一種菲律賓蛤仔酶解物在抗肺癌中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種菲律賓蛤仔酶解物在抗肺癌中的應用，本發明中選取胰蛋白酶酶解菲律賓蛤仔肉，經超濾得到3KDa以下的酶解物，采用MTT法、HE染色和AO/EB染色等方法檢測該酶解物對人肺癌細胞H1299細胞活性的影響，結果顯示3KDa以下的菲律賓蛤仔酶解物作用H1299細胞后能明顯抑制H1299細胞的增殖，并使細胞出現凋亡的形態學改變。與現有技術相比，本發明中的菲律賓蛤仔酶解物抗肺癌效果明顯，且酶解原料來源廣泛，制備過程操作簡單、效率高、安全性高。
【專利說明】
一種菲律賓蛤仔酶解物在抗肺癌中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物醫藥領域，尤其涉及一種菲律賓蛤仔酶解物在抗肺癌中的應用。
【背景技術】
[0002]菲律賓蛤仔(Ruditapes philippinarum)屬軟體動物門雙殼綱簾蛤目簾蛤科,一種廣溫性的小型雙殼貝類，南方俗稱花蛤，與牡蠣、縊蟶、蚶類并列為我國四大養殖貝類，是近岸灘涂和淺海的主要貝類之一，其味道鮮美，營養豐富，蛋白含量高。
[0003]癌癥，亦稱惡性腫瘤，是一種通過控制細胞生長增殖機制失常而引起的疾病。肺癌是當今人類的高發癌，居癌癥之首，非小細胞肺癌的患病率約占肺癌總發病數的80%，約2/3的患者在確診時已失去手術機會，放、化療在非小細胞肺癌治療中占有重要地位，但放、化療的毒副作用嚴重影響著治療效果和生活質量。近年來對菲律賓蛤仔提取物的抗腫瘤研究有了很大的進展，如范秀萍等(食品工業科技，2003)利用菲律賓蛤仔糖胺聚糖的粗制品(CRG)作用于體外培養的HL-60細胞，發現CRG在1.0mg/ml濃度下對HL-60細胞具有顯著抑制作用，在24h、48h、72h抑瘤率分別可達59.8%,67.7%和96.2%。張莉等(海洋與湖沼，2007)利用菲律賓蛤仔肉提取兩種蛋白聚糖PGl和PG2，其中PGl在200ug/ml濃度時對人肝癌細胞SMMC7721的生長抑制率達到73.30%，且不影響人正常肝細胞HL-7002的生長與功能。從海洋生物中提取抗腫瘤活性物質是科學界研究的熱點，其中抗癌肽尤為引人注目。利用蛋白酶酶解獲得生物活性肽是一種安全性高，產率高的方法，近年來研究發現菲律賓蛤仔酶解物具有多種生物活性，如楊永芳等(中華中醫藥學刊，2011)利用菲律賓蛤仔酶解寡肽對羥自由基的清除作用來考查各酶解物的抗氧化活性，結果發現在酶解物濃度為2.5mg/ml時的羥自由基清除率、DPPH自由基清除率和還原力均高于Vit C。目前，關于菲律賓蛤仔酶解物的抗癌性，尤其在抗肺癌中的應用目前還未見報道，因此具有進一步研究的空間。
【發明內容】
[0004]本發明所要解決的技術問題是針對現有技術而提供一種菲律賓酶解物的新用途，即在抗肺癌中的應用。
[0005]本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為:一種菲律賓蛤仔酶解物在抗肺癌中的應用。
[0006]肺癌中非小細胞肺癌占肺癌總數的80%，是最常見的肺癌，作為優選，上述方案中的肺癌指非小細胞肺癌。
[0007]上述方案中菲律賓蛤仔酶解物的分子量小于3KDa，其通過以下方法制得:
[0008]I)新鮮的菲律賓蛤仔洗凈后，取肉、去雜質，使用組織搗碎機搗碎勻漿；
[0009]2)在步驟I)中所得勻漿液中加入1200u/g胰蛋白酶，酶解24h，酶解溫度為37°C，酶解pH為8.0 ;
