制備表面活性肽的方法
【專利摘要】基于SP-C肽和麥芽糖結合蛋白的融合蛋白的異源表達制備表面活性蛋白C肽(SP-C肽)的方法；該方法中使用的基因構建體，載體和宿主細胞。
【專利說明】制備表面活性肽的方法
[0001] 本發明提供基于重組DNA技術制備表面活性物質-蛋白C肽（SP-C肽）的方法。 本發明還提供用于該方法的基因構建體、載體和宿主細胞。
[0002] 發明背景
[0003] 肺表面活性物質減少肺泡內側的氣液交界面上的表面張力，防止肺在呼氣結束時 塌縮。
[0004] 表面活性物質缺乏是早產兒的一種病癥，引起呼吸窘迫綜合征（RDS)，可以 用從動物肺提取的天然表面活性物質對這種病癥進行有效治療（參見Fujiwara，T. 和 Robertson Β· (1992)于：Robertson, B·，van Golde，L_ M. G.和 Batenburg，B. (編著）Pulmonary Surfactant:From Molecular Biology to Clinical Practice Amsterdam, Elsevier, pp. 561-592) 〇
[0005] 這些表面活性物質制劑的主要成分是磷脂如1，2-二棕櫚酰-Sn-甘油-3-磷酸膽 堿（DPPC)、磷脂酰甘油（PG)和疏水表面活性蛋白B和C(SP_B和SP-C)。
[0006] 蛋白SP-B和SP-C僅構成表面活性物質質量的大約1-2%，但是與純的脂 類制劑相比，仍然能極大地改善表面活性（參見Curstedt, T. et al. (1987)Eur· J. Biochem. 168, 255-262 ;)。
[0007] SP-C是脂蛋白，由35個氨基酸殘基組成，在殘基9-34之間具有a -螺旋域（參見 Johansson，J.et al. (1994)Biochemistry 33, 6015-6023)。
[0008] 該螺旋主要由纈氨酰-殘基組成，鑲嵌在脂雙層中，其方向與脂酰鏈平行（參見 Vandenbussche, et al. (1992) Eur. J. Biochem. 203, 201-209) 〇
[0009] 兩個棕櫚酰基團與該肽的N-末端部分的位置5和6的半胱氨酸殘基共價連接（參 見 Curstedt, T· et al. (1990) Proc. Natl· Acad· Sci. U. S. A. 87, 2985-2989)。
[0010] 位置11和12上的兩個保守的帶正電荷殘基，可能與脂膜的帶負電荷的頭部基團 相互作用，從而增加其剛性。
[0011] 趨向C-末端，脂-肽相互作用的剛性減少，因為它僅含有小的疏水性殘基，使得這 部分在磷脂雙層中可能更具有柔性。
[0012] 由于從動物組織中獲得的表面活性物質制劑可能表現出某些缺點，如它們獲得的 量有限以及它們可能含有致病原以及誘導免疫反應，已經嘗試創造通常由合成脂類和合成 的SP-C和/或SP-B蛋白類似物組成的人工表面活性物質。
[0013] 但是，對于合成的SP-C蛋白而言，先前的工作已證明它可能不能像天然肽那樣 折疊成最佳表面活性所需要的 α-螺旋構象（參見Johansson, J.et al. (1995)Biochem. J. 307, 535-541)，因此可能不能與表面活性脂類正確地相互作用。
[0014] 為了避免這個問題，已進行了幾種嘗試來改變序列，例如將天然SP-C中所有的 螺旋Val殘基替換成Leu，Leu強烈地有助于形成α -螺旋構象。相應的跨膜類似物， SP-C(Leu)當與適當的磷脂混合物組合時，在氣-液交界面上表現出良好的延展。
[0015] W0 2008/044109公開了 SP-C蛋白的肽類似物，被稱為SP-C33(Leu)，其具有下述 的單字母氨基酸序列
[0016] IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALLLGL(SEQ ID N0:l)〇
