛋白質降解的途徑獲得具有各種生理功能的生 物活性物質；三是利用生物合成的方法來制備生物活性肽。其中，第一種方式中自然界生 物體重活性肽類物質的含量較低，提取過程中產率較低，且需要較多的原料個體，使得成本 較高；第三種方式中生物合成的過程復雜難控，中間產物較多，不適合大規模產生；綜合而 言，由于蛋白酶的酶解特異性和高效性，使得酶解法制取生物活性肽的方法安全性高，產率 商。


【發明內容】

[0005] 本發明所要解決的技術問題是針對現有技術而提供一種利用蛋白酶酶解法制備 菲律賓蛤仔寡肽的方法。
[0006] 本發明所要解決的另一個技術問題是提供該種菲律賓蛤仔寡肽在抗前列腺癌中 的應用。
[0007] 本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為：一種菲律賓蛤仔寡肽的制備方 法，其特征在于包括以下步驟 ：
[0008] ①將菲律賓蛤仔洗凈，取肉后加超純水攪拌，然后去雜質勻漿，制得勻漿樣品；
[0009] ②取適量的所述勻漿樣品，加入適量體積的超純水，此時原料與超純水的比值為 1:1?1:4,加入蛋白酶在水浴箱中進行酶解反應，其中加酶量為300ug?1500ug，酶解反 應的pH值為8?9,酶解時間為4h?12h，酶解溫度為40°C?60°C ;
[0010] ③酶解反應結束后滅活、離心、取上清液備用；
[0011] ④將所述上清液加入超濾膜中進行超濾，收集分子量小于3KDa的酶解物質進行 冷凍干燥備用；
[0012] ⑤利用DEAE S印haroseFF陰離子交換，采用磷酸緩沖液和NaCl溶液對所得酶解 液進行階段洗脫，在280nm波長處收集最高肽峰冷凍干燥后貯存備用；
[0013] ⑥將DEAE S印haroseFF陰離子交換收集的最高肽峰利用反相高效液相色譜法進 行進一步純化，在220nm波長處出現唯一峰，收集該峰，冷凍干燥制得所述菲律賓蛤仔寡 肽。
[0014] 作為優選，所述原料與超純水的比值為1:2,這樣可使原料在水溶液中充分分離， 在不過分稀釋蛋白酶濃度的前提下，增加了蛋白酶與酶解對象的接觸面積，提高了酶解效 率，同時也可保證原料的生物活性。
[0015] 所述蛋白酶可有多種選擇，作為優選，所述蛋白酶為胰蛋白酶，且蛋白酶的最佳酶 解條件組合為：加酶量為1200ug，酶解pH值為8. 0,酶解時間為8h，酶解溫度為50°C。
[0016] 作為優選，所述步驟③中為沸水浴中滅活15min，4°C下10000r/min離心15min，沸 水浴即KKTC可使蛋白酶充分滅活，且4°C下高速離心可保證酶解液中相關物質的生物活 性。
[0017] 所述步驟⑤中NaCl溶液的濃度為0· lmol/L、0. 3mol/L、0. 5mol/L三種，可對酶解 液分階段進行充分洗脫。
[0018] 所述高效液相色譜法的色譜條件為：色譜柱為C18反相柱，填料為0DS，流動相為乙 腈與水（15:85)，流速為0.81111.1^11_ 1，上樣體積為2〇111，檢測波長為22〇11111，洗脫條件為15% 乙腈,20min。
[0019] 由上述方法所得的菲律賓蛤仔寡肽的氨基酸序列為Asp-Trp-Pro-His,該種菲律 賓蛤仔寡肽在抗前列腺癌中的應用，尤其能抑制體外培養前列腺癌PC-3、DU-145細胞的生 長，作用24h后，PC-3、DU-145細胞的早、晚期凋亡細胞便開始增多，且隨著藥液濃度的增 力口，凋亡細胞逐漸增多。
[0020] 與現有技術相比，本發明的優點在于：利用胰蛋白酶酶解獲得目標寡肽酶解液，再 經超濾、陰離子交換、及反相高效液相色譜進一步分離純化獲得目標寡肽，工藝過程簡單效 率高，且獲得的目標寡肽具有抗前列腺癌活性，可有效抑制體外培養前列腺癌PC-3、DU_145 細胞生長，誘導凋亡，改變細胞周期。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 圖1為實施例1中溫度對胰蛋白酶酶解液中ANN含量和腥味值影響關系示意圖；