[0010]3)酶解反應結束后，90°C滅酶15min,然后在4°C下8500r/min離心15min,取上清；
[0011]4)采用截取分子量為3KDa的超濾膜，20°C超濾Ilh獲得酶解液；
[0012]5)將步驟4)所得的酶解液旋轉蒸發后，冷凍干燥保存，實驗時用F12培養液配成不同的濃度。
[0013]為更好地理解本發明的實質，本發明中菲律賓蛤仔酶解物作用于體外培養的人肺癌Hl 299細胞株，將酶解物作用后的Hl 299細胞分別進行MTT檢測、HE染色和Α0/ΕΒ染色，其中，MTT法又稱MTT比色法，是一種檢測細胞存活和生長的方法；HE染色，即蘇木精-伊紅染色法，是一種普通光學顯微鏡觀察與鑒別細胞凋亡與細胞壞死的染色方法；Α0/ΕΒ染色，即吖啶橙/溴化乙錠雙熒光染色，是一種檢測細胞培養中凋亡細胞形態以及數量的方法。結果顯示該菲律賓蛤仔酶解物能顯著抑制H1299細胞生長，且隨酶解物反應液濃度增加和作用時間的延長，抑制率明顯上升；倒置顯微鏡和HE染色對照組的H1299細胞呈上皮樣生長，形態基本一致，伸展性好，經酶解物作用后，細胞形態發生改變，胞質內出現空泡，核染色質邊聚，核固縮等凋亡的形態學改變，因此菲律賓蛤仔酶解物能顯著抑制H1299細胞的增殖并能誘導H1299細胞凋亡。
[0014]與現有技術相比，本發明的優點在于:
[0015]1、本發明中菲律賓蛤仔酶解物抑制H1299細胞增殖，誘導其凋亡效果顯著。本發明中30mg/ml酶解物作用H1299細胞48h后，培養容器中形態正常的H1299細胞明顯減少，漂浮細胞或漂浮物明顯增加，細胞出現增殖抑制并死亡的現象。
[0016]2、本發明中酶解物原料來源廣泛，制備過程操作簡單、效率高、安全性高。菲律賓蛤仔是一種在我國海域中在近岸灘涂和淺海中常見的貝類海產品，在沿海的菜市場、超市等處十分常見，同時利用胰蛋白酶的特異性和高效性制備酶解物，使得酶解物的制備簡單、高效、安全。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0017]圖1為本發明實施例2中MTT檢測結果示意圖；
[0018]圖2為本發明實施例3中對照組的倒置顯微鏡下H1299細胞形態示意圖；
[0019]圖3為本發明實施例3中10mg/ml組的倒置顯微鏡下H1299細胞形態示意圖；
[0020]圖4為本發明實施例3中20mg/ml組的倒置顯微鏡下H1299細胞形態示意圖；
[0021]圖5為本發明實施例3中30mg/ml組的倒置顯微鏡下H1299細胞形態示意圖；
[0022]圖6為本發明實施例3中對照組的HE染色后H1299細胞形態示意圖；
[0023]圖7為本發明實施例3中10mg/ml組的HE染色后H1299細胞形態示意圖；
[0024]圖8為本發明實施例3中20mg/ml組的HE染色后H1299細胞形態示意圖；
[0025]圖9為本發明實施例3中30mg/ml組的HE染色后H1299細胞形態示意圖；
[0026]圖10本發明實施例4中對照組的A0/EB染色后H1299細胞形態示意圖；
[0027]圖11本發明實施例4中10mg/ml組的A0/EB染色后H1299細胞形態示意圖；
[0028]圖12本發明實施例4中20mg/ml組的A0/EB染色后H1299細胞形態示意圖；
[0029]圖13本發明實施例4中30mg/ml組的A0/EB染色后H1299細胞形態示意圖。
【具體實施方式】
[0030]以下結合附圖實施例對本發明作進一步詳細描述。
[0031]實施例1:菲律賓蛤仔酶解物的制備