[0017] 該肽可以通過合成方法來制備。傳統的合成方法在例如Schroeder et al·，'The peptides'，vol.l，Academic Press，1965 ;Bodanszky et al.，'Peptide synthesis'，Interscience Publisher, 1996 ;Baramy&Merrifield，'The peptides ;Analys is, Synthesis, Biology，，vol. 2, chapter 1，Academic Press, 1980 中描述。
[0018] 所述技術包括在固相中、溶液中進行肽合成，有機化學合成方法，或它們的任何組 合。
[0019] 通過傳統技術進行的合成肽如肽SP-C33(Leu)的產生受到它們的高疏水特性的 影響，從而限制了它們的水溶性。
[0020] 所述缺點通過本發明的方法被克服。
[0021] 定義
[0022] 術語"SP-C肽"指天然表面活性蛋白SP-C的結構類似物肽，包括具有與天然蛋白 相比，一個或多個氨基酸被取代和/或缺失的氨基酸序列的肽，只要所述肽在和脂類載體 的混合物中表現出類似的肺表面活性。
[0023] 發明描述
[0024] 本發明的目的是用于SP-C肽生物合成的重組方法，其克服了傳統技術的缺陷，并 能夠以令人滿意的產率獲得高純產物。本發明的方法基于融合蛋白的表達，其中SP-C肽通 過攜帶蛋白酶切割位點的接頭的插入，與麥芽糖結合蛋白（MBP)融合。
[0025] 在一個實施方案中，本發明提供含有編碼SP-C肽、MBP蛋白和攜帶蛋白酶切割位 點的位于SP-C肽和MBP蛋白之間的接頭肽的多核苷酸序列的表達盒，所述編碼多核苷酸序 列與適合于在原核細胞中表達的啟動子序列可操作連接。
[0026] 在一個實施方案中，SP-C肽是SP-C33(Leu) (SEQ ID N0:1)，編碼序列是SEQ ID N0:3。在另一個實施方案中，MBP確定為SEQ ID N0:2,其編碼序列是SEQ ID N0:4。與野 生型MBP(wt MBP)-即由大腸桿菌天然產生的-MBP相比，麥芽糖結合蛋白SEQ ID N0:2具 有使與直鏈淀粉的親和力提高以及使SPC肽更好地折疊的突變。提高的直鏈淀粉-親和力 對于由細菌細胞產生的融合蛋白的純化來說很重要，如下面所討論的。
[0027] MBP-和SP-C-編碼序列優選分別位于表達盒的N-和C-末端。發現這樣有利于融 合SP-C肽的正確折疊。
[0028] 在另一個實施方案中，接頭肽為10-50個、優選20-40個氨基酸長，并且含有被腸 激酶識別的蛋白水解位點。后者是特異性絲氨酸蛋白酶，在賴氨酸后的特定切割位點進行 切割。此外，接頭的編碼序列可以含有適合于基因構建體的克隆和處理的一個或多個內切 酶-限制性位點。在優選的實施方案中，接頭肽和其編碼序列分別被確定為SEQ ID N0:5 和6。
[0029] 根據本發明，可以使用任何適合于在原核細胞中調節異源蛋白表達的啟動子。優 選使用誘導型啟動子，特別是tac啟動子，其被異丙基β-D-1-硫代半麥芽糖苷（IPTG)激 活。
[0030] 表達盒可以進一步包括調節重組蛋白表達的組分，如轉錄增強子，終止子、起始子 和其它基因控制元件或給重組蛋白賦予結合親和力或抗原性的元件。
[0031] 在另一個實施方案中，本發明涉及含有上述表達盒的表達載體。優選載體是質粒， 更優選是基于pBR32的質粒，其可以另外含有選擇標記例如抗生素抗性編碼序列，將重組 蛋白導向分泌途徑的分泌信號和允許插入異源序列的合適的限制性位點。
[0032] 在又一個實施方案中，本發明提供SP-C肽的制備方法，其包括下述步驟：
[0033] i)提供攜帶表達盒的載體，其中所述表達盒含有編碼融合蛋白的多核苷酸序列， 所述融合蛋白由SP-C肽、MBP和位于其間并攜帶蛋白酶切割位點的接頭肽組成，如上述所 定義的；
[0034] ii)將所述載體引入到原核細胞中，并在允許表達融合蛋白的條件下維持所述細 胞； 。
[0035] iii)純化融合蛋白；
[0036] iv)用適當的蛋白酶切割融合蛋白并分離SPC蛋白。
[0037] 細菌細胞特別是大腸桿菌細胞被方便地用于SPC肽的表達。特別優選含有通過表 型選擇從而耐受毒性蛋白的基因突變的大腸桿菌株。