[0022] 圖2為實施例1中時間對胰蛋白酶酶解液中ANN含量和腥味值影響關系示意圖；
[0023] 圖3為實施例1中pH對胰蛋白酶酶解液中ANN含量和腥味值影響關系示意圖；
[0024] 圖4為實施例1中加酶量對胰蛋白酶酶解液中ANN含量和腥味值影響關系示意 圖；
[0025] 圖5為實施例2中DEAE-s印haroseFF洗脫峰示意圖；
[0026] 圖6為圖5中峰I1經RP-HPLC色譜柱洗脫純化結果示意圖；
[0027] 圖7為目標寡肽氨基酸分子結構示意圖；
[0028] 圖8為實施例3中PRO對PC-3細胞的增殖抑制作用柱狀圖；
[0029] 圖9為實施例3中DU-145對PC-3細胞的增殖抑制作用柱狀圖；
[0030] 圖10為實施例3中對照組PC-3細胞Α0/ΕΒ染色結果示意圖；
[0031] 圖11為實施例3中PC-3細胞經10mg/mL PRO作用24h后Α0/ΕΒ染色結果示意 圖；
[0032] 圖12為實施例3中PC-3細胞經20mg/mL PRO作用24h后Α0/ΕΒ染色結果示意 圖；
[0033] 圖13為實施例3中PC-3細胞經30mg/mL PRO作用24h后Α0/ΕΒ染色結果示意 圖；
[0034] 圖14為實施例3中對照組DU-145細胞Α0/ΕΒ染色結果示意圖；
[0035] 圖15為實施例3中DU-145細胞經10mg/mL PRO作用24h后Α0/ΕΒ染色結果示意 圖；
[0036] 圖16為實施例3中DU-145細胞經20mg/mL PRO作用24h后Α0/ΕΒ染色結果示意 圖；
[0037] 圖17為實施例3中DU-145細胞經30mg/mL PRO作用24h后Α0/ΕΒ染色結果示意 圖；
[0038] 圖18為實施例3中對照組中PC-3細胞凋亡率示意圖；
[0039] 圖19為實施例3中lOmg/mLPRO組中PC-3細胞凋亡率示意圖；
[0040] 圖20為實施例3中20mg/mLPR0組中PC-3細胞凋亡率示意圖；
[0041] 圖21為實施例3中30mg/mLPR0組中PC-3細胞凋亡率示意圖；
[0042] 圖22為實施例3中對照組中DU-145PR0細胞凋亡率示意圖；
[0043] 圖23為實施例3中lOmg/mLPRO組中DU-145PR0細胞凋亡率示意圖；
[0044] 圖24為實施例3中20mg/mLPR0組中DU-145PR0細胞凋亡率示意圖；
[0045] 圖25為實施例3中30mg/mLPR0組中DU-145PR0細胞凋亡率示意圖；
[0046] 圖26為實施例3中RPO對PC-3細胞周期影響示意圖；
[0047] 圖27為實施例3中RPO對DU-145細胞周期影響示意圖；
[0048] 圖28為實施例3中對照組PC-3細胞SubGl峰細胞凋亡示意圖；
[0049] 圖29為實施例3中10mg/mLPR0組PC-3SubGl峰細胞凋亡示意圖；
[0050] 圖30為實施例3中30mg/mLPR0組PC-3SubGl峰細胞凋亡示意圖；
[0051] 圖31為實施例3中對照組DU-145細胞SubGl峰細胞凋亡示意圖；
[0052] 圖32為實施例3中10mg/mLPR0組DU-145細胞SubGl峰細胞凋亡示意圖；
[0053] 圖33為實施例3中30mg/mLPR0組DU-145細胞SubGl峰細胞凋亡示意圖。

【具體實施方式】
[0054] 以下結合附圖實施例對本發明作進一步詳細描述。
[0055] 實施例I :酶解條件的優化