[0032]新鮮的菲律賓蛤仔洗凈后，取肉去雜質，用組織搗碎機將處理潔凈的蛤仔肉搗碎勻漿。在勻漿液中加入3倍體積的蒸餾水，加入1200u/g胰蛋白酶進行酶解，于37°C、pH值為8.0的酶解環境反應24h，可使用氫氧化鈉和氯化氫對反應液的pH值進行調整。酶解反應結束后，90°C滅酶15min，使得未反應的胰蛋白酶失活，然后將反應液離心15min，取上清液，離心條件為:4°C，8500r/min。將所得上清液在20°C下超濾llh，超濾時使用截取分子量為3KDa的超濾膜。超濾結束后，將超濾液旋轉蒸發，冷凍干燥后保存，將制得的酶解物用F12培養液配制成不同的濃度進行后續實驗。
[0033]實施例2:細胞增殖抑制實驗
[0034]采用MTT法來檢測菲律賓蛤仔酶解物對H1299細胞增殖的影響，具體實驗方法如下:
[0035]I )H1299細胞的培養:將H1299單細胞懸液接種于含F12培養液的培養瓶中，置于37°C、5%C02的培養箱中進行培養，細胞呈單層貼壁生長，當細胞長滿80%時，選取生長狀態良好的細胞采用胰蛋白酶消化傳代，以I X 1VmL細胞懸液接種于96孔板，每孔200mL。
[0036]2) MTT檢測:上述細胞懸液培養24h后棄上清，進行MTT檢測，實驗設置對照組和加藥組，加藥組分為10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml5個組，每個劑量分設3個復孔，分別培養24h、48h和72h后棄培養液，在每個孔中加入lmg/ml MTT200mL,4h后吸棄MTT，加150 μ L的DMS0，充分混合。最后在酶標儀490nm處測吸光度A值，計算細胞增殖抑制率(IR)，IR=[(對照組A值-加藥組A值)/ (對照組A值-調零孔A值]X 100%,重復實驗3次。
[0037]3)實驗結果:如圖1所示，酶解物作用于H1299細胞后，細胞呈現出明顯的生長抑制現象，隨酶解物濃度的增加(1mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml)和作用時間(24h、48h、72h)的延長，增殖抑制率明顯上升，與對照組相比，差異具有統計學意義(ρ〈0.05)。
[0038]實施例3:ΗΕ染色
[0039]1)ΗΕ染色:6孔培養板內放入經泡酸、高壓滅菌過的蓋玻片，將實施例2步驟I)中培養的Η1299單細胞懸液濃度調至I X 105/mL后接種于培養板內的蓋玻片上，每孔加入2ml單細胞懸液，24h后換液。實驗中設對照組和加藥組，加藥組分為10mg/ml、20mg/ml、30mg/ml，分別培養48h后在倒置顯微鏡(X200)下觀察并拍照。實驗結束后取出培養板中的蓋玻片，用PBS充分清洗后用95%乙醇固定25分鐘，最后進行常規HE染色，在光學顯微鏡(X400)下觀察，用數碼相機拍照。
[0040]2)實驗結果:倒置顯微鏡下形態觀察結果如圖2?圖5所示:如圖2所示對照組中H1299細胞形態為上皮樣，飽滿，伸展好，細胞分界清楚；如圖3所示10mg/ml酶解物作用于H1299細胞后，培養液中出現圓形的細胞，漂浮于培養液中，部分細胞伸出突起相互融合；如圖4所示20mg/ml作用后的H1299細胞，培養液中圓形和漂浮細胞增多；如圖5所示30mg/ml作用后，形態正常的H1299細胞明顯減少，漂浮細胞或漂浮物更多，細胞出現增殖抑制并死亡的現象。
[0041]HE染色結果如圖6?圖9所示:如圖6所示對照組中的H1299細胞邊界清晰，有明顯的分裂相，飽滿，核仁數目多；如圖7所示10mg/ml組中的H1299細胞胞質內出現較多的空泡；如圖8所示20mg/ml組中的細胞形態不規則，空泡增多，部分細胞的核固縮；如圖9所示30mg/ml組中的細胞形態不規則，部分細胞形態變小呈圓形，部分細胞體積增大出現巨核細胞，大部分細胞的核仁明顯減少，細胞核發生固縮，染色質發生邊聚等凋亡現象。