[0038] 表達融合蛋白后，使細胞破裂并離心細胞裂解物以分離包含融合蛋白的細胞級 分。
[0039] 融合蛋白的純化優選使用MBP配體-結合樹脂通過親和層析的方式進行。優選地， 粗細胞提取物被加載到含有用直鏈淀粉衍生化的瓊脂糖樹脂的柱上，并用含有合適量麥芽 糖的緩沖液洗脫以從樹脂上移除融合蛋白。
[0040] 對融合蛋白的最后切割釋放SP-C肽，其隨后用傳統技術分離。優選使用腸激酶蛋 白酶切割融合蛋白的接頭區域，如果存在合適的蛋白酶切割位點的話。
[0041] 與類似的重組系統中測試的其它蛋白標簽不同，MBP證明用于表達和后續純化與 之融合的SP-C肽是特別有效的。
[0042] 實驗部分
[0043] MBP融合蛋白的克隆策略
[0044] SP-C33 (Leu)在細菌中以與麥芽糖結合蛋白（MBP)的融合蛋白的形式表達。表達 載體pMALc5e (New England Biolabs)編碼MBP并為編碼SpC33Leu的DNA片段的框內克 隆提供（5,）AvaI和（3'）BamHI切割位點。表達載體含有氨芐青霉素抗性基因并衍生自 PBR322。MBP和SpC33Leu通過肽接頭被連接在一起，所述肽接頭含有被腸激酶識別的蛋白 水解位點，所述腸激酶是一種在賴氨酸后特定切割位點（Asp-Asp-Asp-Asp-Lys丨）進行切 割的特異性絲氨酸蛋白酶。市售的MBP-接頭序列由前面加上甲硫氨酸并且最后4個氨基 酸被由pMAL-c5e多接頭編碼的21個殘基加上C-末端甘氨酸取代的來自大腸桿菌的麥芽 糖結合蛋白組成。
[0045] 原始的商業多接頭被改造以包含幾個新的內切酶限制性位點（SEQ ID N0:5和6)。
[0046] sp-C33(Leu)核苷酸序列在GeneArt?.基因合成服務提供的合適的穿梭載體 中被合成和克隆。由OeneArt?基因合成服務按照大腸桿菌密碼子使用頻率優化核 苷酸序列。密碼子優化僅僅改變核酸序列而不改變編碼的氨基酸序列。基因設計和優化 策略使用專有的 GeneOptimizer⑩軟件（wo-A-〇4/〇59556 和 wo-A-〇6/oi3i〇3) [Raab D_，Graf M.，Notka F·，Schbdl.T·和Wagner R."The GeneOptimizer Algorithm:using a sliding window approach to cope with the vast sequence space in multi-parameter DNA sequence optimization" Syst Synth Biol· 2010;4:215 - 225 ;Maertens B. ,Spriestersbach A. , von Groll U., Roth U.,Kubicek J. ,Gerrits M. , Graf M., Liss M.，Daubert D·，Wagner R.，和Schafer F."Gene optimization mechanisms:A multi-gene study reveals a high success rate of full-length human proteins expressed in Escherichia coli"Protein Science 2010;19:1312-1326]。優化參數包括密碼子使用， DNA基序如核糖體進入位點，GC含量和（反向）重復的避免。序列編碼用于后續亞克隆的 i) Aval-特異性5'，ii)BamHI-特異性3'末端，iii) SpC33Leu序列之前的腸激酶切割位點， 并提供TAA終止密碼子以終止核糖體翻譯。Aval和BamHI是限制性內切酶。Aval識別雙 鏈核苷酸序列CYCGRG(其中Y = T/C，且R = A/G)并在C-1之后進行切割。BamHI識別序 列GGATCC，并在G-1之后進行切割。兩種酶都產生粘性末端。優化的基因然后由合成寡核 苷酸組裝（從頭基因合成），并使用Sfil和Sfil克隆位點克隆到pMA-T載體中。最終的構建 體通過測序驗證。