[0056] 蛋白酶的篩選：將新鮮菲律賓蛤仔洗凈后去殼取肉，然后將蛤仔肉放入勻漿機中， 倒入適量的超純水勻漿。稱取適量勻漿樣品，加入2倍重量的超純水，選用胰蛋白酶、木瓜 蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶作供選酶，采用福臨-酚法測定酶活力（參見楊永芳.貽貝 酶解多肽制備工藝及抗前列腺癌活性研究[D].舟山：浙江海洋學院，2011)，按照表1所示 蛋白酶各自的最適作用溫度和pH值，加入1000u/g的蛋白酶，酶解反應6h，反應完成后于沸 水浴滅活15min，冷卻后于4°C，10000r/min預冷的離心機離心15min，取上清液備用。
[0057] 樣品酶解液制備完成后，通過酶解液中游離ANN(氨基氮）含量和酶解液腥味值作 為酶的篩選指標，ANN含量越高、腥味值越低蛋白酶效果越佳。其中采用甲醛電位滴定法來 測定(參見：楊永芳.貽貝酶解多肽制備工藝及抗前列腺癌活性研究[D].舟山：浙江海洋 學院，2011.)酶解液中ANN含量，具體方法如下：在60ml的蒸餾水中加入5ml水解液，檢測 pH值。先用0. lmol/L的NaOH溶液滴定pH8. 2,加入已中和的甲醛溶液20ml，記錄滴定至 pH9. 2時所消耗的0. 05mol/LNa0H溶液的體積，計算其含氮量。
[0058] X= (V1-V2) XCX0. 014X100/(5XV)
[0059] 其中：X為樣品中ANN的含量（g/100ml) ;V1為加入甲醛稀釋后消耗的NaOH標準 液（ml) ;V2為空白試驗加入甲醛后消耗的NaOH標準液體積（ml) ;V為樣品液取用量（ml); C為NaOH標準液的濃度（mol/L) ;0. 014為氮的毫摩爾質量（g/mmoL)。酶解液的腥味評價 及感官評定由10名食品專業的老師和學生組成感官評定小組，對菲律賓蛤仔酶解液的腥 味和其他感官特征如顏色、混濁度等進行綜合評定。腥味評價以蒸餾水作為參照(無腥味分 值為〇分)，按照腥味很輕、腥味輕、腥味一般、腥味較重和腥味很重5個級別來進行評分，滿 分為10分，分數越大，則表明腥味越重，當菲律賓蛤仔酶解液的腥味值在4分及以下時認為 其可接受。
[0060] 四種蛋白酶酶解菲律賓蛤仔肉后酶解液中的ANN含量和感官腥氣味評價結果見 表2,從表2可見胰蛋白酶酶解效果最佳，經過6h酶解后酶解液中ANN含量最高，且腥味較 輕，在可以接受的范圍之內，而且感官顏色也最好；其次是堿性蛋白酶，木瓜蛋白酶和中性 蛋白酶的酶解效果最差且腥味較重，感官顏色也最差，因此，綜合考慮本實施例1中選擇胰 蛋白酶作為水解蛋白酶。
[0061] 酶解條件的確定：采用單因素實驗篩選出胰蛋白酶的最佳作用條件(溫度、時間、 pH、加酶量)，分四組實驗進行。
[0062] 實驗一：溫度單因素：分別稱取適量相同量（IOg)的菲律賓蛤仔5份，調節pH至 8. 0,加入1000u/g的胰蛋白酶，在不同溫度下（40°C，45°C，50°C，55°C，60°C )酶解6h ;
[0063] 實驗二：時間單因素：分別稱取適量相同量（IOg)的菲律賓蛤仔5份，調節pH至 8.0，加入100011/^的胰蛋白酶，在501：下恒溫酶解不同時間（411，611，811，1011，1211) ;
[0064] 實驗三：pH值單因素：分別稱取適量相同量（IOg)的菲律賓蛤仔5份，不同pH值 (7,7· 5,8,8· 5,9)，加入1000u/g的胰蛋白酶，在50°C下恒溫酶解6h ;
[0065] 實驗四：加酶量單因素：分別稱取適量相同量（IOg)的菲律賓蛤仔5份，調節pH至 8. 0,加入不同量（300u/g，600u/g，900u/g，1200u/g，1500u/g)的胰蛋白酶，在 50°C下恒溫 酶解6h。
[0066] 在初步確定酶解條件的基礎上，選擇酶解時間、溫度、pH值、加酶量四個因素設立 三個水平設計正交實驗L9 (34)正交表，確定胰蛋白酶酶解解菲律賓蛤仔制備寡肽的最佳 酶解條件。