[0042]實施例4:Α0/ΕΒ染色
[0043]I) Α0/ΕΒ染色:細胞接種的方法同HE染色，對照組和加藥組的細胞培養24h后取出培養板中的蓋玻片，用PBS洗3次，95%乙醇固定30min。取終濃度為20mg/L的Α0/ΕΒ混合液滴加于載玻片上，將有細胞一面的蓋玻片朝下，突光顯微鏡(X 200)觀察拍照。
[0044]2)實驗結果:如圖10所示對照組中H1299細胞形態基本相同，核染色質亮綠色并呈正常形態；如圖11所示10mg/ml組中的早期凋亡細胞較多，核染色質亮綠色固縮成團塊狀位于細胞一側，或呈新月形等異常變化；如圖12所示20mg/ml組的晚期凋亡細胞較多，細胞變圓，核仁數目減少，染色質固縮，呈桔黃色；如圖13所示30mg/ml組中晚期凋亡細胞增多，細胞形態多樣，染色質固縮明顯，顏色加深呈桔紅色，并可見部分胞核形成碎片，或形成半月形，細胞膜向外突出形成凋亡小體，同時非凋亡的死亡細胞增多，核染色質著桔紅色但結構正常。
[0045]注:實施例1中使用的菲律賓蛤仔購與舟山市某菜市場；
[0046]實施例2?4中使用的人肺癌H1299細胞株購自中國科學院上海細胞所，由 申請人:所在實驗室傳代保存。
[0047]各實施例中所用試劑和主要儀器信息如下:
[0048]胰蛋白酶(SIGMA公司);F12培養基(GIBCO公司)加10%的胎牛血清(杭州四季青生物工程公司)，內含雙抗；MTT (SIGMA公司)；AO/EB (杭州昊天生物技術有限公司)；其余試劑均為分析純。
[0049]高速組織攪拌機(上海比朗公司)、CF16RXII高速冷凍離心機(日立HITACHI公司)、UV1600PC紫外分光光度計(上海美譜達有限公司)；自動部分收集器(BSZ-40-1XD)和蛋白檢測儀(HD-21-88)(上海琪特分析儀器有限公司);MSC300超濾杯(超濾膜:3Kda，上海摩速科學器材有限公司);Forma3111C02培養箱(美國Thermo公司);倒置相差顯微鏡和突光顯微鏡(OLYMPUS公司)；超凈臺(ZHJM-C12090，上海智城分析儀器制造有限公司)；酶標儀(美國B1-RAD );顯微攝像 CCD (promicroscan5898，USA)。
【權利要求】
1.一種菲律賓蛤仔酶解物在抗肺癌中的應用。
2.根據權利要求1所述的菲律賓蛤仔酶解物在抗肺癌中的應用，其特征在于:所述肺癌為非小細胞肺癌。
3.根據權利要求1或2所述的菲律賓蛤仔酶解物在抗肺癌中的應用，其特征在于:所述的酶解物的分子量小于3KDa。
4.根據權利要求3所述的菲律賓蛤仔酶解物在抗肺癌中的應用，其特征在于:所述酶解物通過以下方法制得: 1)新鮮的菲律賓蛤仔洗凈后，取肉、去雜質，使用組織搗碎機搗碎勻漿； 2)在步驟1)中所得勻漿液中加入1200u/g胰蛋白酶，酶解24h，酶解溫度為37°C，酶解pH 為 8.0 ; 3)酶解反應結束后,90°C滅酶15min,然后在4°C下8500r/min離心15min,取上清； 4)采用截取分子量為3KDa的超濾膜，20°C超濾llh獲得酶解液； 5)將步驟4)所得的酶解液旋轉蒸發后，冷凍干燥保存。
【文檔編號】A61P35/00GK104337837SQ201310312796
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2013年7月23日 優先權日:2013年7月23日
【發明者】楊最素, 丁國芳, 孫瑜, 徐律, 黃芳芳, 郁迪, 閆海強 申請人:浙江海洋學院