[0047] 表達SpCMLeu的質粒的制備、DNA擴增、質粒分離、純化和在電轉化感受態大腸 桿菌細胞中的轉化，使用通常在 Sambrook and Russel, Molecular Cloning:A Laboratory Manual, CSHL Press 2001中所討論的重組DNA技術的傳統方法進行。
[0048] 對于亞克隆，用Aval和BamHI消化SpC33Leu序列以產生突出的單鏈末端。在載體 的Aval/BamHI消化、去磷酸化、通過瓊脂糖凝膠電泳純化所需載體DNA片段、以及SpC33Leu 片段和載體片段通過粘性末端雜交之后，發生向載體中的整合。隨后通過使用T4DNA連接 酶（New England Biolab)連接，將兩個片段共價連接，然后轉化到細菌宿主細胞中。含質 粒細胞的選擇通過接種到含氨芐青霉素的LB瓊脂平板上來進行。從獲得的Amp-抗性菌落 中分離質粒DNA并用合適的限制性酶分析。選擇具有所期望的DNA限制性片段模式的菌 落。由BMR Genomics (Padua大學）對質粒序列進行的完整測序證實SpC33Leu序列的正確 插入。
[0049] 生產菌株
[0050] 用于表達SP-C33(leu)的生產菌株大腸桿菌C41(DE3)和C43(DE3),衍生自大腸 桿菌BL21(DE3)并可以從Lucigen購買。這些菌株據報道能有效過表達病毒、真細菌、古細 菌、植物、酵母、果蠅或哺乳動物來源的毒性和膜蛋白，因為這些菌株具有至少一個未表征 的（uncharacterized)突變，阻止了與多個重組毒性蛋白表達相關的細胞死亡。
[0051] 蛋白表達
[0052] 重組質粒允許在tac啟動子的控制下表達融合蛋白MBP-SpC33Leu。在用異丙基 β-D-l-硫代半乳糖苷（IPTG)誘導后，重組融合蛋白在宿主細胞中以可溶形式產生。
[0053] 用接種在LB平板上的甘油培養物接種1ml預培養物或起子培養物 (Luria-Bertani培養基：10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母提取物，和10g/l NaCl，在存在lOraM葡 萄糖的條件下），并在強氨芐青霉素選擇壓力下在37°C溫育，搖動過夜。使用該培養物接種 5mL培養物。使細菌繼續生長，直至其達到600nm處約0. 6的光密度。然后通過加入IPTG 誘導培養物。誘導之后繼續生長4-5個小時，直至在4°C離心收獲細胞。將濕生物質重懸于 20福麗411〇) 3緩沖液，？117.5中。在冰上通過超聲使細胞懸液破裂。細菌裂解后，在12% Laemmli還原的SDS-PAGE凝膠上檢查表達混合物，以評價總蛋白含量。將新條帶做為融合 蛋白的鑒別使用兔抗-MBP抗血清（NEB)進行免疫印跡來證實。在半干裝置中在硝酸纖維素 膜上進行印跡，在10V進行40分鐘。含有3%脫脂牛奶的pH8· OTris緩沖液被用作封閉緩 沖液。在封閉緩沖液中按1: 1〇, 〇〇〇稀釋初級抗體并在室溫溫育1小時。抗-兔1過氧 化物酶綴合物被用作二級抗體與辣根過氧化物酶底物，3,3<，5,5< -四甲基聯苯胺（TMB) 結合，以進行檢測（所有免疫印跡試劑購自Sigma Aldrich)。誘導之后，通過SDS-PAGE和 免疫印跡檢測到具有融合蛋白的正確分子量的新的主要條帶，所述融合蛋白相應于MBP和 SpC33Leu片段的組合。
[0054] 融合蛋白的純化
[0055] 使用MBP親和層析幫助融合蛋白從表達混合物分離。粗細胞提取物被加載到含有 用直鏈淀粉衍生化的瓊脂糖樹脂的柱（PMAL蛋白融合和表達系統，New England Biolabs) 上。融合蛋白由于MBP與直鏈淀粉的親和力而與柱結合，并用含有10mM麥芽糖的20mM NH 4HC03緩沖液，pH 7. 5洗脫。含有感興趣的融合蛋白的洗脫液在12% Laemmli還原的 SDS-PAGE凝膠上進行分析，并用抗-MBP血清通過免疫印跡進行鑒別。
[0056] MBP-SpC33Leu融合蛋白的產量是每升培養物50-80mg。