[0067] 實驗結果如圖1?4所示，從圖1中可以看出游離ANN含量隨著溫度的升高先是 增加然后達到一個最大值后接著開始下降，在溫度為40-50°C時不斷地增加，到達50°C時 達到最大值，接著隨著溫度升高開始下降，這也正好符合酶促反應中溫度對酶活力的變化 規律；酶解液的腥味隨著溫度的升高不斷下降。因此，綜上考慮，本實施例最初選擇50°C作 為參考。
[0068] 從圖2中可以得知，酶解液中的ANN含量隨著時間的增加不斷增加，開始增速比較 緩慢，8-10h之間增速突然增大，急劇增加，隨后10-12h之間增速又變得很緩慢。腥味值同 樣隨著時間的增加變小，到達IOh后隨著時間的推移開始維持不變。因此，本實施例最初選 取IOh酶解時間作為參考。
[0069] 從圖3可以看出，游離ANN含量隨著pH的升高先增后減，在pH為8. 0時達到最大， 這也正符合酶活和pH之間的關系。酶解液的腥味隨著pH的升高與ANN含量和pH的關系 正好相反，先下降后升高，酶解液在PH值為8. 0時達到最小，隨后隨著pH升高腥味又增加 且有一定的異味產生。因此，選取pH8. 0最為本實施例的最初pH值。
[0070] 從圖4中可以得知酶解液中游離ANN含量隨著酶量的增加會不斷地增加，而且增 速由快到慢，酶解液的腥味隨著酶量的增加剛開始會減小達到一個最小值后又開始增加。 因此，綜合考慮本實施例選用1200u/g的酶量為最初選用酶量。
[0071] 表3為胰蛋白酶酶解正交實驗結果，由表3可知，從酶解液中游離ANN含量可知， 溫度、時間、pH、加酶量四個因素皆會影響胰蛋白酶的酶解效果，其中B (溫度)> D (加酶量） > A (pH) > C (時間），且A2B2C1D3組合效果更好，得到的游離ANN含量最高；從酶解液腥 味值可知看，四種因素的影響也還比較顯著，由極差R'可知知B (溫度）> D (加酶量）=A (PH)=C(時間)，且A2B2C1D2或A2B2C1D3組合效果更好，得到的酶解液腥味值最低。綜合考 慮，得出最佳組合為A2B2C1D3,即蛋白酶的最佳酶解條件為：酶解pH為8.0,溫度為50°C， 酶解時間為8h，加酶量為1200u/g。在此條件組合下，酶解得到的酶解液中游離ANN含量為 3. 125mg/g，腥味值為7?8之間。
[0072] 為了驗證該優化實驗條件的可靠性，將該優化條件參數放大數倍，每個實驗均重 復3次，測得酶解液中游離ANN含量均值在2. 968mg/g左右，腥味值在7?8之間，驗證了 正交試驗的可靠性。
[0073] 實施例2 :酶解寡肽的制備與分離純化
[0074]根據實施例1獲得的酶解條件制備菲律賓蛤仔寡肽，即：將新鮮菲律賓蛤仔洗凈 后去殼取肉，然后將蛤仔肉放入勻漿機中，倒入適量的蒸餾水勻漿。稱取適量勻漿樣品，力口 入2倍重量的水，加入1200u/g的胰蛋白酶，于酶解pH8. 0,溫度50°C條件下酶解反應8h， 反應完成后于沸水浴滅活15min，冷卻后于4°C，10000r/min預冷的離心機離心15min，取上 清液。用截取分子量為3KDa的超濾膜，在20°C環境中超濾Ilh獲得酶解液，冷凍干燥后備 用。用DEAE S印haroseFF陰離子交換，柱型為2. 6X50cm，上樣體積3mL，分別用磷酸緩沖 液、0· lmol/L、0. 3mol/L、0. 5mol/L的NaCl溶液進行階段洗脫，洗脫速度為lml/min，280nm 下紫外監測，自動部分收集器每管4mL進行收集。如圖5所示，取3KDa以下的酶解液經DEAE S印haroseFF柱洗脫后，出現2個峰，即峰I (I1)和峰2 (12)，分別為磷酸緩沖液和0· Imol. L-INaCl溶液的洗脫組分，0· 3mol. Γ1和0· 5mol. Γ1的NaCl溶液沒有明顯的洗脫峰。收集 I1，冷凍干燥后得到I. 3g干燥樣品，得率為0. 33%。
[0075] 對收集到的峰I(I1)利用反相高效液相色譜法進一步純化及檢測，色譜條件為C18 反相柱，填料為ODS ;柱型是IOX250mm;以乙腈/水（15:85)作為流動相，流速是0.8ml. min-1，上樣體積為20 μ L，波長220nm。洗脫條件為乙腈濃度15%，洗脫時間為20min，重復上 樣。如圖6所示，保留時間約為6. OOmin時，出現單一峰，峰高為1022. 1，峰面積為5191. 3， 收集該峰，冷凍干燥后得到〇. 37g樣品，得率為0. 1%。
[0076] 氨基酸序列檢測，目標肽的氨基酸序列分析檢測采用N末端降解檢測方法， 用氨基酸測序儀進行測定，得到菲律賓蛤仔酶解寡肽（Ruditapes philippinarum oligopeptides, RP0)，該目標肽的氨基酸序列為：Asp-Trp-Pro-His,分子量為607. 6Da，命 名為菲律賓蛤仔酶解寡肽（Ruditapes philippinarum oligopeptides, RP0)，分子結構式 見圖7。
[0077] 實施例3 :抗前列腺癌活性檢測
[0078] 前列腺癌PC-3、DU-145細胞培養：配制1000ml F12培養液，加入I. 176g NaHC03， 各10萬IU的青霉素、鏈霉素，進行無菌抽濾，超凈平臺中分裝后于-20°c冰箱中低溫保存， 臨用前IOOml培養液中每加入IOml的胎牛血清。常規培養人前列腺癌PC-3、DU-145細胞 株，置于37°C，5%C02培養箱中培養，2?3天傳代一次。
[0079] 細胞增殖抑制實驗：采用MTT法檢測體外培養前列腺癌PC-3、DU_145細胞存活率。 實驗時選用細胞生長到80%以上且形態較好，處于對數生長期的PC-3、DU-145細胞懸液， 以I X 104/mL接種至96孔板，每孔200 μ 1，培養24h后吸棄上清液。設對照組及10mg/mL、 15mg/mL、20mg/mL、25mg/mL和30mg/mL RPO加藥組，每組設3個復孔，分別培養24h、48h和 72h后棄培養液，加藥組加入200 μ Ilmg/mL MTT，繼續培養4h。吸棄MTT，每孔加入150 μ 1 的DMS0,振蕩10min，置酶標儀在490nm波長處測吸光度，計算細胞增殖抑制指數（IR),實驗 重復3次，IR=[(對照組A值-加藥組A值）/(對照組A值-調零孔A值]X 100%。如圖8 和圖9所示，經不同濃度的RPO分別作用于PC-3、DU145細胞后，結果表明隨著RPO濃度的 增加和作用時間的延長，增殖抑制指數明顯上升，與對照組相比有統計學意義（P〈〇. 05)。因 此，MTT結果顯示PC-3、DU-145細胞經RPO作用后，呈現出明顯的增殖抑制現象，并隨著藥 物濃度的增加和作用時間的延長，抑制指數明顯增加，與時間和劑量呈依賴性。
[0080] Α0/ΕΒ熒光染色：于6孔培養板內放入經經處理過的蓋玻片，將PC-3、DU-145細 胞濃度調至IX 105/mL，接種于培養板中的蓋玻片上，每孔2ml，24h后觀察并換液，設立對 照組及10mg/mL、20mg/mL、30mg/mLRP0加藥組，24h后用PBS清洗3次，再用95%乙醇固定 30min。取AO和EB各Img分別溶解于IOml ρΗ7· 2的PBS緩沖液中，搖勻混合，現配現用，避 光保存。觀察前于載玻片上滴加40 μ I PBS和10 μ I Α0/ΕΒ混合液，10X20熒光顯微鏡下 觀察并拍照。