[0057] 后續的用腸激酶分離MBP和SP-C33(Leu)的切割發生在MBP-SpC33Leu的Lys-393 和Ile-394之間。Ile-394相應于SP-C33(Leu)肽的第一個氨基酸。
[0058] 融合蛋白的切割
[0059] 為了在Lys-393連接氨基酸處進行融合蛋白的切割，向溶液中加入每mg融合蛋白 0. 02單位的腸激酶。向切割溶液中加入1% (v/w)Triton X-100以保持被切割的消化疏水 性產物SpC33Leu的溶解性。溶液在室溫溫和攪拌16小時。
[0060] 蛋白產物SpC33Leu的質譜表征
[0061] 應用兩種不同的程序以表征MBP-SpC33Leu融合蛋白的消化產物。MALDI-MS高分 辨率方法的目的在于確定產物的單一同位素分子量并評價正確序列的表達盒腸激酶對融 合蛋白的正確切割。選擇HPLC-ESMS作為初步評價重組產物相對于參考標準的雜質分布， 以及評價批次的重復性的方法。
[0062] 附圖描述
[0063] 圖1. MALDI光譜分析揭示SP_C33(Leu)存在于消化后的溶液中。計算的單一同 位素質量為3594. 52Da，其相對于由氨基酸序列計算得到的理論單一同位素質量差異在 22ppm以內。
[0064] 圖2· MBP-接頭（MW平均?43206Da)的存在通過低分辨率MALDI-MS方法測定。沒 有觀察到可檢測量的MBP-接頭-SP-C33 (Leu)，表明所應用的蛋白水解反應條件導致定量 過程。
[0065]圖3.對雜質的初步評價也通過MALDI-MS和HPLC-ESIMS在兩個獨立獲得的批次 (標記為批次1和批次2)之間進行。它們顯示出相當的純度水平。通過LC-MS進行的產 品SP-C33 (Leu)的定量是相對于SP-C33 (Leu)參考標準進行的。獨立獲得的兩個批次被測 定，并且蛋白產量被測定（表）。
[0066] 表
[0067]
【權利要求】
1. 一種表達盒，其包含編碼SP-C肽、MBP蛋白和位于其間并攜帶蛋白酶切割位點的接 頭肽的多核苷酸序列，所述編碼多核苷酸序列與適合于在原核細胞中表達的啟動子序列可 操作連接。
2. 根據權利要求1的表達盒，其中所述SP-C肽是SEQ ID N0:1所示的SP-C33(Leu)。
3. 根據權利要求1-2的表達盒，其中所述MBP蛋白如SEQ ID NO: 2所示。
4. 根據權利要求1-2的表達盒，其中所述編碼SPC肽的多核苷酸序列是SEQ ID NO: 3。
5. 根據權利要求1和3的表達盒，其中所述編碼MBP的多核苷酸序列是SEQ ID NO: 4。
6. 根據權利要求1-5的表達盒，其中所述攜帶蛋白酶切割位點的接頭肽及其編碼序列 分別如SEQ ID N0:5和6所示。
7. 根據權利要求1-6的表達盒，其中所述編碼MBP的序列和編碼SP-C的序列分別位于 N_和C_末端。
8. 根據權利要求1的表達盒，其中所述啟動子是誘導型tac啟動子。
9. 含有根據權利要求1-8的表達盒的表達載體。
10. 根據權利要求9的表達載體，其是質粒。
11. 根據權利要求10的表達載體，其是基于PBR32的質粒。
12. -種制備SPC肽的方法，其包括以下步驟： i) 提供攜帶編碼融合蛋白的表達盒的載體，所述表達盒如權利要求1-8所定義； ii) 將所述載體導入到原核細胞中，并在允許表達所述融合蛋白的條件下維持所述細 胞； iii) 純化所述融合蛋白； iv) 用適當的蛋白酶切割所述融合蛋白并分離所述SP-C肽。
13. 根據權利要求12的方法，其中所述原核細胞是大腸桿菌細菌細胞。
14. 根據權利要求12-13的方法，其中所述融合蛋白的純化使用MBP配體-連接樹脂通 過親和層析進行。
15. 根據權利要求12-14的方法，其中腸激酶蛋白酶被用于所述融合蛋白的切割。
【文檔編號】C07K14/785GK104245727SQ201380020491
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2013年4月16日 優先權日:2012年4月17日
【發明者】A·莫扎拉利, S·拉博尼, B·皮奧塞利 申請人:奇斯藥制品公司