如圖10?17所示，PC-3、DU-145細胞經RPO作用24h后Α0/ΕΒ染色，在熒光 顯微鏡下觀察可見四種細胞，即①活細胞：核染色質均勻，呈綠色；②早期凋亡細胞：細胞 膜完整，核染色質固縮，呈較強綠色；③晚期凋亡細胞：核染色質固縮，呈橘黃或橘紅色；④ 壞死細胞：細胞呈均一橘紅色；其中圖10?13為PC-3細胞Α0/ΕΒ細胞染色形態變化，而圖 14?17為DU-145細胞Α0/ΕΒ細胞染色形態變化。對照組中細胞形態飽滿呈上皮樣生長， 核形態正常呈亮綠色，如圖10和圖14 ;10mg/mL組的PC-3和DU-145細胞出現少許早期凋 亡細胞，核呈綠色，染色質固縮成團塊狀位于細胞核一側或出現新月形等異常變化，如圖11 和圖15 ;20mg/mL組的PC-3和DU-145細胞早期凋亡細胞增多，細胞變圓，核仁數目減少，染 色質固縮，分別呈橘黃色和黃綠色，如圖12和圖16 ;30mg/mL組的PC-3和DU-145細胞出現 晚期凋亡和死亡細胞增多，細胞變圓，核染色質出現明顯的固縮，顏色加深呈橘黃色；胞膜 向外突出形成凋亡小體并且部分細胞核破碎呈橘紅色，如圖13和圖17。
[0081] 流式細胞儀檢測細胞凋亡：PC-3、DU-145細胞按照I X 105/mL接種于6孔培養板 中，24h后換液。設立對照組和10mg/mL、20mg/mL和30mg/mL RPO加藥組，繼續培養24h。用 0. 25%胰蛋白酶消化液消化細胞，加入PBS緩沖液，吹打成單細胞懸液，室溫下1200r/min離 心5min后棄上清液，再用PBS重復洗滌1次。加入400 μ 1的試劑盒專用緩沖液，吹打成細 胞懸液，然后向細胞懸液中加入5μ IAnnexin V-FITC，混勻后再加入5μ 1的ΡΙ，室溫下放 入暗室中靜置5min后上機分析。
[0082] 流式細胞儀檢測細胞周期：取PC-3、DU_145單細胞懸液，將細胞濃度調至I X 105/ mL，接種于6孔培養板，每孔2ml，培養24h后換液，設立對照組及10mg/mL、30mg/mL的RPO 加藥組，培養24h，收集各組細胞。用預冷的75%乙醇溶液固定，并吹打成單細胞懸液，4°C 下放置30min，lOOOr/min離心20min ;PBS重懸細胞，加入PI和RNaseA至終濃度為50 μ g/ mL，37°C水浴30min且避光。上機測試，記錄激發波長488nm處的紅色熒光。每個樣本利 用亞二倍峰即亞Gl期（SubGl)法分析凋亡細胞，測定細胞的凋亡率，數據處理采用Cell Quest軟件分析檢測結果。Annexin V-FITC/PI雙標記流式細胞術可以將實驗樣本中正常、 壞死和凋亡細胞等分開，細胞分為四個區：左上象限Annexin V-FITC-PI+，代表的是機械損 傷細胞；左下象限Annexin V-FITC-/PI-，代表的是正常細胞；右上象限Annexin V-FITC+/ PI+為晚期凋亡；右下象限Annexin V-FITC+/PI-，代表的是早期凋亡細胞。圖18?21為 PRO對PC-3細胞凋亡率的影響，圖22?25為PRO對DU-145細胞凋亡率的影響，由圖18? 25所示隨著藥物濃度的增加，早期凋亡率和晚期凋亡率逐漸上升，經統計加藥組與對照組 相比，差異有統計學意義（P〈〇. 05)。
[0083] 如圖26?33所示RPO作用于PC-3、DU-145細胞后，在細胞周期G0/G1期峰前 出現SubGl期峰(凋亡峰)，記錄SubGl峰細胞凋亡百分率即為凋亡率。經寡肽作用后，GO/ Gl期細胞變化不大，S期減少，G2/M期細胞增多，加藥組與對照組之間比較，有統計學意義 (P〈0. 01)。其中流式細胞術PI單染檢測PC-3細胞周期發現，對照組中SubGl峰細胞凋亡 百分率為0. 69%，如圖28所示；lOmg/mL組SubGl峰細胞凋亡百分率為4. 23%，如圖29所 示；30mg/mL組SubGl峰細胞凋亡百分率為5. 63%，如圖30所示。流式細胞術PI單染檢測 DU-145細胞周期發現，.對照組中SubGl峰細胞凋亡百分率為0. 66%，如圖31所示；IOmg/ mL組SubGl峰細胞凋亡百分率為3. 67%，如圖32所示；30mg/mL組SubGl峰細胞凋亡百分 率為5. 74%，如圖33所示。
[0084] 綜上，由實施例3可知由胰蛋白酶酶解獲得的菲律賓蛤仔寡肽： Asp-Trp-Pro-Hi s，
[0085] 在體外能抑制前列腺癌PC-3和DU-145細胞生長，誘導凋亡，改變細胞周期，使S 期細胞減少，G2/M期細胞增加，細胞停滯于G2/M期。
[0086] 除特別說明外，本發明的實踐將使用生物技術、有機化學、無機化學等的常規技 術，顯然除在上述說明和實施例中所特別描述之外，還可以通過其他方式實現本發明，其他 在本發明范圍內的技術方案與改進將對本發明所屬領域的技術人員而言是顯而易見的，根 據本發明的教導，許多改變和變化是可行的，因此都在本發明的范圍之內。
[0087] 表1不同蛋白酶的最適酶解溫度和pH

【權利要求】
1. 一種菲律賓蛤仔寡肽的制備方法，其特征在于包括以下步驟： ① 將菲律賓蛤仔洗凈，取肉后加超純水攪拌，然后去雜質勻漿，制得勻漿樣品； ② 取適量的所述勻漿樣品，加入適量體積的超純水，此時原料與超純水的比值為 1:1?1:4,加入蛋白酶在水浴箱中進行酶解反應，其中加酶量為300ug?1500ug，酶解反 應的pH值為8?9,酶解時間為4h?12h，酶解溫度為40°C?60°C ; ③ 酶解反應結束后滅活、離心、取上清液備用； ④ 將所述上清液加入超濾膜中進行超濾，收集分子量小于3KDa的酶解物質進行冷凍 干燥備用； ⑤ 利用DEAE S印haroseFF陰離子交換，采用磷酸緩沖液和NaCl溶液對所得酶解液進 行階段洗脫，在280nm波長處收集最高肽峰冷凍干燥后貯存備用； ⑥ 將DEAE S印haroseFF陰離子交換收集的最高肽峰利用反相高效液相色譜法進行進 一步純化，在220nm波長處出現唯一峰，收集該峰，冷凍干燥制得所述菲律賓蛤仔寡肽。
2. 根據權利要求1所述的菲律賓蛤仔寡肽的制備方法，其特征在于：所述步驟②中原 料與超純水的比值為1:2。
3. 根據權利要求1所述的菲律賓蛤仔寡肽的制備方法，其特征在于：所述步驟②中所 述蛋白酶為胰蛋白酶，所述加酶量為1200ug，酶解pH值為8. 0,酶解時間為8h，酶解溫度為 50。。。
4. 根據權利要求1所述的菲律賓蛤仔寡肽的制備方法，其特征在于：所述步驟③中為 沸水浴中滅活15min，4°C下10000r/min離心15min。
5. 根據權利要求1所述的菲律賓蛤仔寡肽的制備方法，其特征在于：所述步驟⑤中 NaCl 溶液的濃度為 0· lmol/L、0. 3mol/L、0. 5mol/L 三種。
6. 根據權利要求1所述的菲律賓蛤仔寡肽的制備方法，其特征在于：所述步驟⑥中 色譜柱為C18反相柱，填料為0DS，流動相為乙腈與水，且乙腈與水的比例為15 :85,流速為 0.81111.1^11-1，上樣體積為2〇111，檢測波長為22〇11111，洗脫條件為15%乙腈，2〇1^11。
7. -種由權利要求1?7任一權利要求所述的菲律賓蛤仔寡肽的制備方法所得的菲律 賓蛤仔寡肽，其特征在于：所述菲律賓蛤仔寡肽的氨基酸序列為Asp-Trp-Pro-His。
8. -種如權利要求7所述菲律賓蛤仔寡肽的應用，其特征在于：所述菲律賓蛤仔寡肽 在抗前列腺癌中的應用。
【文檔編號】C12P21/06GK104212861SQ201310207965
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2013年5月29日 優先權日:2013年5月29日
【發明者】楊最素, 徐律, 丁國芳, 孫瑜, 黃芳芳, 郁迪, 李連軍 申請人:浙江海洋學院